MANUAL DE INSEMINACIN ARTIFICIAL EQUINA

TECNOLOGA EN REPRODUCCIN ANIMAL

EVALUACIN Y MANIPULACIN DE EMBRIONES

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Inseminacin artificial en caballos

Ventajas de la IA Reduce el riesgo de transmisin de enfermedades entre los reproductores Disminuye la incidencia de infeccin uterina, una de las principales causas de infertilidad en la yegua Permite la cubricin de yeguas en las que la monta natural resulta arriesgada o no quedan preadas Mayor seguridad para los animales y operarios Facilita el intercambio gentico entre criadores en todo el mundo Fases de la IA 1. Seleccin del semental 2. Coleccin del semen 3. Evaluacin del semen 4. Conservacin del semen 5. Aplicacin del semen

1. Seleccin del semental. El historial de los sementales es importante, y debe incluir la informacin Referente a la libido, capacidad de acoplamiento, fertilidad (si el semental ha sido utilizado en el pasado), enfermedades o lesiones, y cualquier medicacin recibida. Se debe realizar un examen fsico general, observando si hay sntomas de cojeras (particularmente de los cuartos traseros) y posibles enfermedades hereditarias que pueden afectar a la capacidad reproductiva del semental. Los rganos genitales deben evaluarse a fondo. El pene y el prepucio deben estar libres de lesiones. Los testculos y el epiddimo deben tener el tamao, la forma y la consistencia adecuada. Los testculos deben estar libres dentro del escroto. Los rganos genitales internos son evaluados por palpacin y ultrasonografa rectal. El examen de los sementales debe consistir en: 1. Historia y examen fsico 2. Cultivo de muestra de la uretra antes y despus de la eyaculacin 3. La coleccin y la evaluacin de dos o ms eyaculados para la evaluacin del semen (nmero de espermatozoides, motilidad, y morfoanomalias). 2. Coleccin del semen. Para la coleccin del semen, se puede utilizar una yegua en celo o un maniqu (Foto 1: Maniqu para sementales, modelo Hannover. Ref 11200/0000). Es importante limpiar el maniqu despus de cada coleccin, para evitar cualquier tipo de contaminacin.

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Foto 1. Maniqu para sementales, modelo Hannover. Ref 11200/0000 Se debe provocar la ereccin, presentando al semental una yegua en celo. Si el pene esta cubierto de secreciones, se puede utilizar de vez en cuando un jabn suave. El semen se recoge con una vagina artificial (Foto 2: Sistema Hannover Ref 11220/0145 y accesorios; Foto 3: Sistema Colorado Ref 11230/0000 y accesorios; Foto 4: Sistema Missouri Ref. 11245/0000 y accesorios), que debe tener una temperatura interna de 44-48C a la hora de la coleccin. La vagina artificial debe ser lubricada con vaselina o con un lubricante estril no espermicida (Foto 5: Priority care Ref 11905/0140 y accesorios para toma de temperatura). Foto 2. Sistema Hannover Ref. 11220/0145

Foto 3. Sistema Colorado Ref. 11230/0000

Foto 4. Sistema Missouri Ref. 11245/0000

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Foto 5 Priority care Ref 11905/0140 y termmetro para vagina

El semental comenzar a empujar, y la eyaculacin puede ser detectada observando los movimientos de la cola y poniendo la mano en la parte ventral del pene, para sentir las pulsaciones de la uretra que acompaan a la eyaculacin. La eyaculacin se produce en tres fracciones: pre-seminal, fraccin rica en espermatozoides y la fraccin de gel. El volumen medio del eyaculado oscila entre los 75-120ml (depende de la raza) y pueden realizarse entre 2-3 colecciones. Al semental se le da un descanso, y entonces se recoge un segundo ejaculado. Es muy importate cumplir los protocolos de higiene estricta durante la coleccin del semen, as como el cuidado y limpieza de todos los equipos utilizados para la coleccin. Las bacterias pueden ejercer un efecto doblemente negativo sobre el xito de la inseminacin: por una parte las bacterias condicionalmente patgenas pueden llegar con el semen al genital de la yegua, provocando all en el caso ms desfavorable una inflamacin del tero. Por otra parte, ciertas bacterias ejercen un efecto negativo sobre la motilidad espermtica. Un problema frecuente son las infecciones por Pseudomonas aeruginosa, un germen, que se encuentra de preferencia en baos de agua y pisos hmedos, provoca una reduccin manifiesta de la motilidad en semen refrigerado dentro de las primeras 24horas. 3. Evaluacin del semen. La valoracin de los eyaculados incluye el registro del volumen, concentracin, motilidad, y formas anormales. Los materiales que entran en contacto con el semen deben estar a la misma temperatura que el semen (aproximadamente 37C evitando el choque trmico), limpios, secos y no txicos. Durante la coleccin, el semen se filtra para quitar el gel y cualquier suciedad (Filtro para semen Ref. 11245/3100). Se debe registrar: 3.1. Volumen: volumen total de semen libre de gel se puede medir con una probeta graduada (Probeta graduada Ref. 15426/0250) 3.2. Motilidad: la motilidad total y progresiva se valora inmediatamente despus de la coleccin poniendo una gota del semen en un portaobjetos temperado y examinndola al microscopio (Foto 6. Microscopio de contraste de fases CX31 Ref. 12004/0331 y accesorios). Las muestras concentradas se pueden diluir con el diluyente de semen que se vaya a utilizar o con una solucin salina. El semen puro y el diluido se deben evaluar varias veces

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para la determinacin de la longevidad del eyaculado. Los sementales frtiles tienen que tener al menos 2 x 109 espermatozoides con motilidad progresiva, la morfologa espermtica debe ser normal en cada uno de los eyaculados recogidos.

Foto 6. Microscopio de contraste de fases CX31 Ref. 12004/0331 y accesorios

Es importante que el semen se caliente suavemente a 37C antes de la evaluacin. La motilidad en masa, se evala con una gota de semen no diluida en un portaobjetos sin cubrir y observado a microscopio (x40). La motilidad individual se determina en una muestra diluida con un medio salino o diluyente para semen de equino. Se coloca una gota de esperma diluido en un portaobjetos, se tapa con el cubre objetos, y se examina a x200-400. La proporcin de esperma que se est moviendo progresivamente a travs del campo visual es estimada buscando grupos de espermatozoides (aproximadamente 10) y estimando cuantos tienen una motilidad progresiva y cuantos no la tienen. El ambiente y las condiciones en las que hace la valoracin son muy variables, por lo que es necesario que siempre la temperatura del semen antes de la valoracin sea la adecuada. Por lo tanto, eyaculados con valores de motilidad progresiva de 60%, son aceptables. Si la motilidad es inferior al 50% el eyaculado no es considerado apto para la congelacin. La presencia de clulas extraas en la muestra debe ser comprobada mientras se valora la motilidad. Este mtodo de valoracin es subjetivo y depende mucho de la persona que hace la valoracin. En la actualidad existen otros sistemas ms objetivos para el anlisis de la motilidad, son los sistemas de anlisis por imgenes (Foto 7 Sistema de anlisis por imagen SpermVision Ref. 12049/0586), que permite valorar de forma precisa los diferentes parmetros seminales, analizando la motilidad y concentracin en tiempo real (menos de 2 segundos).

Foto 7 Sistema de anlisis por imagen SpermVision Ref. 12049/0586

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3.3. Concentracin: se puede valorar usando una cmara de contaje (Cmara de contaje Ref. 15150/4771) en la que se pone una muestra de semen diluido 1:20 con una solucin de cloruro sdico formolado y examinndola al microscopio para realizar el contaje y posteriormente calcular la concentracin total mediante la frmula de conversin (x106 espermatozoides / ml). Para una valoracin ms exacta se utiliza el espectrofotmetro calibrado para determinar la concentracin del eyaculado (Foto 8 Fotmetro SpermaCue Ref. 12300/0500). El nmero total de espermatozoides se calcula como concentracin x volumen.

Foto 8 Fotmetro 12300/0500

SpermaCue

Ref.

3.4. Morfologa: Se fija una muestra de semen en una solucin salina con formaldehdo y se observa con microscopio de contraste de fases x1000. Tambin se puede determinar la morfologa mediante tincin del semen (Colorantes Spermac Ref. 15405/0000; Eosina G Ref. 15405/0025: Nigrosina Ref. 15405/0029). Al menos se debe contar 100 espermatozoides. Las formas anormales ms frecuentes son: - Cabezas sueltas - Cabezas con formas extraas - Gotas citoplasmticas - Colas dobladas - Acrosomas defectuosos Si el primer eyaculado es aceptable, el segundo eyaculado debe contener aproximadamente la mitad del nmero de espermatozoides del primero, pero el porcentaje de anormalidades debe ser el mismo, as como la motilidad. Si existen diferencias es necesario obtener un tercer eyaculado. El tercer eyaculado debe tener aproximadamente la mitad de los espermatozoides del segundo eyaculado, y la misma morfologa y motilidad. Para la valoracin de sementales la coleccin de semen se hace diariamente durante 7-10 das antes de que un eyaculado sea representativo (es decir que la evaluacin del semen sea constante en las colecciones sucesivas). El nmero de espermatozoides despus de 2 das de descanso debe estar sobre 8-10 mil millones en el primer eyaculado, y aproximadamente 4 mil millones en el segundo eyaculado. La motilidad total de los espermatozoides debe ser de 65%, y la motilidad progresiva 45%.

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4. Conservacin del semen. Una vez que se colecte el semen, se determinq la motilidad, la concentracin y el nmero de anomalas morfolgicas. Se calcula los espermatozoides con motilidad progresiva, se les aade el diluyente y el antibitico necesario para mejorar la supervivencia del semen. La temperatura de conservacin del semen depender del tiempo que necesitemos mantener su viabilidad: semen fresco, Refrigerado o congelado. En el semen fresco, se diluye y se insemina la yegua inmediatamente. Para el semen Refrigerado, los diluyentes de eleccin son los que tienen como componentes principales yema de huevo (Diluyente Gent Ref. 13571/0045) o sustitutivos de yema de huevo (AndroMed-E Ref. 13573/0020), leche descremada (EquiPro Ref 13570/0201). La congelacin de semen requiere la eliminacin del plasma seminal mediante centrifugacin (Foto 9 Centrfuga Ref. 14602/0500), para lo cual el semen se prediluye (1:1) con el diluyente que se vaya a utilizar o con un diluyente especfico (Merck I diluyente de centrifugacin Ref 13565/0001). La dilucin se hace a una temperatura de 35C ( el semen se distribuye en tubos de centrfuga y se aade unos 3-4cc de un medio especial para la centrifugacin del semen (CushionFluid Ref.13580/0001). Con CushionFluid, la centrifugacin del semen se puede realizar hasta 1000G durante 20 minutos. Despus de la centrifugacin los espermatozoides se diluyen en el medio adecuado para su uso en fresco o para la congelacin.

Foto 9. Centrfuga Ref. 14602/0500

La higiene durante el procesado de semen es clave para impedir el desarrollo de bacterias en el semen. La adicin de antibiticos puede compensar en parte el efecto de la contaminacin bacteriana del semen, que puede afectar considerablemente los resultados de la inseminacin. Sin embargo, el semen refrigerado de ciertos sementales, procesado con diluyente libre de antibiticos, puede tener despus de 24 horas una calidad claramente superior que el semen del mismo eyaculado que ha sido procesado con diluyente adicionado de antibiticos. Puede ser, por tanto, conveniente utilizar diluyentes libres de antibiticos para mejorar las cualidades del semen de ciertos animales, cuya calidad como semen refrigerado es insatisfactoria. 4.1. Semen Refrigerado. Se preparan dosis de 20 ml de volumen con una concentracin final de 400 x 106 espermatozoides. La temperatura final de conservacin es de +5C. La dilucin se hace a 35-37C, por lo que el diluyente debe estar temperado a esa temperatura (Foto 10 Bao Mara Ref. 14078/0001).

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Foto 10 Bao Mara Ref. 14078/0001

El volumen de la dosis es de 10-30ml para el semen fresco, con una concentracin de 100-500 millones de espermatozoides, y de 30-60ml para semen conservado con una concentracin de 400-500 millones de espermatozoides (el grado de dilucin oscila entre 1:1 a 1:6). El descenso de temperatura debe realizarse en un plazo de 2-3 horas. Para una mayor precisin en la preparacin de las dosis el uso de sistemas de dilucin con calibracin automtica optimizan la produccin de dosis (Foto 11 Smart Dispenser Ref. 13200/0700). La dosis deben agitarse suavemente y de forma regular durante su conservacin (Foto 12 Rodador mezclador Ref. 14340/0500). Foto 11 Smart Dispenser Ref. 13200/0700

Foto 12 Rodador mezclador Ref. 14340/0500

Para el transporte de las dosis seminales es importante mantener la temperatura de +5C (Foto 13 Contenedor para transporte Ref. 17229/0001; Equitainer Ref. 17220/0000).

Foto 13 Contenedor para transporte Ref. 17229/0001; Equitainer Ref. 17220/0000

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4.2. Semen congelado. Cuando el semen necesita recorrer largas distancias o conservarse durante largo tiempo, la tcnica ideal es la congelacin. Despus de la centrifugacin, el semen es diluido con un medio especial para congelacin a una concentracin final de 200 millones por ml y envasado (Foto 14 Sistema de envasado y sellado MPP1 Ref. 13017/000) en pajuelas de 0.5 ml a 4-5C (Foto 15 Vitrina refrigerada Ref. 119-1000). Una dosis de inseminacin es de 8 pajuelas que hacen un total de 4ml con 800 millones de espermatozoides. Las pajuelas deben ir identificadas con la fecha de coleccin, pas de origen, raza, nmero de semental, nombre de la yeguada y nmero de registro (Foto 16 Easy Coder para impresin de pajuelas sin tinta Ref. 1308/0000).

Foto 14 Sistema de envasado y sellado MPP1 Ref. 13017/000

Foto 15 Vitrina Refrigerada Ref. 119-1000

Foto 16 Easy Coder para impresin de pajuelas sin tinta Ref. 1308/0000 Las pajuelas se congelan en vapores de nitrgeno (Rampa flotante para congelacin Ref. 15043/003) o utilizando un biocongelador programable, que permite disear la curva de congelacin de +4C hasta 140C (Foto 17 Icecube Ref. 16820/2000). Foto 17 Icecube Ref. 16820/2000 y pajuelas de congelacin

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Una vez alcanzados los 140C las pajuelas se introducen directamente en nitrgeno lquido donde quedan almacenadas hasta su uso (Foto 17 Contenedores de almacn Ref. 16520/2006 y Contenedores de transporte Ref. 16502/2001) Foto 17 Contenedores de almacn Ref. 16520/2006 y Contenedores de transporte Ref. 16502/2001

Para la descongelacin se introduce la pajuela a +37C durante 35 segundos (Foto 18 Descongeladores Ref. 17043/3542). Foto 18 Descongeladores Ref. 17043/3542

5. Aplicacin del semen. La yegua se prepara para la inseminacin en un lugar limpio y tranquilo. La cola se debe atar, para dejar libre la zona perineal y realizar una limpieza en seco con toalla de papel. Las yeguas deben ser inseminadas con al menos 250-500x106 espermatozoides con motilidad progresiva y morfologa normal. El semen se deposita en el cuerpo del tero, usando una pipeta de inseminacin de plstico estril a la cual se conecta la jeringa con el semen (Foto 19 Pipetas universales de inseminacin Ref. 17209 y Pipetas de inseminacin intrauterina profunda Ref. 17209/1165).

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Foto 19 Pipetas universales de inseminacin Ref. 17209 y Pipetas de inseminacin intrauterina profunda Ref. 17209/1165

Para prevenir cualquier tipo de contaminacin se recomienda utilizar material desechable. Los espermatozoides pueden seguir siendo viables en el tracto genital de la yegua durante 48hr. Una fertilizacin exitosa, particularmente si ha de trabajarse con dosis pequeas de semen, puede realizarse mediante el uso del mtodo endoscpico. Con ayuda del endoscopio es posible depositar bajo control visual una dosis nica (una pajuela de 0,5 ml) de semen en la unin tero-tubrica (Foto 20 Endoscopio Ref. 23700/1200). El endoscopio permite una reduccin importante de la cantidad de espermatozoides, sin arriesgar el xito de la inseminacin. Esto es de especial inters, cuando se trata de sementales muy solicitados o de disponibilidad de semen limitada. Foto 20 Endoscopio Ref. 23700/1200

Siempre hay que tener en cuenta que el resultado de la inseminacin (el potro) depende de la interaccin de tres factores principales: la fertilidad del semental, la fertilidad de la yegua y el manejo reproductivo. Es por ello que se debe asegurar una buena prctica de la inseminacin artificial para maximizar los resultados reproductivos.

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