AGRICULTURA

EMBRIOGNESE SOMTICA
diretamente relacionada com a dependncia que o homem tem das plantas para uso na alimentao, vesturio, habitao, sade, educao e lazer, que torna a atividade agroindustrial a maior empregadora de mo-de-obra do planeta, no obstante somente cerca de 150 espcies serem largamente cultivadas entre as 10.000 plantas historicamente utilizadas pelo homem. No apenas a produo dos principais cultivos tem aumentado extraordinariamente, mas

Doutor em Gentica e Melhoramento de Plantas Embrapa - Agroindstria Tropical

Fotos cedidas pelo autor

Levi de Moura Barros

Pr-requisito para o emprego de algumas tcnicas de biotecnologia no melhoramento gentico de plantas perenes

O MELHORAMENTO DE PLANTAS PERENES A agricultura moderna encontra-se numa encruzilhada: ao mesmo tempo que tem o papel de suprir as necessidades alimentcias mnimas de bilhes de pessoas carentes e as exigncias seletivas da parte da populao de maior poder aquisitivo, em produtos alimentcios especiais, vesturio e habitao, vem-se tornando economicamente insustentvel, por causa dos elevados custos dos insumos e dos servios associados aos fatores de produo; e impopular, por ser mais agressiva ao meio ambiente, pela dependncia cada vez maior de petroqumicos. Nessas circunstncias, cabe ao melhoramento de plantas a importante tarefa de aumentar a produtividade e melhorar a qualidade dos produtos, a mais baixo custo, sem agresso ao ambiente. Ser isso possvel por meio dos processos convencionais, desenvolvidos e aperfeioados ao longo da histria agrcola do homem, ou sero necessrios novos procedimentos? O melhoramento de plantas, conceituado por muitos como a arte e a cincia de alterar geneticamente as plantas em benefcio da humanidade, tem sido uma das ferramentas mais extraordinrias na luta pela melhoria da qualidade de vida do homem, notadamente contra a fome, ainda persistente em todos os continentes. A Revoluo Verde o maior exemplo da ao positiva do melhoramento gentico de plantas no aumento da produtividade, tendo resultado, inclusive, no Prmio Nobel da Paz para o Engenheiro Agrnomo Norman Ernest Borlaug, responsvel pelo programa que possibilitou triplicar a produo de alimentos na dcada de 60. A importncia do melhoramento est

Figura 1 - Massa proembrinica tambm a resistncia a doenas e a adaptabilidade a ambientes adversos tm melhorado o desempenho de muitas espcies. Como arte, o melhoramento vem sendo praticado desde os primrdios da civilizao, quando os primitivos passaram do estgio de simples colhedores para o de semeadores das espcies e tipos de interesse, sendo possvel a seleo dos melhores indivduos graas variao que inerente aos seres vivos. A conceituao de melhoramento como arte deveu-se, ento, importncia da habilidade do homem no processo que, inquestionavelmente, resultou em ganhos extraordinrios, sendo as

plantas mais cultivadas hoje muito diferentes, sob diversas caractersticas, dos seus ancestrais primitivos. Posteriormente, com o estabelecimento da gentica e a incorporao de algumas cincias relacionadas, como estatstica e experimentao, botnica, fisiologia, bioqumica, fitopatologia, solos e nutrio de plantas, entre outras, mtodos e tcnicas foram desenvolvidos, permitindo maior segurana na manipulao das caractersticas herdveis das plantas, de forma que o melhoramento passou a ser cincia, fundamentada em princpios cientficos que permitem a predio de ganhos e a avaliao precisa de resultados, superando o empirismo e a dependncia exclusiva da habilidade do melhorista, que caracteriza o melhoramento praticado apenas como arte, no estabelecimento de novas cultivares. Diversos mtodos e tcnicas so utilizados no melhoramento gentico de plantas, todos dependendo basicamente do ciclo de vida - anual ou perene - e do modo de reproduo da espcie, se de autofecundao ou de fecundao cruzada. Especificamente com plantas perenes, o emprego das tcnicas convencionais de melhoramento dificultado por diversos fatores, destacando-se o longo perodo da fase juvenil, a demora para a estabilizao da produo, a alta heterozigosidade dos melhores indivduos, a falta de informaes genticas sobre as caractersticas horticulturais de interesse e a ineficincia das tcnicas de melhoramento em suplantar o mascaramento imposto pelas influncias do ambiente. Some-se a isso o tempo e a rea necessrios para a obteno de variedades melhoradas, com as decorrentes implicaes de custos no processo. A incorporao de genes/complexos gnicos, tanto nas variedades comerciais

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em cultivo como nas novas obtenes, tambm dificultada por causas naturais diversas na etapa de hibridao entre espcies e, em muitos casos, pela necessidade de enfoques diferenciados para a copa e porta-enxerto. Em decorrncia, no obstante o consenso de que as tcnicas convencionais sejam indispensveis, fica claro que novos procedimentos necessitam ser incorporados como complemento para que os avanos ocorram mais rapidamente, a menor custo e com maior eficincia, razo pela qual devem-se concentrar esforos na aplicao de tcnicas alternativas no melhoramento gentico das plantas perenes. TCNICAS AUXILIARES DO MELHORAMENTO DE PLANTAS Apesar da extraordinria contribuio dos mtodos convencionais no melhoramento de plantas, atualmente j consenso que no se pode mais esperar ganhos significativos de seleo nos principais cultivos utilizando-se esses processos, em razo por que novos enfoques so necessrios para que aumentem as chances de ocorrncia de nova revoluo verde. Nesse contexto, a aplicao de tcnicas de biotecnologia em auxlio dos mtodos convencionais de melhoramento, pode contribuir para a sustentabilidade da agricultura pela produo de cultivos melhorados e mais compatveis com o ambiente, especialmente em pases no desenvolvidos, onde h necessidade de tecnologias para problemas especficos em cultivos tropicais (Thorpe, 1994). Como exemplo, citase a uniformidade dos cultivos, resultante do melhoramento continuado que aumenta a vulnerabilidade dos cultivos a insetos e patgenos, com o decorrente acrscimo da dependncia de produtos qumicos e suas implicaes. Reduz-se, ento, a uma mxima do melhoramento: as exigncias do mercado levam uniformidade dos cultivos. E a uniformidade leva ao risco de desastre, pela vulnerabilidade gentica. Especificamente com plantas perenes, a maior dificuldade na aplicao das tcnicas convencionais de melhoramento reside no desconhecimento do controle gentico das caractersticas de interesse, resultante do menor esforo de pesquisa com esse grupo de plantas. A partir do desenvolvimento de tcnicas para aproveitamento de marcadores moleculares, ampliou-se o potencial de identificao dos marcadores genticos e, consequentemente, as possibilidades de sucesso com o melhoramento de plantas perenes. Com as modernas tcnicas de biologia molecular, foram incorporados novos conhecimentos sobre a estrutura

gentica dos indivduos, notadamente no que se refere aos marcadores moleculares, alargando-se os horizontes para os ganhos de seleo em todos os nveis. Diversos procedimentos relacionados

Figura 2 - Calos embriognicos em meio lquido com a biotecnologia tm sido adotados, com maior ou menor grau de sucesso, no melhoramento de diversas espcies de interesse econmico. Entre esses relacionam-se: 1) a micropropagao; 2) a regenerao de hbridos somticos, tanto intergenricos como interespecficos, pela fuso de protoplastos; 3) a obteno de haplides; 4) a seleo in vitro de variantes somaclonais; e 5) a transformao (Litz, 1994; Mehlenbacher, 1995; Mouro Filho &

Figura 3 - Embries somticos Grosser, 1992; Pearl et al., 1996; Thorpe, 1994). Entretanto, o uso da biotecnologia no melhoramento gentico das plantas depende de protocolos de regenerao in vitro a partir da cultura de clulas e/ou de tecidos, incluindo a embriognese somtica (Litz & Gray, 1992). EMBRIOGNESE SOMTICA 1 - Aspectos gerais - Entre os processos de regenerao, a embriognese somtica, que o processo pelo qual clulas ou tecidos somticos (no sexuais) se desenvolvem at a formao completa de uma planta atravs de uma srie de estgios, caractersticos do desenvolvimento

de embries zigticos (aqueles obtidos pelo processo de fuso de gametas) (Wann, 1988), , teoricamente, a melhor opo para a propagao in vitro de fruteiras (Merkle, 1995), por apresentar algumas vantagens, como: 1) alta taxa de multiplicao comparada a qualquer outro processo de propagao; 2) escalonamento da produo pela manuteno da cultura em meio lquido, o que elimina a dependncia de perodos especficos de disponibilidade de material propagativo, permitindo estabelecer o perodo desejado para as obtenes; 3) plantio direto da muda obtida via embriognese somtica sem necessidade de enxertia, com menor custo de produo, alm da planta ser geneticamente igual planta me, sem as influncias do porta-enxerto, como acontece com as plantas obtidas por mtodos de propagao vegetativa convencionais; e, mais importante para o melhoramento per si; 4) possibilita a transferncia de genes, razo pela qual tem sido utilizada como ferramenta em estudos de desenvolvimento das plantas (Zimmerman, 1993), propagao clonal e melhoramento, tanto pela fuso de protoplastos como pela transformao gentica. Diversas angiospermas, incluindo algumas espcies frutferas lenhosas, tm a capacidade de produzir naturalmente embries adventcios a partir de tecidos do vulo, sendo mais comum na forma de poliembrionia nucelar, embora se registre a ocorrncia, tambm, de monoembrionia (Litz et al., 1984; Litz, 1984). A regenerao pela embriognese somtica tambm ocorre sob condies controladas, podendo ser explorada tanto para a propagao em massa de indivduos desejveis, como para o melhoramento, na obteno de plantas transgnicas. Entre as frutferas tropicais, a manga, planta da famlia anacardicia, tem sido contemplada, no emprego de tcnicas de biotecnologia, com protocolos para a regenerao atravs da embriognese somtica (DeWald, 1989 a e b) e transformao (Subramanian, 1995). A induo in vitro de embries somticos na manga dse a partir de tecido nucelar, tecido que garante a identidade gentica desejada, e possvel, tanto em cultivares poliembrinicas como em monoembrinicas, com a resposta sendo gentipo dependente (Litz & Lavi, 1997), ou seja, varia com a variedade utilizada, razo pela qual o protocolo empregado em uma variedade nem sempre funciona em outra, no obstante os componentes bsicos serem os mesmos. difcil, porm, a obteno de plantas em cultivo, por dificuldades no processo de aclimatao, que a etapa de adaptao das plantas em campo.
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A importncia do estabelecimento de protocolos para a regenerao de plantas a partir de embriognese somtica enfatizada pelo interesse em incrementar a participao do Brasil como exportador no mercado internacional de frutas tropicais, atividade geradora de emprego e de renda, e alternativa de peso na recomposio da economia de diversas regies do Pas. 2 - A tcnica - Nesta oportunidade so relatados os procedimentos, com mtodos e tcnicas aplicadas na regenerao de plantas de mangueira por embriognese somtica, no Tropical Research and Education Center - Universidade da Flrida, em Homestead, Flrida. O protocolo utilizado foi o descrito por Litz et al.(1982) e modificado por DeWald et al. (1989 a). 2. 1 - Materiais utilizados como explantes - Foram utilizadas sementes de frutos imaturos de diferentes tamanhos (estimados em 30 a 60 dias aps a florao), das cultivares Keitt, que monoembrinica, e Hindi que poliembrinica, da coleo de germoplasma do Tropical Research and Education Center - Universidade da Flrida, em Homestead, Flrida. Como fonte de explante, ou material propagativo, utilizou-se tecido nucelar, que tem a mesma constituio gentica da planta me, ou seja, as novas plantas que se originam a partir desse tecido constituem um clone da mesma forma que na propagao vegetativa convencional. 2. 2 - Meios de cultura - Foram utilizados meios de cultura para induo, manuteno, crescimento e maturao dos embries somticos obtidos. O meio de induo foi uma composio do meio B5+ de Gamborg (Gamborg et al., 1968) com a adio de micronutrientes e substncias orgnicas (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com L-Glutamina, 2,4 - D, sacarose, e adio final do agente gelificante Gel-Gro. Os demais meios de cultura foram variantes do meio de induo, com retirada ou alterao na concentrao de alguns componentes. 2. 3 - Tratamento pr-cultivo e preparao do explante - Os frutos foram desinfetados superficialmente por lavagem em gua corrente, por 15 minutos, seguida de imerso por 20 minutos numa soluo de hipoclorito comercial a 20%, com 5,25% de cloro ativo, trs gotas do espalhante Tween 20 e, finalmente, em condies asspticas, trs lavagens em gua destilada e esterilizada. As sementes foram retiradas intactas dos frutos e seccionadas longitudinalmente dando origem a duas metades. Essas metades, aps retirado o embrio zigtico, foram cultivadas em placas de Petri (100mm x 15mm), contendo meio de induo. As placas foram seladas com fita Parafilm para
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prevenir contaminaes e armazenadas a temperatura controlada entre 23 e 25C, na ausncia de luz. Tambm os frascos Erlenmeyer, nas fases em que se utilizou meio lquido, foram selados com fita Parafilm. 2. 4 - Conduo - Os explantes foram subcultivados para outros pontos da placa j no terceiro dia, quando surgiram os primeiros sinais de compostos fenlicos no meio. Seguiram-se subcultivos, para outros pontos da placa em uso ou para outra placa, sempre que necessrio. Observada a presena de massa proembrinica nos explantes, foi feita a separao por meio de uma malha de 1000 m. A parte retida na malha foi transferida para o meio de manuteno para a proliferao de novos calos. A parte menor foi transferida para o meio de multiplicao para a formao de embries. Na cultivar

Figura 4 - Embries somticos em germinao monoembrinica (Hindi) verificou-se a presena de calos aos 31 dias e na poliembrinica aos 28 dias aps o cultivo. (Figura 1); aos 40 dias observou-se a presena de calos em 38% das placas cultivadas com Hindi, o que reflete a sua capacidade natural de formao de embries e, aos 50 dias, em apenas 4% da cultivar Keitt (Figura 2). A transferncia da massa prembrinica para meio de manuteno iniciou-se aos 70 dias. As culturas em meio lquido foram mantidas em mesa agitadora (shaker) a 125 rpm. temperatura e luz ambientes (aproximadamente 23 a 25C, sem luz suplementar) e os subcultivos para meio fresco foram efetuados em intervalos regulares de cinco dias. Os embries formados, tanto em meio lquido como em meio slido (dependendo da variedade), foram transferidos para placas de Petri de 100mm x 20mm contendo o meio de maturao I (MMI), onde permaneceram at a germinao e formao de razes, sendo transferidos depois para o tubos de cultura com o meio de

maturao II (MMII). No meio de maturao I (MMI), os embries foram preservados nas mesmas condies em que eram mantidos no meio de crescimento: na ausncia de luz e a temperatura ambiente. No meio de maturao II, as plantas foram conservadas em cmara de crescimento, com temperatura e luz controladas. Com relao ao desenvolvimento dos calos no meio de manuteno e no meio de multiplicao, verificou-se que a cultivar Hindi se comporta bem tanto em meio lquido como em meio slido, enquanto a cultivar Keitt no suporta o meio lquido, com a morte dos calos. Entretanto, a opo, nos gentipos em que seja possvel, deve ser pelo meio lquido, onde a proliferao da massa proembrinica muito mais acelerada. Essa capacidade de proliferao contnua da massa proembrinica, com formao de proembries somticos secundrios a partir da protoderme, devese presena do 2,4-D no meio de cultura (Litz et al., 1995), residindo a o potencial da tcnica para uso como mtodo de propagao vegetativa de mais baixo custo que a micropropagao. 2. 5 - Maturao dos embries somticos - Os proembries somticos que se individualizaram da massa proembrinica inicial na fase de manuteno, separados pela malha de 1000 mm, foram transferidos para o meio de crescimento (MC), onde se observou a formao de embries j ao fim de 20 dias (Figura 3) e de cotildones diferenciados e radculas visveis aos 50 dias. A diferenciao dos cotildones em embries somticos formados a partir dos proembries depende do gentipo e varia, normalmente, entre 30 e 60 dias (Litz et al., 1993). Os embries, quando atingiram cerca de 1 cm, foram cultivados no meio de maturao (MMI), onde o crescimento foi bastante rpido, com alguns embries atingido at 5 cm j aos 15 dias aps a transferncia (Figura 4). 2. 6 - Germinao - Pela dificuldade de observao visual do estgio de elongao do hipoctilo, que caracteriza a germinao, utilizou-se a formao da radcula como o estgio para a transferncia dos embries para o meio de maturao 2 II (MMII), na presena de luz (60 mol/m / 1 s ). importante salientar que os embries, em geral, s germinam quando completamente maduros (Litz & Lavi, 1997). Nem todos os embries somticos desenvolveram rebentos, talvez devido s razes terem se partido durante as transferncias para o meio fresco. A fragilidade das razes dos embries de manga um problema dessa fase. Aps 30 dias em meio MMII, as plantas j se encontravam bem desenvolvidas (Figura 5) e prximas da fase de

aclimatao, ressaltando o sucesso na obteno e germinao de embries somticos com o protocolo utilizado. 3 - Problemas com a tcnica - Nem sempre a formao de calos resultou na obteno de plantas. Na maioria das placas os calos foram perdidos ou por contaminao ou simplesmente por morte. Alm disso, outros problemas ocorreram nas fases de germinao e crescimento dos embries. 3. 1 - Contaminao - Alm das perdas por contaminao endgena, tanto por fungos como por bactrias, houve o problema, sempre presente, das contaminaes exgenas. Estas so, teoricamente, de mais fcil controle por serem decorrentes da execuo do processo. 3. 2 - Vitrificao - comum a hiperhidricidade ou vitrificao de embries de manga na fase de maturao. Esse fenmeno foi bem estudado por Monsalud et al., (1995), que verificaram a viabilidade de reverso por meio da secagem parcial dos embries somticos quando se encontram com 2-3 mm de comprimento, sob umidade relativa elevada (100%) durante 24 horas ou por meio da cultura dos embries em meio solidificado com 6 g/l de GelGro. 3. 3 - Outros - Observou-se tambm a ocorrncia de fasciao e fuso de embries, anomalias que podem aparecer quando as divises das clulas em reas meristemticas acontecem antes da diferenciao da gema apical e dos cotildones (Litz & Gray, 1992). Essas anomalias no so inerentes aos embries somticos, ocorrendo tambm em embries zigticos imaturos cultivados in vitro. PERSPECTIVAS DE APROVEITAMENTO DA EMBRIOGNESE SOMTICA NA PROPAGAO E MELHORAMENTO DE OUTRAS ESPCIES A extraordinria quantidade de embries obtidos de cada explante na experincia realizada demonstra o potencial da tcnica, sobretudo para uso como mtodo de propagao, alm de possibilitar o emprego de tcnicas no convencionais de melhoramento, enfatizando a possibilidade de uso em outras espcies, principalmente as mais relacionadas. Como exemplo prtico, cita-se a necessidade de obteno de clones de cajueiro, planta da famlia Anacardiaceae como a mangueira, adaptados tanto para as condies agroecolgicas do cerrado, para onde o cajueiro vem-se expandindo rapidamente como cultivo comercial, como para o semirido, onde vivem cerca de 15 milhes de pessoas e onde as alternativas econmicas so limitadas.

A existncia de diversas espcies de Anacardium nativas do cerrado (Barros, 1995) induz, de imediato, a expectativas de seu aproveitamento em programas de melhoramento para adaptatividade, tanto s condies do cerrado, especialmente tolerncia ao alumnio, como s do semi-rido, caracterizado pela escassez e irregularidade na distribuio das chuvas. Entretanto, as espcies relacionadas constituem, no momento, apenas uma grande fonte de germoplasma inexplorado. Alm das barreiras naturais obteno de hbridos interespecficos por meio de cruzamentos convencionais, h o problema da adaptao das espcies de cerrado s condies edafo-climticas do litoral e transies com outros

Figura 5 - Plantas de mangueira oriundas de embries somticos ecossistemas do Nordeste, dificultando a sua conservao em banco de germoplasma e, consequentemente, o seu emprego nos programas de melhoramento gentico. Fica claro que novos procedimentos necessitam ser incorporados como complemento para que os avanos ocorram mais rapidamente, a menor custo e com maior eficincia, razo pela qual se devem concentrar esforos na aplicao de algumas das tcnicas pertinentes biotecnologia no melhoramento gentico do cajueiro. Uma experincia inicial realizada tambm no TREC/Universidade da Flrida, para avaliao de: 1) efeito de diferentes concentraes de 2,4-D no meio de

induo descrito por DeWald (1989 a) para a mangueira, em ovrios de flores hermafroditas, em frutos de diferentes idades do gentipo CCP 76 de cajueiro ano-precoce; e 2) efeito, direto ou em combinao, de diferentes auxinas e citocininas em diferentes gentipos de cajueiro ano precoce na induo de calos de diferentes materiais genticos do cajueiro, demonstrou que o comportamento da cultura foi surpreendentemente diferente do observado na mangueira, com baixa intensidade de compostos fenlicos no meio de cultura, o que fez com que o primeiro subcultivo ocorresse aos sete dias, porm em apenas 10% das placas cultivadas. As demais apenas tiveram o primeiro subcultivo aos 21 dias. Em abacate, Witjaksono (1997) apresentou um protocolo para isolamento, cultura e regenerao de embries somticos a partir de protoplastos, que poder ser til no melhoramento da espcie por hibridizao somtica, pela transferncia de genes entre espcies, tcnica que vem sendo utilizada no melhoramento gentico de citros (Grosser & Gmitter Jr., 1990). necessrio chamar a ateno, no entanto, para o fato de, apesar do potencial terico, o nmero de exemplos de sucesso com a embriognese somtica em plantas lenhosas ainda muito baixo quando comparado com as plantas herbceas (Wann, 1988; Litz, 1994; Merkle, 1995). As principais limitaes da embriognese somtica em plantas perenes, especialmente frutferas tropicais so: 1) o baixo nmero de plantas efetivamente desenvolvidas e em condies de campo, no obstante ser possvel o processo de embriognese, e, consequentemente, a obteno de embries somticos, em diversas espcies; 2) dificuldades de obteno de embries a partir de partes maduras/adultas das plantas, com a maioria dos exemplos conhecidos sendo com tecidos da semente ou de seedlings. Em alguns casos, tem sido possvel a clonagem de embries, ou embriognese repetitiva. Entretanto, a fonte para a obteno das cpias so embries zigticos, o que quase sempre no desejvel por ser desconhecido o valor gentico desses indivduos. H necessidade de esforos de pesquisa que viabilizem protocolos para a regenerao de plantas atravs de embriognese somtica, o que possibilitar o emprego de algumas tcnicas de biotecnologia na obteno de novas cultivares especialmente adaptadas a condies especficas de ambiente, bem como a multiplicao das plantas obtidas a menor custo e maior confiabilidade.
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