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Zamorano
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagacin

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin in vitro

5.7 Rescate de Embriones de Orqudeas
Explante: Embriones Cigticos

Introduccin
Las semillas de orqudeas tienen requerimientos muy particulares para su germinacin por lo que la germinacin in vitro representa una alternativa viable en su produccin. Mediante el cultivo de embriones in vitro nosotros podemos manipular las condiciones ambientales para as asegurar un alto nivel de germinacin y obtener un alto nmero de plantas a partir de una sola cpsula. El propsito de esta prctica es proveer al estudiante con los conocimientos y habilidades necesarias para poder sembrar y germinar semillas de orqudeas in vitro.

Materiales y Mtodos
1. 2. 3. 4. 5. 6. Cpsulas Cultivos establecidos en etapas II/III Platos petri estriles Pinzas y bistures Solucin de 70% Ethanol Solucin desinfectante preparada con 2% Ca(OCl) (hipoclorito de Ca) ms 2 gotas de tween 80 por cada 100 ml de solucin. 7. Agua destilada estril para los enjuages 8. 10 frascos / estudiante conteniendo medio slido con Knudson frmula C (KC) para germinacin de embriones (Etapa I) 9. 10 frascos / estudiante conteniendo medio slido para multiplicacin / enraizamiento de vitroplntulas de orquideas (Etapa II / Etapa III) 10. Bandejas de celdas mltiples 11. Macetas

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Procedimientos
1. Obtenga la(s) cpsula(s) 2. Lavar las cpsulas con jabn, brocha y agua 3. Cortar la punta con cuidado 4. Esterilizar la cpsula con alcohol al 70% para romper las ceras durante 30 segundos a 1 minuto. 5. Colocar la cpsula en Ca(OCl) (hipoclorito de calcio) al 1% + 3 gotas de tween 80 por cada 100 ml. de solucion durante 15 minutos. 6. Colocar la cpsula en Na(OCl) (hipochlorito de sodio) al 2% + 3 gotas de tween 80 por cada 100 ml. de solucion durante 15 minutos. 7. En la cmara de transferencias colocar la cpsula en un plato Petri estril conteniendo papel filtro. 8. Abrir la cpsula longitudinalmente y separar las dos mitades. Raspar las paredes de las dos mitades para extraer la semilla. 9. Colocar en los tubos con medio Knudson (KC).

Medio para Iniciacin de Orqudeas Medio para Embriones de Orqudeas (Etapa I) Componente 1 Litro Ca(NO3)2.4H2O 1000 mg (NH4)2SO4 500 mg MgSO4.7H2O 250 mg KH2PO4 250 mg EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) Microelementos MS 1 mL (Solucin madre 1000x) Agua de Coco 100 ml Sacarosa 20g Phytagel 3.75 g pH=5.5

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Medio para Multiplicacin de Orqudeas (Etapa II) Componente 1 Litro Macroelementos MS EDTAFeNa Microelementos MS Inositol Cistena Biotina Pantotenato Sulfato de adenina Casena hidrolizada Acido nicotnico Piridoxina Tiamina Polvo de banano Zamorano o Polvo de banano Sigma Sacarosa BAP AIA Phytagel pH=5.8 100 ml (Solucin madre 10x) 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) 1 ml (Solucin madre 1000x) 100 mg 10 mg 1 ml (1:10000) 1 ml (1:100) 5 mg 1 mg 0.01 mg 0.01 mg 0.1 mg 25 g 100 g 30 g 1 mg 1 mg 3.75 g