Gaschromatographie (GC)

Bestimmung von Kovats-Indices Stichworte: Retentionszeit, Retention, Kovats-Indices, Trennfaktoren Es sollen die Kovats-Indices IK der drei Verbindungen Ethylbenzol, Benzol und Toluol bestimmt werden. Zur Durchfhrung des Versuchs werden von der ausstehenden Mischung der n-Alkane (Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Dekan) je 3 mal 1 l bei 70 C injiziert. Die Mischung Ethylbenzol, Benzol und Toluol in Trichlortrifluorethan wird bei dieser Temperatur ebenfalls 1.0 l 3 mal injiziert. Fr die Zuordnung der aromatischen Verbindungen knnen Sie die Messungen zur quantitativen GC verwenden. Die Analysenzeit betrgt bei 70 C etwa 10 min. Gerteeinstellungen Fluss 1 ml/min Stickstoff Split 1:200 Injektor SPL 270 C konstant Sule Varian Vf-5ms, 30 m Ofentemperatur: 70 C Durch die Wahl eines geeigneten Temperaturprogramms sollen Sie nach diesen Messungen die Analysenzeit fr die n-Alkane minimieren. Auswertung 1) Stellen sie die Funktion log tr = f (IK) dar und bestimmen Sie die Kovats-Indices der aromatischen Verbindungen 2) Diskutieren Sie die Ergebnisse der Analysenoptimierung

Quantitative GC Stichworte: Responsefaktoren, Interner und externer Standard, Standardaddition Von den ausstehenden Lsungen (a. Toluol/Benzol, b. Ethylbenzol/Benzol je 0,5 ml Aromat in 100 ml Trichlortrifluorethan) werden jeweils drei Chromatogramme bei 70 C aufgenommen. Die Einspritzmenge soll 1.0 l betragen. Die unbekannte Mischung haben Sie schon zur Bestimmung der Kovats-Indices injiziert (Die Messwerte daraus knnnen Sie hier verwenden). Anschlieend werden 0.5 ml der unbekannten Mischung (Benzol, Toluol, Ethylbenzol in Trichlortrifluorethan) mit 0.5 ml der Benzollsung (4 ml Benzol in 100 ml Trichlortrifluorethan) gemischt. Von dieser Mischung werden dreimal 1.0 l injiziert. Gerteeinstellungen Fluss 1 ml/min Stickstoff Split 1:200 Injektor SPL 270 C konstant Sule Varian Vf-5ms, 30 m Ofentemperatur: 70 C

a) Ermitteln Sie die Responsefaktoren von Ethylbenzol und Toluol gegenber Benzol b) Berechnen Sie mit diesen Faktoren die Konzentrationen der Verbindungen Benzol, Toluol und Ethylbenzol in der Aromatenprobe c) Berechnen Sie die Konzentrationen von Benzol in der unbekannten Mischung durch Anwendung des Aufstockverfahrens

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)

Bestimmung von Aromaten in Speisel

Stichworte:

Gaschromatographie, Massenspektrometrie, Elektronenstoionisation, Fragmentierung, Headspace-Sampling, Aufstockverfahren

Durchfhrung:

Am Beispiel eines Speisels sollen unbekannte aromatische Verbindungen in einer komplexen Matrix untersucht werden.

Folgende Randbedingungen sind eingestellt: Headspace-Sample Dani HSS 1000: Probenofen: Probenaufenthalt: Probenschleife: Transfer Tube: 120 C 15 min 1 ml 130 C

Gaschromatograph HP: Trgergas: Injektionsblock: Ofen: 1,0 bar Helium Gerstel-PTV 70 C (const.) 50 C / 1 min / 6 C min-1 / 80 C / 25 C min-1 / 150 C

Massenspektrometer HP: Solvent Delay: Scan-Modus: 1 min 30 550 amu

Die Einstellungen an den Gerten werden vom Assistenten durchgefhrt und sind nicht zu verndern!

Bestimmung der Aromaten:

Zu Beginn des Versuchs werden 2 ml eines bereitgestellten Speisels (mit Aromaten) in ein 20 ml Head-Space Gef pipettiert und mittels GC-MS analysiert. Die aromatischen Inhaltsstoffe des Speisels knnen mit Hilfe einer MS-Datenbank aus dem TIC (total ion current) identifiziert werden.

Quantitative Bestimmung der Aromaten: Fr diesen Versuchteil bedient man sich des Aufstockverfahrens. Hierzu wird eine Standardlsung angesetzt, bei der man 10 ml reinen ls in ein Becherglas pipettiert und je 25 l der Aromaten 1 - 4 (stehen am Arbeitsplatz aus) hinzugibt. Nach kurzer Rhrzeit mit einem Magnetrhrer werden dann folgende Proben hergestellt und in ein Head-Space Gef pipettiert:

l (mit Aromat) l (rein) Standardlsung

1. Aufstockung 2. Aufstockung 3. Aufstockung 4. Aufstockung 5. Aufstockung

1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

1,0 ml 0,8 ml 0,6 ml 0,4 ml 0,2 ml

0,0 ml 0,2 ml 0,4 ml 0,6 ml 0,8 ml

Danach erfolgt fr die fnf Aufstockungen die gleiche GC-MS Bestimmung, wie zu Beginn fr die mit Aromaten versetzte lprobe.

Auswertung: 1.) 2.) Stellen Sie die Analysenfunktion FE = F(cAromat [mg/2ml]) graphisch dar und erlutern Sie den Verlauf der Funktion. Berechnen Sie aus dem negativen Schnittpunkt der Regressionsgerade auf der Abzisse die Aromatenkonzentration des Speisels. 3.) Diskutieren Sie die von den identifizierten Aromaten aufgenommenen Massenspektren und ordnen Sie den intensittsreichsten Signalen die entsprechenden Fragmente zu. 4.) Welchen Vorteil besitzt das Aufstockverfahren gegenber der Kalibrierung?

Atom-Absorptions-Spektrometrie (AAS)
Bestimmung von Kupfer und Eisen in einer Wasserprobe Stichworte: Grundzustand, Atomisierung, Spektrallinien, Absorption, Hohlkathodenlampe,

Untergrundkompensation, Unabhngigkeit von Messungen, Verfahrenskenngren Durchfhrung: Am Beispiel des Absorptionsvermgens von Kupfer sollen die erreichbare Nachweisgrenze, die Reproduzierbarkeit und Standardabweichung des Verfahrens nach Kalibriergeradenund Leerwertmethode bestimmt werden. Am Beispiel von Eisen soll das Aufstockverfahren als alternatives Analysenverfahren untersucht werden. Folgende Randbedingungen werden eingestellt: Gert: Varian Spektra AA (ohne D2-Untergrundkorrektur) Trgergas: Luft (3.5 l/min) Brenngas: Acetylen (1.5 l/min) Multielementhohlkathodenlampe: Cu, Fe Lampenstrom: 5 mA (Cu), 5 mA (Fe) Spaltbreite: 0.5 nm (Cu), 0.2 nm (Fe) Wellenlnge: 324.8 nm (Cu), 248.3 nm (Fe) Die Einstellung der Gerteparameter am Spektrometer erfolgt durch den Assistenten! Kupfer Kalibrierverfahren: Ausgehend von der Fixanal-Lsung (10 g/l Cu) werden die folgenden 10 Verdnnungen hergestellt: lfd. Nr. 1 2 3 4 5 Konz. Kupfer 0,02 mg/l 0,03 mg/l 0,05 mg/l 0,10 mg/l 0,25 mg/l lfd. Nr. 6 7 8 9 10 Konz. Kupfer 0,5 mg/l 1,0 mg/l 2,0 mg/l 3,0 mg/l 5,0 mg/l

Alle Lsungen werden mit 0,65 %iger Salpetersure (10 ml 65 %ige HNO3 pro Liter) aufgefllt!!

Die Extinktion wird folgendermaen bestimmt: Die Leerwert-Lsung (0,65 % HNO3) wird vor jeder Messreihe einmal benutzt, um den Leerwert des Gertes (Autozero-Taste) auf 0,000 einzustellen. Die Extinktion jeder Kalibrierlsung wird fnfmal nach folgender Messreihe bestimmt, die die Unabhngigkeit der Messungen sicherstellt: Messreihe 1: Lsung 1 10 Messreihe 2: Lsung 1 10 Messreihe 3: Lsung 1 10 Messreihe 4: Lsung 1 10 Messreihe 5: Lsung 1 10 Im Anschluss nach jeder Messreihe wird die kupferhaltige, unbekannte Wasserprobe gemessen. Kupfer Leerwertmethode: Fr die Bestimmung der Nachweisgrenze nach der Leerwertmethode werden 10 Leerwert-Lsungen (0,65 % HNO3) neu hergestellt. Pro Leerwert-Lsung werden jeweils fnf Extinktionen bestimmt. Als Empfindlichkeit des Verfahrens wird die Steigung b vom Kalibrierverfahren bernommen. Eisen Additionsverfahren: Ausgehend von der Fixanal-Lsung (10000 mg/l Fe) wird eine Standardlsung von 10 mg/l Eisen hergestellt, wobei alle Lsungen mit 0,65 %iger Salpetersure aufgefllt werden. Dann werden in 4 Messkolben, Nennvolumen 50 ml, jeweils 25 ml der unbekannten Eisenprobe gegeben. In diese Messkolben werden folgende Volumina der Eisen-Standardlsung pipettiert: 0 ml, 5 ml, 10 ml und 15 ml. Die Messkolben werden anschlieend mit 0,65 %iger Salpetersure bis zur Marke aufgefllt. Als Blindwert-Lsung dient die 0,65 %iger Salpetersure. Die Zugaben von Eisen-Standardlsung ergeben folgende Eisengehalte: 0 ml 5 ml 10 ml 15 ml 0 mg/l 2 mg/l 4 mg/l 6 mg/l unbekannte Messlsung 1. Aufstockung 2. Aufstockung 3. Aufstockung

bezogen auf das eingesetzte Volumen der Messlsung von 25 ml. Die Verdnnung, die durch das Auffllen auf 50 ml bedingt ist, geht nicht in die Berechnung ein. Die Leerwert-Lsung (0,65 % HNO3) wird einmal benutzt, um den Leerwert des Gertes (AutozeroTaste) auf 0,000 einzustellen. Jede Messlsung mindestens dreimal messen. Auswertung: Kupfer 1.) Stellen Sie die Analysenfunktion Ext. = F(cCu [mg/l]) grafisch dar und erlutern Sie den Verlauf der Funktion. 2.) Berechnen Sie aus der Analysenfunktion die Kupferkonzentration der unbekannten Wasserprobe. 3.) Berechnen Sie die Standardabweichung des Verfahrens. 4.) Berechnen Sie die Nachweis-, die Bestimmungs- und Erfassungsgrenze des Verfahrens gem der Kalibriergeraden- und Leerwertmethode nach DIN 32645 (Mai 1994). Eisen 1.) Stellen Sie die Analysenfunktion Ext. = F(cFe [mg/l]) graphisch dar und erlutern Sie den Verlauf der Funktion. 2.) Berechnen Sie aus dem negativen Schnittpunkt der Regressionsgerade auf der Abszisse die Eisenkonzentration der unbekannten Wasserprobe. 3.) Welchen Vorteil besitzt das Aufstockverfahren gegenber der Kalibrierung?

Literatur: Wachter, G., Kleiner, J., Lernhardt, U., Statistik in der Analytischen Qualittssicherung Teil 1 bis 9", Chemie in Labor und Biotechik 49 (1998), 84-86, 128-132, 180-183, 217-220, 258-262, 297-299, 336341, 380-384, 421-424

Polarographie
Der Versuch: Ascorbinsure (Vitamin C) in flssigen Lebensmitteln wird durch oxidative differentiale Pulspolarographie sowohl mit dem Kalibrier- als mit dem Standardaufstock- verfahren bestimmt. Stichworte: Arbeits-, Gegen- und Bezugselektrode; Kapazittsstrom; Diffusionsstrom; Halbstufenpotential; Gleichstrom- und Pulspolarographie; polarographische Auswerteverfahren; IlkoviGleichung; Matrixeffekte; Entgasen von Lsungen Literatur: (Theorie) 1. D. A. Skoog und J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer, Berlin, 1996, S. 515-525, 576-588, 592-603 2. Harris, Daniel C., Lehrbuch der Quantitativen Analysis, Vieweg, Braunschweig, 1998, S. 572577, 601-625 3. Schwedt, G., Analytische Chemie, Thieme, Stuttgart, 1995, S. 146-159 Gebrauchte Reagenzien:
1. Eine ca. 0,1 %ige Oxalsure-Lsung (ca. 1 g in 1 L Reinstwasser). 2. Eine Standardlsung von 100,0 mg Ascorbinsure in 100,0 mL Oxalsure-Lsung. Die Ascorbinsure wird in einem 100-mL-Messkolben in wenig 0,1 %iger OxalsureLsung gelst und auf die Marke aufgefllt. 2. Leitelektrolyt, pH ca. 4,5: Ammoniumacetat (3,85 g) und Eisessig (3 mL) in einem 500-mL-Messkolben werden mit der 0,1 %igen Oxalsure auf die Marke aufgefllt.

Vorsicht: Quecksilber und seine Salze sind hochgiftig. Sie sind in die dafr vorgesehenen Behlter zu geben. Nie in den Abguss! Probenvorbereitung: Normaler Fruchtsaft braucht keine Vorbereitung, auer Filtrieren und eventueller Verdnnung, um eine Endkonzentration im Polarographiegef von 0,5 bis 5 mg/20 mL zu erhalten. Limonade muss mittels Ultraschall von Kohlensure befreit werden. Gerte Parameter: Folgende Parameter sind beim Metrohm 646 VA schon eingestellt. Startpotential: ca. 150 mV Endpotential: ca. + 100 mV Potentialschritte: 4 mV Stromachse: 0 bis 1,6 10-6 A

Durchfhrung
Der Metrohm 646 VA-Prozessor ist vorprogrammiert fr beide Bestimmungen. Die Bedienung des Instruments ist unten beschrieben. 1. Das Kalibrierverfahren In ein Polarographiegef werden 20,0 mL Leitelektrolyt und 0,1 mL Kalibrierlsung gegeben. Die im Instrument gespeicherte Methode 10 wird dann aufgerufen und durchgefhrt: Auf der ersten Dialogseite (PAGE 1) wird die Methode mit der Tastenfolge me10 Eingabe () aufgerufen. PAGE 4 der Methode 10 erscheint auf dem Bildschirm. Mit der Tastenkombination ne wird die Dialogseite PAGE 7 erreicht. Die Anzeige blinkt READY. Mit der Taste START wird das Programm gestartet. Gleich danach wird die Taste HOLD gedrckt, um das Programm anzuhalten. ber die nchsten fnf Minuten wird die Lsung mit Stickstoff gesplt (warum?). Die Taste Start wird erneut gedrckt, das Programm luft von sich jetzt weiter.

Im Programm ist vorgesehen, dass zwei Polarogramme fr jede der drei Lsungen aufgenommen werden. Erst danach wird das Messprotokoll mit Kurven und berechneten Werten (Strme) ausgedrckt. In das Polarographiegef wird noch 0,1 mL Kalibrierlsung gegeben und unter den gleichen Bedingungen erneut polarographiert. Insgesamt werden fnf solche Kalibriermessungen durchgefhrt, jedes Mal mit Stickstoffsplung. Im Anschluss werden in ein sauberes Polarographiegef wieder 20,0 mL Leitelektrolyt sowie 0,5 mL des CO2-freien Fruchtsafts vorgelegt. Das Programm wird wie vorher ablaufen lassen. Bei diesem Verfahren berechnet der Computer keine Konzentration fr die unbekannte Probe.

2. Das Standardaufstockverfahren In ein sauberes Polarographiegef werden wieder 20,0 mL Leitelektrolyt sowie 0,5 mL des CO2-freien Fruchtsafts vorgelegt. Die im Instrument gespeicherte Methode 9 wird dann wie beim Kalibrierverfahren aufgerufen und gestartet. Das Programm und die zweimalige Aufnahme des Polarogramms laufen wie vorher ab. Danach erscheint diesmal allerdings die Anzeige ADD auf dem Bildschirm.

An dieser Stelle werden 0,05 mL der Kalibrierlsung hinzugegeben und die Lsung noch ca. 1 Minute mit Stickstoff gesplt. Nach Drcken der START-Taste wird das Polarogramm zweimal aufgenommen. Bei diesem Verfahren wird das Protokoll noch nicht ausgedrckt. Es werden zuerst wieder 0,05 mL der Kalibrierlsung hinzugegeben und das Polarogramm nach drcken der START-Taste noch zweimal aufgenommen. Danach ist das Programm zu Ende. Das Protokoll mit Konzentration der unbekannten wird automatisch ausgedrckt. Probe

Auswertung
Aus den erhaltenen Werten beider Verfahren wird der Gehalt an Ascorbinsure in der Fruchtsaft-probe berechnet. Der Computer druckt Ergebnisse nur fr das Kalibrierverfahren aus. Er geht davon aus, dass die Kalibrierlsung aus genau 100,0 mg Ascorbinsure / 100,0 mL Wasser besteht. Wenn nicht genau 100,0 mg Ascorbinsure abgewogen wurden, muss die Abweichung bercksichtigt werden. Beim Kalibrierverfahren stellen Sie eine Kalibriergerade durch lineare Regression auf (Sie haben zwei Messpunkte fr jede Konzentration). Die Konzentration der Ascorbinsure im Fruchtsaft wird daraus berechnet. Beim Standardaufstockverfahren wird auch eine Gerade durch lineare Regression erstellt (Sie haben jetzt nur sechs Messdaten). Die Konzentration der Ascorbinsure im Fruchtsaft wird durch den negativen Achsenschnitt gegeben. Sie sollten dasselbe bekommen, wie der Computer.

Auswertung frs Protokoll

Das Protokoll zu diesem Versuch sollte alle oben angegebene Stichworte erklren und dazu folgendes enthalten: Eine Einleitung: Beschreibung des Aufbaus einer polarographischen Messzelle Prinzipien der Polarographie das Polarographie-Verfahren, das hier angewendet wird Die Messergebnisse: vollstndige numerische Daten angehngte Polarogramme und ausgedrckte Ergebnisse Berechnungen des Ascorbinsuregehlts des Fruchtsaftes nach beiden Methoden Diskussion: Vergleich der beiden Ergebnisse Schwierigkeiten des Versuchs Abweichungen der Ergebnisse vom Erwarteten

Dnnschichtchromatographie (DC, engl. TLC)

Stichworte: Rf -Wert, Laufmittel, Polaritt, eluotrope Reihe, Umkehrphase, zweidimensionale Entwicklung, Visualisieren (Detektion), Computergesteuerte Auswertung einer DC-Platte

Teil 1: Eluotrope Reihe

Der Einfluss von Laufmittelpolaritt auf den Rf-Wert wird untersucht. Normalphasen- und Umkehrphasendnnschichtplatten werden verglichen. Aufgabe: 1.1. Auf jede von zwei Kieselgel-60-Dnnschichtplatten (5 10 cm) wird ein leichter Bleistiftstrich (auf der kurzen Seite, ca. 1,2 cm vom unteren Rand) gezogen. Zwei Startpunkte werden auf der Linie markiert. Auf jede Platte werden 1) Resorcin und 2) der Methylester von pHydroxyphenylessigsure (je 2 L) aufgetragen. Die Platten werden mit Di-iso-propylether ( = 0,28) und Ethylacetat ( = 0,58) entwickelt. 1.2. Auf derselben Weise werden auf drei RP-18-Platten Thymolblau und Thymolphthalein (je 2 L) aufgetragen. Die Platten werden mit Methanol ( = 0,95), 2:1 Methanol/Wasser ( bei Wasser ist sehr gro), sowie 1:1 Methanol/Wasser entwickelt. Dieser Teil ist relativ langsam. Warum?

Das Trocknen der Platten wird immer im Abzug durchgefhrt.

Teil 2: Retentionsverhalten und Trennung von Analyten

Die Phenole in einer unbekannten Mischung sollen anhand ihres Retentionsverhaltens identifiziert werden; dazu wird sowohl die ein- als auch die zweidimensionale Entwicklungstechnik angewendet. Die reinen Phenole (Brenzkatechin, Resorcin, 2,5-, 2,6- und 3,4-Xylenol und der Methylester von p-Hydroxyphenylessigsure) in Di-iso-propylether dienen als Vergleich.

Aufgabe: 2.1. Eindimensionale Entwicklung: Auf je zwei Kieselgel-60-Dnnschichtplatten (10 10 cm) wird ein leichter Bleistiftstrich ca. 1 cm vom Rand gezogen. Ca. 1,5 cm vom linken Rand beginnend werden acht Punkte mit 1-cm-Abstand markiert. Auf jede Platte werden die sechs reinen Phenole, eine Mischung dieser sechs und eine unbekannte Mischung getragen (je 2 L); eine Platte wird mit Dichlormethan, die andere mit Di-iso-propylether entwickelt. 2.2. Zweidimensionale Entwicklung: An einer Ecke einer dritten Platte (ca. 1,2 cm von beiden Rndern) wird das Gemisch der sechs Phenole (2 L) getragen. Diese Platte wird zuerst mit Dichlormethan, dann nach dem Trocknen in die andere Richtung mit Di-iso-propylether entwickelt. Eine Platte mit der unbekannten Probe wird auch zweidimensional chromatographiert.
Teil 3: Detektion:

Verschiedene Methoden zur Visualisierung der Substanzflecke werden untersucht (z. T. Demoversuch). Teil 3.1. Die Flecke sind schon sichtbar. Teil 3.2. Chemische Reaktion: Die Phenole werden durch Besprhen zuerst mit 0,1 M NaOH dann mit diazotierter p-Nitroanilin-Lsung sichtbar gemacht.
Das Besprhen der Platten wird immer im Abzug durchgefhrt.

Herstellung der diazotierten p-Nitroanilin-Lsung: Die Stammlsung von p-Nitroanilin (ca. 440 mg p-Nitroanilin in 100 ml 1 M HCl wird, wenn notwendig, am ersten Praktikumstag hergestellt; sie ist stabil. Fr das Reagenz werden ca. 5 ml dieser Stammlsung mit Wasser auf ca. 30 ml verdnnt. Dazu werden, kurz bevor die erste Platte zu besprhen ist, ein paar Milliliter einer NaNO2Lsung (5 g in 100 ml) gegeben (Entfrbung beim Rhren). Die diazotierte Lsung ist einige Stunden haltbar. Teil 3.3. Die Fluoreszenz der DC-Platten oder der Substanzen selber macht gewisse Analyten unter UV-Licht sichtbar.

Aufgabe: Auf eine Kieselgel-60-Dnnschichtplatte (5 10 cm) werden eine Anthracen- und zwei Tetralinproben aufgetragen (je 2 L). Der Abstand der Startflecke voneinander sollte ca. 1 cm sein. Nachdem die Platte sich in Hexan entwickelt hat, wird sie unter UV-Licht bei 350 nm und 254 nm beobachtet. Teil 3.4. Die Platte aus Teil 3.3. wird dann in die Jodkammer gestellt.

Teil 4: Halbquantitative DC-Analyse mit Computerauswertung

Am Beispiel von Resorcin wird der Einfluss von der Menge an aufgetragenem Analyt auf den RfWert und die Gre des Substanzflecks untersucht. Aufgabe: Eine Kieselgel-60-Dnnschichtplatte (10 10 cm) wird mit einer Startlinie ca. 1,2 cm vom unteren Rand versehen. Fnf Startpunkte mit hnlichem Abstand (mindestens 1,5 cm vom Plattenrand und von einander) werden auf der Linie markiert. Eine Stammlsung von 30 mg Resorcin in 25 ml Di-iso-propylether wird verdnnt, um eine Eichreihe mit fnf Konzentrationen herzustellen. (Die Verdnnungsreihe 0,24 bis 2,4 g/mL drfte schon vorhanden sein.) Von diesen Lsungen werden je 2 l auf die Startpunkte der Dnnschichtplatte aufgetragen. Die Platte wird mit Di-iso-propylether entwickelt, die Detektion erfolgt wie in Teil 3.2 Ein Bild der DC-Platte wird mittels eines handelsblichen Scanners aufgenommen und die Lichtabsorption der fnf Flecke vom Computer ausgemessen. Der genaue Ablauf dieses Schritts wird sich nach Entwicklungsstadium des Computerprogramms DCSCAN variieren, eine Vorschrift fr die jetzige Version wird ausgegeben.

Literatur:
1. F. Dietz, J. Traud, P. Koppe und C. Rbelt, Systeme fr die Identifizierung von Phenolen mittels DC Chromatographia 9 (1976) S. 380-396

2. E. Hahn-Deinstrop, Dnnschicht-Chromatographie, Wiley-VCH, Weinheim, 1998 3. D. A. Skoog und J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer, Berlin, 1996, S. 714-719
Computerauswertung der DC-Platten von Teil 4

Die DC-Platte aus Teil 4 wird in den Computer eingescannt. Der Scanner misst, wie viel rotes, blaues und grnes Licht an jeder Stelle auf der Oberflche absorbiert wird, und gibt die Werte an den Computer weiter. 1. Die DC-Platte wird dazu auf eine Schablone so gelegt, dass die Flecke untereinander (vertikal) liegen; die Schablone schtzt den Scanner vor Chemikalien, dient zur Positionierung der Platte (so dass immer dieselbe kleine Flche aufgenommen werden muss) und enthlt auch einen Weistandard, den der Scanner braucht, um eine Basislinie zu erzeugen. Unsere Flecke sind gelb, d. h., sie absorbieren bevorzugt blaues Licht; wir knnen die Flecke deshalb am besten untersuchen, wenn wir die Absorption des blauen Lichts bewerten. 2. Der Scanner wird gestartet. Fr den Scanner HP Scanjet 2300c wird das Programm HP Director vom Desktop eingeschaltet. Aufnahme/Scannen vom Men whlen. Das Aufwrmen der Lampe dauert etwas. Wenn der Scanner bereit ist, wird eine Vorschau von sich gemacht. Der erwnschte Bereich wird ausgewhlt and Akzeptieren angeklickt. 3. Ein richtiges Bild von der Platte wird eingescannt. Das Bild wird aber als Scannen.jpg gespeichert. Das Programm zeigt alle gespeicherte Bilder. Markieren Sie das neue und rufen Sie es mit Doppelklick auf. Mit DATEI, SPEICHERN UNTER speichern sie das eingescannte Bild in Bitmap-Format (Name.BMP) unter dem Namen eines der Studenten in der Gruppe: z.B. SCHMIDT.BMP. Das Bildbearbeitungsprogram darf jetzt geschlossen werden. 4. ffnen Sie das DC-Bearbeitungsprogramm DCSCAN.exe, in dem sie auf dem Desktop darauf klicken. 5. Rufen Sie das gespeicherte Bild auf: DATEI, FFNEN, dann auf den Studentennamen klicken. 6. Das Bild wird mit den Scrollbars so zentriert, dass die gelben Flecke sichtbar sind. Wenn Sie den Cursor auf das Bild tun und mit der Maustaste klicken, erscheint eine senkrechte Linie. Stellen Sie sich vor, Sie wollen eine Sule mit zwei solchen Linien bilden, um alle Flecke einzuschlieen: klicken Sie einmal links und einmal rechts der Flecke, um diese Sule zu bilden. Schauen Sie, dass alle Flecke zwischen den senkrechten Linien liegen.

7. Jetzt wird die Absorption der Flecke automatisch ausgemessen. Angenommen, Sie haben eine Sule mit einem Fleck darin. Sie sieht wie in Abb. a aus. Der Scanner hat diese Sule in viele enge Banden geteilt, wie in Abb. b, und die gesamte Absorption in jedem Band gemessen, wie in Abb. c. (Der Scanner macht natrlich viel mehr Banden, als hier angezeigt, die Peaks sind dann ziemlich Gaufrmig.) Diese Absorptionen werden in eine Datei gespeichert und als eine neue Art von Chromatogramm abgebildet, wo die X-Achse Distanz und die Y-Achse Absorption AUSWERTEN Weil unsere Sule fnf Flecke enthielt, sehen Sie ein Chromatogramm mit fnf Peaks. darstellt. RECHNEN, (auf Blau klicken)

Computerauswertung der DC-Platten von Teil 4

8. Mit R-O-KURVE, GLTTUNG wird das Rauschen z. T. unterdrckt. 9. Rufen Sie das Protokollfenster auf: DATEI, PROTOKOLL ANZEIGEN. 10. Jetzt werden die Peakhhen und flecke ausgemessen. Gehen Sie mit dem Cursor auf die Basislinie links des ersten Peaks und klicken Sie. Es erscheint eine vertikale, rote Linie. Tun Sie dasselbe rechts des Peaks. Jetzt sind sowohl eine zweite vertikale Linie als eine Basislinie fr die zu messende Flche zu sehen. Die Peakhhe und die Flche werden im Protokollfenster (Integration) gezeigt. Dieser Vorgang wird fr jeden Peak wiederholt. Das Protokollfenster zeigt alle Werte an. 11. Drucken Sie die Ergebnisse aus: DATEI, PROTOKOLL DRUCKEN. 12. Drucken Sie das Chromatogramm aus, mit Rechtsklicken auf das Bild selbst, dann DRUCKEN.
Auswertung frs Protokoll:

Die Antworten zu den Fragen, die am Ende stehen (eventuell korrigiert!), sollten mit dem Protokoll abgegeben werden. Teil 1: Die Rf-Werte der Flecke werden abgemessen und anhand der Eluotropenreihe diskutiert. Teil 2: 1. Bestimmen Sie den Rf-Wert jeder Komponente fr jeden Trennungsschritt. Die Trennung ist in diesem Teilversuch nicht wichtig, ignorieren Sie eventuelle Flecke von Verunreinigungen. 2. Vergleichen Sie die Stellung der Laufmittel Di-isopropylether und Dichlormethan in der eluotropen Reihe. Wie erklren Sie die Rf-Werte Ihrer Phenole mit den beiden Laufmitteln? 3. Identifizieren Sie die Phenole in Ihrer unbekannten Mischung anhand der Rf-Werte, und begrnden Sie die Elutionsreihenfolge auf die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften der Phenole. Vgl. den Artikel von F. Dietz et al. (1976). Wenn die von Ihnen abgemessenen

Rf-Werte von denen in der Literatur abweichen, bieten Sie eine Erklrung dafr an. 4. Welche Reaktion luft hier bei der Detektion ab? Schreiben Sie einige Strukturen. 5. Wie effektiv ist die Trennung, wenn nur Di-iso-propylether oder Dichlormethan als Laufmittel eindimensional verwendet wird? 6. Skizzieren Sie eine zweidimensionale DC-Trennung der sechs Phenole dieses Versuchs, wenn zuerst mit Di-iso-propylether, dann mit Dichlormethan entwickelt wird. 7. Wie drfte man durch HPLC oder Sulenchromatographie bei Einsatz einer Kieselgelsule eine brauchbare Trennung dieser Komponenten erzielen? Teil 3: Diskutieren Sie die verschiedenen Methoden zur Visualisierung, die Sie benutzt oder beobachtet haben. Fr welche Substanzklassen gelten sie? Teil 4: 1. Welche absoluten Mengen an Resorcin wurden hier auf die DC-Platte aufgetragen? 2. Wie ndert sich der Rf-Wert mit der aufgetragenen Substanzmenge? 3. Begrnden Sie eventuelles Tailing bzw. Fronting der Flecke. 4. Dnnschichtchromatographie wird nicht nur fr analytische Zwecke eingesetzt, sondern auch fr prparative Trennung. Beschreiben Sie, wie das geschieht. 5. Ihr Protokoll sollte eine ungefhre Beschreibung der computergesteuerten Auswertung enthalten. 6. Versuchen Sie, eine einfache Eichfunktion zwischen der aufgetragenen Substanzmenge und der Fleckengre (Flche, Lichtabsorption, usw.) zu erstellen. 7. Berechnen Sie anhand eines Ihrer Chromatogramme die Anzahl von theoretischen Bden (vgl. Skoog und Leary), den Retentionsfaktor und den Kapazittsfaktor.

Kontrollfragen
Sie haben die Vorlesungen ber Chromatographie gehrt. Bevor Sie die Versuche dazu unternehmen, sollten Sie in der Lage sein, folgende Fragen zu beantworten. Jeder Praktikant hat die Antworten schriftlich vor dem Versuch extra abzugeben. 1. Ist Kieselgel als polar oder unpolar einzustufen? Was bringt diese Eigenschaft, chemisch betrachtet? 2. Wie heit die Reihenfolge der Laufmittel nach Elutionskraft? Wie polar ist Wasser im Vergleich mit den meisten organischen Laufmitteln? Wie macht man Wasser noch polarer?

3. 4.

Welche Wenn

Laufmittel Sie

eluieren

adsorbierte auf

Analyten Kieselgel

weiter mit

auf

Kieselgel organischen

polarere Laufmittel

Laufmittel oder weniger polare? Erklren Sie, warum. mehrere Analyten einem trennen, welcher Analyt hat den grten Rf -Wert die polarste Substanz oder die am wenigsten polare? 5. Was bedeutet Umkehrphase? Beschreiben Sie diese Phasen chemisch und nach ihrer Polaritt. 6. Welche Laufmittel eluieren absorbierte Analyten weiter auf Umkehrphasen polarere Lsungsmittel oder weniger polare? Erklren Sie, warum. 7. Wenn Sie mehrere Analyten auf Umkehrphasen mit einem organischen Laufmittel trennen, welche Substanz hat den grten Rf -Wert die polarste Substanz oder die am wenigsten polare? 8. Warum entwickelt man zweidimensional?

Spektrophotometrie
Die Wirkung vom pH-Wert auf das Gleichgewicht von Chromat/Dichromat wird anhand von Spektren im sichtbaren und UV-Bereich untersucht. Mittels Messungen der Extinktion (Absorbanz) am Extinktionsmaximum bei verschiedenen Konzentrationen und in Kvetten unterschiedlicher Lnge wird das Lambert-Beersches Gesetz verifiziert. Stichworte (Kolloq im Voraus): UV- und sichtbares Licht, Nah-UV, Vakuum-UV, usw., Quarz, optisches Glas, Lichtquellen, Wechselwirkung von Materie mit Licht verschiedener Energien, LambertBeersches Gesetz, Additivitt von Extinktionen, isosbestischer Punkt, Gleichgewichtskonstante, Grenzkonzentration, Aktivitt

1 Herstellung der gebrauchten Stammlsungen. Gut geschlossen sind alle drei ber zwei bis drei Wochen stabil. Alle werden mit entgastem VE-Wasser hergestellt (warum?). 1.1 Eine Stammlsung von Cr(VI) (20 mg/L, als Chrom, nicht als Chromat) wird ausgegeben. 1.2 Stammlsung von 0,1-M-NaOH: Titrisol-Ampullen sollten vorhanden sein. Der Inhalt wird auf genau ein Liter verdnnt und in einer Kunststoffflasche aufbewahrt. 1.3 Stammlsung von 0,1 M Essigsure: wenn keine Titrisol-Ampullen da sind, wird jeweils ein Liter Lsung durch Verdnnung von konz. Essigsure hergestellt.

2 Wirkung vom pH-Wert auf das Chromat/Dichromat-Gleichgewicht 2.1 Es werden elf Messlsungen folgender Zusammensetzung in 50-mL-Messkolben hergestellt. Jeder Kolben bekommt 15 mL einer Lsung von 20 mg Cr(VI)/L (15-mL-Vollpipette) und 5 mL 0,1 M NaOH (5 mL Vollpipette oder schneller mit Eppendorf). Dazu kommen unterschiedliche Volumina von 0,1 M Essigsure: 0,0; 2,0; 4,0; 5,0; 5,2; 5,3; 5,4; 5,6; 6,0; 8,0; 10 mL Entgastes VE-Wasser ad 50 mL 2.2 Die UV/VIS-Spektren der elf Messlsungen in 10-mm-Kvetten (Quarz oder optisches Spezialglas OS) werden nach steigender Konzentration an Essigsure mit einem registrie-renden Spektrophotometer (zurzeit Specord 205 von Analytik Jena) im Wellenlngenbereich 330 550 nm aufgenommen. Als Vergleichslsung wird VE-Wasser eingesetzt. Die Spektren werden zuerst extra dann bereinander (berlappend) registriert. Eine Tabelle mit allen Extinktionswerten wird fr Excel gespeichert. 2.3 Die Spektren mit der Essigsurezugabe 0,0 bzw. 10 mL sollten denen der reinen Chromat- bzw. Dichromatlsung entsprechen.

3 Wirkung der Konzentration (c) auf die Extinktion 3.1 Es werden zehn Lsungen folgender Zusammensetzung in 50-mL-Messkolben hergestellt: 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 40 mL einer Lsung von 20 mg Cr(VI)/L Jeder Kolben bekommt 5 mL 0,1 M NaOH und entgastes VE-H2O ad 50 mL. 3.2 Die Extinktion fr jede dieser basischen Lsungen wird am Extinktionsmaximum (vgl. Teil 2.3) dreimal gemessen. Als Vergleichslsung wird entgastes VE-Wasser eingesetzt. Keine weiteren Spektren werden aufgenommen. Die Messwerte werden in einer Datei gespeichert. 4 Wirkung der Absorptionsstrecke 4.1 Wenn nicht vorhanden wird folgende Lsung hergestellt. 20 mL der Lsung von 20 mg Cr(VI)/L 20 mL 0,1 M NaOH Entgastes VE-Wasser ad 200 mL 4.2 Die Extinktion dieser Chromatlsung (2 mg Cr(VI)/L) in Glaskvetten von verschiedenen Schichtlngen wird bei max aufgenommen. So viele Kvetten werden genommen, wie wir sie haben, solange sie derselben Sorte (Quarz, OS, OG) sind. Diese Messwerte werden auch in einer Datei gespeichert.

5 Auswertung 5.1 Zu jedem Protokoll gehren ein einleitender Theorieteil (fr diesen Versuch zwei bis drei Seiten) sowie eine abschlieende Diskussion. Der Theorieteil muss in Ihren eigenen Worten sein, nicht etwas, das Sie aus dem Internet oder aus Datenbanken kopiert haben. Ihre Quellen dafr sind anzugeben. 5.2 Tragen Sie die in Teilen 3.2 und 4.2 gemessenen Extinktionen gegen die Konzentration sowie gegen die Schichtdicke auf. Berechnen Sie bei beiden Teilen lineare Regressionen. Bestimmen Sie anhand beider Datenstze den Extinktionskoeffizienten. Kommentieren Sie bei der abschlieenden Diskussion die Linearitt der Messungen bei der Konzentrationsreihe und erklren Sie, ob es hier zu Abweichungen vom Lambert-Beerschen Gesetz gekommen ist. 5.3 Berechnen Sie die Konzentrationen von Chromat, Dichromat und H+ in allen Lsungen der pH-Reihe in Teil 2.1. Benutzen Sie Messungen bei zwei Wellenlngen fr die Berechnung dieser Konzentrationen. (Sie kennen die max-Werte aus den Spektren der Lsungen von reinem Chromat bzw. Dichromat. Vergessen Sie nicht dabei die Stchiometrie des Chromat/Dichromatgleichgewichts.) 5.4 Berechnen Sie im pH-Bereich, wo erhebliche Anteile von Chromat sowie Dichromat vorliegen, die Gleichgewichtskonstante fr Chromat/Dichromat.

5.5 Jetzt unter Bercksichtigung der Aktivitt berechnen Sie die Gleichgewichts-konstante wieder. Die Debye-Hckel-Formeln fr Aktivittskoeffizienten gelten nicht in diesem hohen Konzentrationsbereich, Sie mssen Aktivittskoeffizienten fr H+, Chromat und Dichromat aus Tabellen nehmen (nehmen Sie an, fChromat = fDichromat). Vgl. Harris (engl. Version, 1995), S. 188. 5.6 Kommentieren Sie bei der abschlieenden Diskussion eventuelle Abweichungen oder Diskrepanzen in Ihren Ergebnissen. Vergleichen Sie Ihre Werte fr max sowie fr K mit Angaben der Literatur. 5.7 Beobachten Sie isosbestische Punkte bei Ihren Spektren? Was sagen solche Punkte aus? Vergessen Sie die Stchiometrie in Ihrem Spezialfall nicht.

6 Bedienung des Specord 205 UV-VIS-Spektrophotometers von Analytik Jena 6.1 Aufnahme der Spektren der Proben der pH-Reihe 6.1.1 Vom Desktop das Programm WinAspect ffnen 6.1.2 Oben im Men: Messung---Gertinitialisieren Es dauert einen Moment. Die Parameter, die erscheinen, sind die Defaultparameter, nicht die, die man fr den Versuch braucht. 6.1.3 Messung---Parametersatz auswhlen pH-Reihe whlen 6.1.4 VE-Wasser in OS 1000-Kvetten in beide Kanle des Spectrophotometers stellen. Die Kvette hinten wird whrend aller Messungen dort bleiben. Auf Referenz rechts im Messung-Men klicken. Das macht einen Ausgleich der beiden Kanle. Das Referenzspektrum wird in Echtzeit gezeigt. 6.1.5 Die Messprobe in einer OS 1000-Kvette in den Kvettenhlter vorne ganz rechts einstellen. Die Beschriftung auf den Kvetten sollte immer auf derselben Seite stehen. 6.1.6 Messung---Start Messung Das Spektrum der Messprobe wird aufgenommen und in Echtzeit gezeigt. 6.1.7 Datei---Speichern als Jede Gruppe hat Ordner unter den drei Teilversuchen fr sich.
Desktop Arbeitsplatz Lokaler Datentrger Instru Daten Gruppe 1 usw. pH-Reihe Geben Sie ihrer Probe einen Namen, der sie tatschlich beschreibt, so wie 0 mL Sure oder, wenn das Spektrum wiederholt werden muss, 0 mL Sure-2

6.1.8 Jetzt mssen Sie alle Spektren dieser Reihe auf einem Bild darstellen, also Datei---berlagern 6.1.9 Unter Zieldatei einen Namen wie Alle Spektren pH eintragen. Dann im selben Fenster Hinzufgen klicken und die gespeicherten Spektren auswhlen. Mehrere knnen gleichzeitig ausgewhlt werden. OK

6.1.10 Jetzt haben Sie ein Fenster mit den berlagernden Spektren. Das Bild kann auf den vollen Bildschirm expandiert werden, und die einzelnen Spektren knnen ihre eigene Farbe bekommen. Drucken Sie jetzt das Bild. Datei---Drucken Querformat whlen. 6.1.11 Whlen Sie Tabelle. Sie haben eine groe Tabelle, eventuell elf Spalten mit 210 Zeilen. Zur spteren Bearbeitung als Excel-Datei mssen Sie die Daten anders speichern. Datei---Export--ASCII Sie brauchen wieder einen Namen, der allerdings derselbe sein darf wie der von den berlagernden Spektren: wie Alle Spektren pH Der Computer bittet um Eingaben: Absorption---Komma---4 Dezimalstellen 6.1.12 Die Excel-Tabelle wird im selben Ordner sein, wie all Ihre Daten zur pH-Reihe. Alle Dateien knnen jetzt auf z.B. einen Speicherstick bertragen werden. Alternativ drfen Sie sich die Daten als Email-Attachments schicken. 6.2 Messung der Extinktionen der Proben der Konzentrationsreihe und jener mit unterschiedlichen Kvettenlngen 6.2.1 Die Prozedur dieser beiden Teilversuche ist gleich; es spielt keine Rolle, welchen Parametersatz sie aufrufen, Kvettenlnge oder Konzentrationsreihe. Jede Messung wird extra in eine Tabelle aufgenommen, und die Tabelle wird in der Ordner Ihrer Gruppe unter den entsprechenden Teilversuchen gespeichert. 6.2.2 Alle Proben dieser Reihen sind basisch, also haben Sie nur Chromat vorhanden. Aus der Tabelle mit den Extinktionswerten fr das Spektrum der Lsung mit der Essigsurezugabe 0,0 mL im Teil 1 wird die Wellenlnge beim Extinktionsmaximum genommen. Der neue Parametersatz sollte diese Wellenlnge schon gespeichert haben. 6.2.3 Vom Desktop das Programm WinAspect ffnen 6.2.4 Oben im Men: Messung---Gertinitialisieren 6.2.5 Messung---Parametersatz auswhlen Kvettenlnge whlen 6.2.6 Messung---Parametersatz Einstellen Allgemein Zyklus: kein Anzeige: Absorption Korrektur: Referenz Modus Messmodus: Wellenlngen: 372 nm steht da; falls das nicht Integrationszeit: 1,0 Sekunde OK richtig ist, dann die richtige Wellenlnge eingeben (ndern)

6.2.7 VE-Wasser in OS 1000-Kvetten in beide Kanle des Spectrophotometers stellen. Die Kvette hinten wird whrend aller Messungen dort bleiben. 6.2.8 Messung---Referenz 6.2.9 Messung---Serienmessung 6.2.10 Bearbeiten---Einstellungen---Proben Probenzahl auf 50 ndern Probentabelle whlen 6.2.11 Start Die Messproben werden nacheinander eingesetzt. Jedes Mal auf OK klicken. Es dauert jedes Mal ein paar Sekunden. Die Absorptionen werden in einer Tabelle gespeichert, die hinter dem Nchste Probe-Fenster steht. 6.2.12 Wenn alle Proben der Reihe, Kvettenlnge oder Konzentrationsreihe aufgenommen wurden, wird die Tabelle gespeichert. 6.2.13 Die Tabelle wird dann in Dokumentform umgewandelt und als ASCII-Datei gespeichert: In Dokument. Wie in Teilen 6.1.11 -6.1.12 oben. 6.2.14 Beenden

Hochleistungs-Flssigkeits-Chromatographie (HPLC)
Aufgaben: Das Retentionsverhalten verschiedener polycyclischer aromatischer Kohlen-wasserstoffe soll mittels HPLC ermittelt und anschlieend quantifiziert werden. Stichworte: Aufbau einer HPLC-Anlage; Entgasen von Eluenten; Detektoren; NP-, RPChromatographie; Sulenmaterialien; fast-, micro-bore, narrow-bore HPLC; Bodenhhe, -zahl; Peakbreite Sule: Merck ODS Lnge 250 ID 4 mm, 5 - Eluent: Methanol 100 %

- Eluentenfluss: 1 ml/min - Detektor: UV, bei 254 nm; Thioharnstoff 240 nm - Integrator Attenuation 5 - Chart Speed 5 mm/min, Ausnahme Aromatenmischung !
Im ersten Teil des Versuches soll eine Mischung der Verbindungen Pyren, 1-Methylnaphthalin, Fluoranthen, Toluol und Phenanthren dreimal injiziert werden. Weichen die ermittelten Retentionszeiten bei der Dreifachinjektion zu stark voneinander ab, ist eine weitere Injektion erforderlich! Das Chromatogramm kann bei einem Chart-Speed von 10,0 erneut ausgedruckt werden, falls die einzelnen Peakzeiten nicht genau gelesen werden knnen. Zur Bestimmung der Totzeit wird Thioharnstoff dreimal injiziert. (=240 nm). Die Totzeit wird auch ber die Injektion von homologen aromatischen Kohlenwasserstoffen bestimmt. Dazu wird die Lsung, welche Ethylbenzol, Butylbenzol und Hexylbenzol enthlt, dreimal injiziert. Nach jeder Injektion der Aromatenmischung wird folgender Schritt durchgefhrt: Wurde das Chromatogramm fehlerfrei aufgenommen, wird der Chartspeed auf 60 mm/min gestellt (Chartspeed-Wert-Enter), die Plotattenuation so gewhlt, dass die Peaks nicht anschlagen (Plottatt-Wert-Enter) und durch Drcken von Recalc ein neuer Chromatogrammausdruck erstellt. Im zweiten Teil des Versuches soll die Konzentration der Mischung aus dem ersten Teil quantifiziert werden. Hierzu muss eine Eichgerade von derselben Mischung mit bekannter Konzentration erstellt werden. Jede der Mischungen wird hierzu ebenfalls dreimal vermessen. Das Chromatogramm kann bei einem Chart-Speed von 10,0 erneut ausgedruckt werden, falls die einzelnen Peakzeiten nicht genau gelesen werden knnen.

Auswertung: a) Ordnen Sie jeder der 6 Verbindungen des ersten Versuchsteils die entsprechende Retentionszeit aufgrund ihrer Struktur zu. b) Bestimmen Sie die Standardabweichungen der gemessenen Zeiten fr jede Substanz. c) Ermitteln Sie die Totzeit der beiden Sulen nach folgenden drei Methoden: Begrnden Sie die Unterschiede der nach den verschiedenen Verfahren bestimmten Totzeiten. Wie wrden sich die Retentionszeiten ndern, wenn Sie eine Sule der Dimensionen 250 x 2 mm ID, 5 verwenden wrden? - Berechnung der Totzeit aus der equidistantiellen Reihe erfolgt ber:

td

2 t1 t3 t2

t1 + t3 2t2

- Bestimmung ber Thioharnstoff - Berechnung aus Sulenabmessungen und Flssen d) Berechnen Sie die Packungsdichte der Sule e) Berechnen Sie die Zahl und Hhe der theoretischen Bden der drei Aromaten fr die Sule. Diskutieren Sie die unterschiedlichen Bodenhhen in Abhngigkeit von der Substanz. f) Berechnen Sie Stoffkonzentration der Mischung fr jede Substanz mittels einer Eichgeraden.

High Performance Ionenchromatographie (HPIC)

Aufgaben: Mit Hilfe der Ionenaustauschchromatographie sollen verschiedene Anionen in Wasserproben untersucht werden Stichworte: Aufbau einer HPIC-Anlage, Ionenaustausch-, Ionenausschluss- und IonenpaarChromatographie, Eluenten fr Anionen- und Kationen-Chromatographie, Leitfhigkeitsdetektion, weitere Detektionsarten in der IC, Suppressor-Technik, Reaktionen, Bodenhhe, -zahl; Peakbreite Sule: Dionex AG4A, AS4A, AMMS-1 Einstellungen - Eluent: Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat 1.8/1.7 mM (aus der Stammlsung (180/170 mM) 20ml auf 2000ml mit Reinstwasser verdnnen) - Eluentenfluss: 1 ml/min - Suppressorlsung: 0,0125 M Schwefelsure (aus der Stammlsung 25ml auf 2000ml mit Reinstwasser verdnnen) - Fluss ber Vordruck, etwa 0.2 bar - Detektor: Leitfhigkeitdetektor 300 S - Integrator Leitfhigkeit HP 3390 A:

Attenuation 6; Chart Speed 0.5 mm/min, PKWD 0.04, ARREJ 1000, ZERO 5

1) Zur Erstellung der Eichfunktion werden von den ausstehenden Stammlsungen folgende Verdnnungen mit Tridest hergestellt.

Stammlsung I enthlt:

F- 192 mg/l Cl- 599 mg/l NO3- 1009 mg/l SO42- 2001 mg/l

Lsung Ia: Stammlsung I wird 1:40 mit Tridest verdnnt Lsung Ib: Lsung Ia wird 1:2 mit Tridest verdnnt Lsung Ic: Lsung Ia wird 1:4 mit Tridest verdnnt

Stammlsung II enthlt:

NO2- 404 mg/l

Lsung IIa: Stammlsung II wird 1:20 mit Tridest verdnnt Lsung IIb: Lsung IIa wird 1:2 mit Tridest verdnnt Lsung IIc: Lsung IIa wird 1:4 mit Tridest verdnnt

Stammlsung III enthlt:

Br- 413 mg/l PO43- 525 mg/l

Lsung IIIa: Stammlsung III wird 1:20 mit Tridest verdnnt Lsung IIIb: Lsung IIIa wird 1:2 mit Tridest verdnnt Lsung IIIc: Lsung IIIa wird 1:4 mit Tridest verdnnt

Berechnen Sie die Konzentration der Anionen in den Verdnnungen !! Injizieren Sie jede Lsung zweimal (stimmen Flche und Zeit gut berein, ansonsten weitere Injektion !!). Mit der bereitgestellten HPLC-Spritze wird in Stellung Load die Probeschleife gesplt (keine Luftblasen !!) und bei steckender Spritze schnell auf Injekt gedreht. Gleichzeitig der Detektor zu starten. Verfahren Sie ebenso mit der bereitgestellten Probe, vergessen Sie nicht diese soweit zu verdnnen, dass sie in die Kalibriergeraden passt. Notieren Sie den Wert der Grundleitfhigkeit !!

2) Lassen Sie sich vom Assistenten den Suppressor ausbauen. Injizieren Sie die Lsung Ia und I b einmal bei ausgestellter Untergrundkompensation und einmal bei eingestellter Untergrundkompensation. Notieren Sie die Werte der Grundleitfhigkeit !!

Versuchsauswertung: - Erstellen Sie Kalibriergeraden fr alle gemessenen Komponenten - Identifizieren und Quantifizieren Sie die Komponenten der Wasserprobe; zeichnen Sie die Messwerte unter Bercksichtigung der Verdnnung in die Kalibriergeraden ein. Bercksichtigen Sie zur Quantifizierung nur die Werte, die in der Kalibrierung liegen ! - Wie kommt es zur Ausbildung des Systempeaks ? - Erklren Sie die Unterschiede, die bei Messung mit und ohne Suppressor auftreten. - Wie lsst sich die Elution in der Ionenchromatographie beeinflussen?

CZE/MEKC
CZE Allgemeines: Die verschiedenen Spielarten der Kapillarelektrophorese erlauben die Analyse unterschiedlichster Substanzen. Dabei muss lediglich der Elektrolyt und gegebenenfalls die Kapillare gewechselt werden. Das Basisgert ist identisch. Stichworte: Kapillarelektrophorese, CZE Durchfhrung: a) Herstellung des Elektrolyten b) Versuch Eine Mischung aus wird p-Methoxyphenylessigsure, dreimal injiziert. Als interner p-Hydroxybenzoesure, und 4-Hydroxywird pStandard p-Hydroxyphenylessigsuremethylester, benzoesureethylester p-Hydroxybenzoesuremethylester

Hydroxyphenylessigsure der Mischung beigefgt. Temperatur: 20 C; Spannung: 25 kV; Detektor: DAD; Injektion: 2.5 psi x s c) Auswertung Anhand der Ladungsdichten sollen die analysierten Verbindungen den entsprechenden Signalen zugeordnet werden. Mit dem internen Standard sollen die Migrationszeiten normiert und der Mittelwert + Standardabweichung fr jeden Analyten bestimmt werden. Die Flche des internen Standards wird zur Flchennormierung der zeitnormierten Peakflchen verwendet (ebenfalls Mittelwert + Standardabweichung). Darber sollten Sie sich auch Gedanken machen: Wie sehen die Strukturen der zu analysierenden Substanzen aus? Was versteht man unter dem Elektroosmotischen Fluss? Erklren Sie das Prinzip der kapillarelektrophoretischen Trennung. Warum werden in der CE die Flchen ber der Migrationszeit normiert?

Warum normiert man diese Flchen dann nochmals mit der zeitnormierten Peakflche des internen Standards? Warum normiert man in der CE hufig die Migrationszeiten der Analyten mit der Migrationszeit eines internen Standards? MEKC Stichworte: Kapillarelektrophorese, MEKC Allgemeines: In diesem Versuch sollen die bei der CZE untersuchten Komponenten mittels MEKC voneinander getrennt werden. Durchfhrung: d) Probenvorbereitung Es werden Elektrolytmischungen hergestellt. e) Versuch Die Elektrolytzusammensetzung wird solange variiert bis eine vollstndige Trennung der Analyten erzielt wurde. f) Auswertung Diskutieren Sie die beobachteten nderungen aufgrund der unterschiedlichen Elektrolytzusammensetzung. Darber sollten Sie sich auch Gedanken machen: Prinzip der MEKC? Welchen Einfluss hat die Elektrolytzusammensetzung?

Demonstrationsversuch (LC-MS)
Unter dem Begriff LC-MS versteht man die Kopplung einer HPLC-Anlage mit einem Massenspektrometer. Diese Kopplungstechnik ergnzt die GC-MS, da hier die Trennung und massenspektroskopische Bestimmung schwer flchtiger Substanzen mglich ist. Fr die Kopplung der HPLC mit dem Massenspektrometer wird ein Interface eingesetzt. Das Interface hat die Aufgabe den Eluentenstrom der HPLC in die Gasphase zu berfhren und wenn mglich, die Probe zu ionisieren. Bei der LC-MS ist dies nicht so leicht zu erreichen wie bei der GC-MS, da ein wesentlich greres Volumen an Gas gebildet bzw. abgefhrt werden muss. Problematisch ist zudem, dass man ausgehend vom Atmosphrendruck in der Ionenquelle ein Hochvakuum im Massenspektrometer (~10-7mbar) aufrechterhalten muss. Es gibt verschiedene Techniken zur Ionisierung. Am weitesten verbreitet ist derzeit ESI (electrosprayionisation) und APCI (atmospheric-pressure-chemical-ionisation). Beides sind weiche Ionisationstechniken, bei der in den Massenspektren vorwiegend nicht fragmentierte Moleklpeaks beobachtet werden ([M+H]+ bei ESI+ und APCI+, [M-H]- bei ESI- und APCI-). Bei der neuerdings in Kombination mit ESI- bzw. APCI-Quellen erhltlichen APPI-Ionisation (atmospheric-pressure-photo-ionisation), findet man als Moleklpeak auch Radikalkationen. Der Aufbau des Electrospray-Interfaces der Firma Micromass (Z-Spray) ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Das flssige Eluat wird ber eine Edelstahlkapillare, an der eine Spannung von bis zu 3,5 kV anliegt, in die Gasphase versprht. Gleichzeitig wird bei der Verdampfung die Probe ionisiert. Es bilden sich zuerst kleine geladene Trpfchen, die durch den Verdampfungsprozess zunehmend kleiner werden, wobei die Oberflchenspannung der Trpfchen durch die zustzliche Ladung schlielich so gro wird, dass es zu einer sogenannten Coulumb-Explosion kommt. Untersttzt wird dieser Prozess durch ein Nebulizer-Gas, das ein besseres Spray erzeugt, sowie durch ein heies Desolvation-Gas, das die berfhrung des Eluats in die Gasphase erleichtert. Das Eluat wird so vollstndig in die Gasphase berfhrt. Fr eine effizientere Ionisierung werden dem Eluenten zustzlich flchtige Ionisierungsreagenzien hinzugegeben (z.B. Ameisensure, Ammoniumacetat oder Trifluoressigsure). Es knnen verschiedene Massenspektrometer mit der HPLC gekoppelt werden. Am weitesten verbreitet sind Quadrupolgerte (Q), die verhltnismig gnstig sind und fr die meisten Anwendungen ausreichen. Nachteilig sind der eingeschrnkte messbare Massenbereich und die geringe Auflsung.

Die Flugzeitmassenspektrometer (kurz TOF, time of flight) erfreuen sich immer noch wachsender Beliebtheit. Erst seit Anfang der 90er Jahre wurde diese Technik von den Herstellern weiterentwickelt, da nur mit Hilfe von leistungsstarken Computern die sehr groen Datenmengen, die in kurzer Zeit anfallen, verarbeitet werden knnen. Die Vorteile gegenber anderen Massenspektrometern liegen in der sehr hohen Massengenauigkeit (Abweichung unter 5 ppm), der verhltnismig groen Auflsung (bis zu 25.000; vgl. Quadrupolgerte: ca. 3.000), der hohen Scangeschwindigkeiten und des theoretisch unbegrenzten messbaren Massenbereiches. Eine weitere Kopplungsvariante besteht in der Verbindung der LC mit Ion-trap-Massenspektrometern. Mit diesem Gertetyp knnen bestimmte Ionen ber einen lngeren Zeitraum gespeichert werden, so dass MSn-Spektren aufgenommen werden knnen. Bei der Aufnahme von MSn-Spektren wird ein ausgesuchtes Ion (Mutter-Ion) durch stoinduzierte Kollision fragmentiert und ein daraus entstandenes Fragment-Ion (Tochter-Ion) kann nochmals selektiert und fragmentiert werden. Praktischerweise kann dies 3 bis 4 mal erfolgen. Besonders bei der Aufklrung von Peptiden werden diese Gerte eingesetzt. Die Auflsung und Massengenauigkeit sind jedoch mig. Auch die Kopplung mit Sektorfeldgerten wird routinemig betrieben. Interessant ist hierbei die sehr hohe Auflsung von bis zu 100.000. Die Kombination verschiedener Massenanalysatoren ist inzwischen in vielen Anordnungen realisiert. Bei den Tripelpolgerten werden beispielsweise drei Quadrupole (Q) hintereinander geschaltet, wobei der mittlere Quadrupol als Stozelle dient (d. h. hier knnen durch MS/MS-Experimente gezielt MutterIonen fragmentiert werden, so dass man aus den entstehenden Tochter-Ionen weitere StrukturInformationen gewinnen kann). Anwendung finden diese Instrumente hufig in der quantitativen Bestimmung von nicht flchtigen Substanzen, da sehr selektiv und empfindlich gemessen werden kann (z.B. bestimmte Arzneimittel, Herbizide). Nachteilig sind jedoch die sehr hohen Anschaffungskosten. Bei den sogenannten Hybridgerten werden unterschiedliche Massenanalysatoren miteinander verbunden. In dem Demoversuch wird ein QTOF vorgestellt. Die wesentlichen Elemente dieses Gertes sind die Ionisationsquelle, ein Quadrupol, eine Stozelle (bestehend aus einem Hexapol gefllt mit ca. 1 mbar Ar-Gas), eine Flugrhre (mit zwei Reflektrons und zwei Detektoren) sowie eine sehr schnelle Elektronik bzw. Datenverarbeitung (siehe Abbildung 2). Auf die Funktionsweise der einzelnen Bausteine wird whrend des Versuches nher eingegangen. Darber sollten Sie informiert sein: Auflsung, Massengenauigkeit, Mutter-/Tochterion Darber sollten Sie nachgedacht haben: Scangeschwindigkeit (speziell bei TOF- und Q-Massenanalysatoren), messbarer Massenbereich

Abbildung 1: Z-Spray-Ionenquelle der Firma Micromass

Abbildung 2: schematischer Aufbau eines QTOF-Massenspektrometers