Expresin Gnica y Biosntesis de Protenas

Tema 6

. Salgado (UVEG 2005-06)

Expresin Gnica
Expresin de la informacin gentica (secuencias de DNA)
Sntesis de las molculas que realizan funciones
Principalmente protenas Genes
Transcripcin

DNA

Cromosoma

El molde para la sntesis de protenas es mRNA

Adems, tRNA y rRNA participan en la sntesis de protenas

RNA
Traduccin

Transcrito

La expresin gnica consta de dos procesos

Transcripcin
Sntesis de los RNA a partir de DNA molde

. Salgado (UVEG 2005-06)

Protena

Traduccin
Sntesis de protenas a partir de un molde de mRNA
2

Transcripcin
Sntesis de RNA a partir de un molde de DNA
Siempre se da en la direccin 5 3 No requiere cebador Implica segmentos cortos (regiones codificadoras) que no se transcriben necesariamente de manera simultanea Ocurre mltiples veces a lo largo de la vida de la clula

Slo una hebra del DNA acta como molde

El nuevo RNA es complementario de la hebra molde (-) El nuevo RNA tiene la misma secuencia que la hebra codificadora (+), pero tiene U en lugar de T
Como referencia, la direccin de la hebra codificadora se utiliza como direccin del gen

RNA polimerasa
Enrollamiento
Hebra molde Hebra codificadora

Desenrollamiento

. Salgado (UVEG 2005-06)

Doble hlice hbrida RNA-DNA RNA naciente Avance de la polimerasa Punto de elongacin

Requerimientos para la Transcripcin

Unidad de transcripcin de DNA con promotor y terminador
Promotor: secuencia especfica de tamao variable
En ella se encuentran dos secuencias consenso a ~ -35 y -10 pb con respecto al sitio de inicio

Unidad de transcripcin
Promotor
-35 -10 +1

Terminador

-10

+1

RNA polimerasa
Complejo de cinco tipos de polipptidos: , , , ,
El factor reconoce el sitio de inicio permite la unin a la cadena molde 2, , y forman la enzima central que cataliza la sntesis de RNA No tiene actividad nucleasa (no puede corregir errores)
Secuencia Consenso (caja TATA o Pribnow) Inicio de la transcripcin

RNA polimerasas

. Salgado (UVEG 2005-06)

Nucletidos activados
CTP, GTP, ATP, UTP
De procariotas De eucariotas 4

Proceso de Transcripcin: Iniciacin

1. La holoenzima 2 reconoce al promotor de una unidad de transcripcin
El reconocimiento se debe al factor
Existen distintos factores para distintos tipos de promotores

3.Unin del primer nucletido trifosfato a la RNA polimerasa

Suele ser ATP o GTP Se une por apareamiento de bases a la hebra molde de DNA
Apertura del promotor
DNA de doble hlice DNA desenrollado (abiertos 17 pb)

2. Apertura del promotor

Desenrollamiento y separacin de las cadenas de DNA en la zona de inicio

. Salgado (UVEG 2005-06)

RNA polimerasa
5

Proceso de Transcripcin: Elongacin

4. Unin de sucesiva de los siguientes nucletidos
Cada uno se une al 3-OH libre del anterior por enlace fosfodister Se van seleccionando por apareamiento especfico con la hebra de DNA molde
Se forma una hlice dplex hbrida DNA/RNA de ~8 pb

Unin sucesiva de nuevos nucletidos

X
3

YTP

PPi P P P

X P

Y
3

P P P
5

OH

OH

Enlace fosfodister

La regin que contiene la RNA polimerasa y la hlice hbrida se llama burbuja de transcripcin

Burbuja de transcripcin
RNA polimerasa
Hebra molde Hebra codificadora Desenrollamiento

5. Avance de la burbuja
La hlice de DNA se va desenrollando por delante y enrollando por detrs El factor se suelta. 2 contina hasta la terminacin
Enrollamiento

. Salgado (UVEG 2005-06)

Doble hlice hbrida RNA-DNA RNA naciente Avance de la polimerasa Punto de elongacin

Proceso de Transcripcin: Terminacin

6. Llegada a la seal de terminacin en la hebra molde
Secuencia palindrmica rica en GC seguida de secuencia rica en AT
Se forma una estructura en horquilla en el RNA transcrito La polimerasa se para y el hbrido DNA/RNA se vuelve inestable La transcripcin finaliza en los residuos de U que siguen a la horquilla
Regin palindrmica (autocomplementaria) Oligo poliU

Seal de terminacin

7. Disociacin
Disociacin del hbrido DNA/RNA Fusin y enrollamiento del DNA abierto Desprendimiento de la RNA polimerasa Terminacin dependiente del factor

DNA/RNA

. Salgado (UVEG 2005-06)

Terminacin dependiente del factor (en algunos casos)

Actividad DNA/RNA helicasa, dependiente de ATP, que disocia el complejo de transcripcin
RNA Factor (hexmero) 5

RNA polimerasa

Regulacin de la Transcripcin (en Procariotas)

Constituye el control ms importante de la expresin gnica La afinidad de la RNA polimerasa por el promotor es el primer nivel de control
Depende de la secuencia del promotor y del tipo de factor

Genes inducibles
Su transcripcin vara segn las condiciones o las necesidades metablicas
Se regulan a travs de centros operadores
secuencias reguladoras cercanas al promotor

. Salgado (UVEG 2005-06)

Genes de expresin constitutiva

Son transcritos continuamente

Algunos genes que participan en una misma adaptacin regulan su expresin de manera conjunta
Forman unidades de expresin llamadas operones
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Modelo del Opern de Jacob y Monod

Gen regulador (i)
Contiene su propio promotor Codifica la protena represora (represor)
Esquema general del modelo del opern Opern
Gen regulador Centros de control Genes estructurales

Opern. Consta de:

Secuencias de regulacin
Promotor Operador

Genes estructurales
Codifican protenas que participan en una misma adaptacin

Esquema del opern de la lactosa

Opern de la lactosa

. Salgado (UVEG 2005-06)

Puede regularse por induccin o por represin

Induccin: El Opern de la Lactosa

Regula en paralelo la expresin de enzimas relacionadas con la utilizacin de lactosa en ausencia de glucosa
-galactosidasa Galactosido permeasa Tiogalactosido transacetilasa

En ausencia de lactosa
RNA pol bloqueada

El represor unido al centro operador bloquea la transcripcin de los genes z, y, a Represor

En ausencia de lactosa
No hay inductor El represor sin inductor se une al operador Impide a la RNA polimerasa transcribir z, y, a

En presencia de lactosa
RNA pol no bloqueada

En presencia de lactosa
Se forma el inductor alolactosa, que se une al represor y lo inactiva El operador se encuentra libre y los genes z, y, a pueden transcriben
Inductor -galactosidasa Permeasa Transacetilasa

. Salgado (UVEG 2005-06)

Alolactosa
(o molcula anloga)

Metabolismo de la lactosa

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Represin: El Opern del Triptfano

Regula en paralelo la expresin de enzimas relacionadas con la sntesis de Trp El Trp acta como corepresor En ausencia de triptfano
El represor no puede unirse al operador La RNA polimerasa transcribe los genes relacionados con la sntesis de Trp
Represor inactivo

En ausencia de Trp
RNA pol no bloqueada
p trpR p o trpL trpE trpD trpC trpB trpA

mRNA

mRNA

Enzimas de la sntesis del Trp En presencia de Trp

RNA pol bloqueada

En presencia de Trp
El Trp se une al represor El complejo activo represor/Trp se une al operador La RNA polimerasa queda bloqueada
Represor inactivo
p trpR

p o trpL

trpE

trpD

trpC

trpB

trpA

mRNA Represor activo Trp (corepresor) 11

. Salgado (UVEG 2005-06)

Procesamiento Post-transcripcional
Procesamiento:
Modificacin Posttranscripcin de algunos RNA transcritos Transcrito primario
RNA recin sintetizado, no modificado

Ribonucleasa III

Ribonucleasa III

rRNA 16S

En procariotas
Los mRNA no se procesan Los rRNA y tRNA se obtienen por corte y modificacin de transcritos primarios

rRNA 23S rRNA 5S Ribonucleasa P 1- Corte

tRNA tRNA tRNA maduro

3OH

2- adicin de CCA
5

. Salgado (UVEG 2005-06)

Intervienen RNAs catalticos

5

CCA-3OH

3- Modificacin de bases
CCA-3OH
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Transcripcin en Eucariotas
Tiene lugar en el ncleo Existen tres tipos de RNA polimerasas (cada una reconoce un tipo de promotor)
RNA polimerasa I
Sintetiza precursores de los rRNA

RNA polimerasa II
Sintetiza precursores de los mRNA

RNA polimerasa III

Sintetiza precursores de los tRNA

Promotores complejos y secuencias potenciadoras

Caja TATA entre 30 y 100 Otras secuencias (caja CAAT, caja GC)

. Salgado (UVEG 2005-06)

Son necesarios los factores de transcripcin

Se unen a los promotores y secuencias potenciadoras Guan la unin de la polimerasa
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Procesado en Eucariotas
En eucariotas, todos los productos de la transcripcin deben procesarse En los pre mRNA se modifican los extremos 5 y 3
Casquetes 5: en el extremo 5 se aade 7-metilguanosina y se metilan algunas ribosas En el extremo 3 se aade una cola de poli(A) de ~250 residuos

5 Pre mRNA

7-metilguanosina

2-metilribosa

3
Exn 1 Intrn
Pre mRNA

Maduracin:
Eliminacin de intrones por corte y empalme
Llevada a cabo por partculas ribonucleoproteicas nucleares pequeas (snRNPs)
Contienen RNA cataltico (ribozimas)

Exn 2

. Salgado (UVEG 2005-06)

El conjunto mRNA + snRNPs se llama espliceosoma

Complejo U4-U5-U6

Algunos RNA son capaces de automadurarse (RNA autocataltico)

Espliceosoma
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Traduccin
Sntesis de protenas a partir de un molde de mRNA
En procariotas ocurre inmediatamente despus de la transcripcin
El transcrito primario sirve de mRNA Transcripcin y traduccin pueden ocurrir simultneamente
Ribosoma
Protena naciente

Expresin de protenas en procariotas

En eucariotas est separada de la transcripcin en espacio y tiempo

El transcrito primario se procesa y el mRNA se transporta fuera del ncleo Permite una regulacin ms compleja

Expresin de protenas en eucariotas

Ncleo
Transcrito primario

. Salgado (UVEG 2005-06)

Procesado Transporte

Citosol

Ribosoma
Protena naciente 15

Requerimientos para la Traduccin

mRNA
Molde con la secuencia organizada en codones
Los codones son tripletes de bases del mRNA Son ledos por apareamiento especfico con anticodones de los aminoacil-tRNA Debe contener al menos una pauta abierta de lectura
En procariotas suelen existir mRNAs policistrnicos (o polignicos) que contienen varias pautas abiertas de lectura en tandem

Ribosoma
Complejo ribonucleoproteico de rRNA y protenas Une el mRNA molde y los distintos tRNA Cataliza la formacin de los enlaces peptdicos de la nueva protena

tRNA
Especficos para cada uno de los 20 aminocidos (al menos uno por aminocido)
Transportan los aminocidos activados hasta el ribosoma

Cada uno contiene un anticodn (complementario con un codn del mRNA)

Aminoacil-tRNA sintetasas
Activan y unen un aminocido a cada tRNA
Especficas para cada aminocido Interpretan el cdigo gentico

. Salgado (UVEG 2005-06)

Requieren ATP

Diversos factores proteicos

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Caractersticas del Cdigo Gentico

Es la relacin entre la secuencia de bases del DNA (o de su mRNA transcrito) y la secuencia de aminocidos de las protenas
Codn: grupo de tres bases que codifican una aminocido Las secuencias se leen a partir de un punto de inicio (AUG)
El codn de iniciacin establece el marco de lectura
El resto de codones se leen a partir del de iniciacin El cdigo no solapa

El cdigo est degenerado

64 tripletes posibles para 20 aminocidos y la seal de parada
Todos los aminocidos, excepto Trp y Met, se codifican por ms de un codn Hay tres codones de terminacin (UAA, UAG y UGA) Los codones sinnimos difieren casi siempre en la ltima base (las dos primeras especifican la identidad del aminocido)

. Salgado (UVEG 2005-06)

El cdigo gentico es casi universal

Las mitocondrias y los protozoos ciliados tienen algunos codones diferentes
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El Cdigo Gentico
Primera posicin (extremo 5)

Segunda posicin

Tercera posicin (extremo 3)

. Salgado (UVEG 2005-06)

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Variaciones del Cdigo en Mitocondrias

Codn

Cdigo estndar

Cdigo mitocondrial

. Salgado (UVEG 2005-06)

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Los tRNA
Molculas adaptadoras
Se unen a codones especficos y transportan aminocidos especficos Anticodn y sitio del aminocido estn en brazos opuestos

tRNA de la alanina
Nuclesidos modificados UH2: dihidrouridina I: inosina mG: metilguanosina m2G: dimetilguanosina T: ribotimidina ml: metilinosina : pseudouridina

Presentan muchas bases poco comunes

Impiden apareamientos normales Facilitan interacciones especiales
Relacionadas con su estructura terciaria Relacionadas con interacciones con la aminoacil-tRNA sintetasa y protenas ribosmicas

3
Sitio de unin del aminocido

. Salgado (UVEG 2005-06)

Aminoacil-tRNA
Intermediario de la sntesis de protenas
ster de tRNA+aminocido
20

Sntesis de los aminoacil-tRNA

Catalizada por las aminoacil-tRNA sintasas
Dos etapas:
1. Activacin del aminocido
Formacin del intermediario activado aminoacil-AMP Consume ATP

Aminoacil-tRNA tRNA

2. Transferencia del aminocido activado a su tRNA especfico

Se transfiere sobre el grupo 2-OH o 3-OH libre del tRNA Se forma un aminoaciltRNA por enlace ster

. Salgado (UVEG 2005-06)

21

Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas

Doblemente especficas por reconocimiento molecular
Para cada aminocido
Reconocen propiedades de carga, hidrofobicidad, tamao

Complejo treonil-tRNA sintetasa

Sitio de revisin

Aminoacil-tRNA sintetasa

Para cada tRNA correspondiente

Interaccionan especficamente con el brazo aceptor y con el brazo del anticodn

Brazo aceptor

Conocen e interpretan el cdigo gentico

Contienen sitios especiales de revisin

Si el aminocido es incorrecto es hidrolizado del tRNA Alta fidelidad

tRNA

Son capaces de corregir errores

Sitio de activacin

. Salgado (UVEG 2005-06)

Lazo del anticodn

Reconocimiento Especfico del Lazo del anticodn 22

El Ribosoma (Procariota)
Coordina las interacciones entre el molde (mRNA) y el adaptador (tRNA) Complejo supramolecular de RNA y protenas
La funcionalidad principal se debe a los rRNA (ribozimas) Dos subunidades
Grande (50S)
Funcin de catlisis (actividad peptidil transferasa)

Estructura del Ribosoma

Pequea (30S)
Funcin de reconocimiento

. Salgado (UVEG 2005-06)

Las protenas del ribosoma tienen una funcin estructural Sitio de formacin del enlace peptdico (formado por RNA)
23

Sitios de Unin en el Ribosoma

Sitios de unin para los tRNA
Sitio A
Para la unin de los aminoacil-tRNA

50S

Sitio P
Para la unin del peptidil-tRNA

Sitio E
Sitio de salida del tRNA recin descargado

Sitio de unin del mRNA

En la subunidad 30S
En el rRNA 16S de esta subunidad se encuentra un sitio de reconocimiento de la secuencia de iniciacin del mRNA

30S
E P A ti o i ti o i ti o Si S S

Tnel de la subunidad 50S

. Salgado (UVEG 2005-06)

Va de salida del nuevo polipptido

Tnel a travs de la subunidad 50S
Conecta con el sitio activo, donde se forma el enlace peptdico
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Caractersticas de la Traduccin
La direccin de la sntesis de protenas es siempre N-ter C-ter El mRNA molde se lee en direccin 5 3 El aminocido que se incorpora viene determinado slo por las interacciones codn-anticodn
Excepto en el caso del 1er aminocido, donde se reconoce especficamente un aminoacil-tRNA de iniciacin por el factor de iniciacin 2 (IF2) Se reconocen principalmente las dos primeras bases del codn (balanceo de las bases)
Existe cierta libertad en el apareamiento de la tercera base

. Salgado (UVEG 2005-06)

La estereoespecificidad es importante para la formacin del enlace peptdico

No pueden utilizarse D-aminocidos

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Seal de Iniciacin en Procariotas

La traduccin comienza en un punto especfico
El codn de iniciacin es AUG (Met)
Se encuentra precedido de la secuencia de Shine-Dalgarno, rica en purinas (G,A) lo que le diferencia de otros AUG internos La secuencia de Shine-Dalgarno interacciona especficamente con una zona del rRNA 16S rica en pirimidinas (C,U)

. Salgado (UVEG 2005-06)

El codn de iniciacin aparea especficamente con un aminoacil-tRNA iniciador que contiene N-formilmetionina en lugar de metionina (fMet-tRNAf)
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Mecanismo de la Traduccin: Iniciacin

1.Ensamblaje del complejo de 30S
Ayudado por los factores de iniciacin
Requiere GTP
Subunidad 30S Factores de iniciacin

Contiene:
mRNA unido a la subunidad 30S.
La secuencia de ShineDalgarno interacciona con el rRNA de 16S

fMet-tRNAf

Complejo de iniciacin 30S

Subunidad 50S + H2O

Unido en el sitio P y apareado con el codn de iniciacin

. Salgado (UVEG 2005-06)

2.Adicin de la subunidad de 50S y formacin del complejo de 70S

Complejo de iniciacin 70S 27

Mecanismo de la Traduccin: Elongacin

3.Transporte del segundo aminoacil-tRNAs (y sucesivos) al sitio A del ribosoma
Dependiente de factores de elongacin y de GTP
Transporte y unin del aminoacil-tRNA

4.Formacin del enlace peptdico

Transferencia de grupo peptidil al tRNA del sitio A

GTP

EF-Tu EF-Ts

GDP + Pi

5.Translocacin simultanea de los tRNAs y del mRNA

Dependiente del factor de elongacin EF-G y de GTP
Movimiento del mRNA en la distancia de un codn Movimiento del tRNA vaci al sitio E Movimiento del peptidil-tRNA al sitio P (el sitio A queda libre)

Formacin del enlace peptdico

. Salgado (UVEG 2005-06)

Translocacin

6.Disociacin del tRNA libre

GTP

EF-G GDP + Pi

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Mecanismo de la Traduccin: Terminacin

7. Llegada de un codn de parada (UAA, UGA o UAG) del mRNA al sitio A
El codn de terminacin es reconocido por un factor de liberacin (RF1 o RF2)
Estos son protenas (no hay tRNA para los codones de terminacin)

El reconocimiento es ayudado por el factor de liberacin RF3

Requiere GTP

. Salgado (UVEG 2005-06)

8. Hidrlisis del enlace ster que une el polipptido al tRNA y liberacin del polipptido 9. Liberacin del mRNA y del ltimo tRNA y disociacin del complejo de traduccin
Requiere el factor de liberacin del ribosoma (RRF) y GTP
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Sntesis de Protenas en Eucariotas

Las principales diferencias con respecto a procariotas son:
Tamao del ribosoma
En eucariotas el ribosoma es de 80S, con dos subunidades de 60S y 40S

Iniciacin
Se inicia con Met y no con N-formil-Met, aunque tambin existe un tRNA especial de iniciacin No hay secuencia de Shine-Dalgarno El codn de iniciacin se encuentra por rastreo (es el ms prximo a 5). Los mRNA son monocistrnicos

. Salgado (UVEG 2005-06)

Los eucariotas presentan un mayor nmero de factores de traduccin

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