UNIVERSIDAD DE CARTAGENA FACULTAD DE INGENIERA PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS

Determinacin de microorganismos lipoliticos en alimento Recuento de microorganismos proteoltico viables determinacin de microorganismos productores de acido Marlene Duran 1 Jos D Torres2.Lewis Zuiga 2, Arnulfo Arnedo 2, Raul Tamara2 Cartagena de Indias, junio 2011

1- (Profesora de la universidad de Cartagena); 2 -(estudiantes de ingeniera de alimentos de la Universidad de Cartagena)

RESUMEN Los microorganismos (lipoliticos, proteolticos, productores de acido) juegan un papel muy importante en la produccin, conservacin y consumo de los alimentos. Adems los alimentos pueden transmitir microorganismos patgenos causantes de intoxicaciones lo cual afecta la salud pblica y causa prdidas econmicas. De ah la gran importancia que reviste el conocimiento de los efectos que pueden tener los microorganismos en los alimentos y las posibilidades y formas de controlarlos. Por ello los objetivos generales son Que el estudiante conozca los fundamentos de la degradacin de los alimentos por microorganismos lipoliticos, y adquiera la destreza en el recuento de lipoliticos en muestras de alimentos. Se informe de la importancia de la determinacin en alimentos de bacterias proteolticas. Detectar la presencia de microorganismos productores de acido mediante el recuento total en placa.

Palabras claves: microorganismos, lipoliticos, proteolticos, productores de acido

INTRODUCCIN El recuento de microorganismos lipliticos en alimentos no es un anlisis rutinario; generalmente se hace cuando se presenta un problema de rancidez en productos con elevados contenido de grasas como mantequilla, margarinas, cremas, ensaladas con aderezos grasos, carnes grasas y quesos. Los lpidos simples son esteres de cidos grasos superiores con alcoholes, en este grupo se incluyen las grasas, los aceites y las ceras. Se modifican por reacciones de hidrlisis y oxidacin, de origen qumico y microbiano. La estructura o composicin de los lpidos en el alimento determinan si pueden o no ser metabolizados por los microorganismos. Las grasas y los aceites como esteres, son hidrolizados con produccin de glicerina y uno o ms cidos grasos. Estos ltimos, a su vez, se oxidan dando como resultado una serie de aldehdos, cetonas y cidos de olor rancio. El concepto de rancio se fundamenta siempre en la presencia de un grupo completo de sustancias y no precisamente de una sola de ellas. La hidrlisis y oxidacin tiene lugar en forma espontnea, aunque lentamente y en presencia de humedad, luz y oxigeno del aire. La autooxidacion de las grasas es una reaccin autocataltica de cadenas de radicales que afecta a los grupos alquilicos de los restos de cidos grasos y se ve favorecida por la presencia de oxigeno. Se inicia con tanta facilidad cuanto mayor es el numero de enlaces dobles existentes por resto cidos grasos en el triglicrido. As,

se originan hidroperoxidos de cidos grasos que por su parte y en presencia de metales pesados forman radicales y difunden cada vez ms el proceso. A partir de los hidroperoxidos , inodoros e inspidos se forman aldehdos y cetonas , que son responsables de las alteraciones de olor caractersticos de la grasas descompuesta. El enranciamiento es acelerado por la accin de microorganismos productores de lipasas enzimas que hidrolizan lpidos, produciendo a partir de triglicridos, digliceridos y monogliceridos, glicerina y cidos grasoso sucesivamente. Las lipasas son generalmente muy estables y continan liberando cidos grasos por largos periodos aun a temperatura por debajo de las de congelacin, por lo tanto esta frena pero no detiene el deterioro enzimtico ya iniciado y la alteracin se da aunque la congelacin o deshidratacin mantenga en dormancia las especies productoras de lipasas. Entre los grupos bacterianos productores de lipasa encontramos: Bacillus, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Corynebacterium, Enterobacter, Staphylococcus, Lactobacillus, Micrococcus Pseudomona y serratia). Entre los Mohos estn Alternaria, Aspergillum, Cladosporium, Endomyces Mucor Geotrichum, Neuropospora, Penicillium y Rhizopus. Entre las levaduras encontramos la candida y ocasionalmente Hansenula Rhodotorula Pichia, Sacharomyces y Torulopsis. Algunas veces en alimentos grasos deteriorados no se aslan microorganismos lipoliticos debido a que la gran mayora de lipasas

microbianas son exocelulares y pueden actuar en ausencia de clulas viables. Comnmente las protenas no son atacadas por microorganismos; las especies con esta capacidad son denominadas proteoliticas. Su presencia en alimentos, adems de producir alteraciones en olor y sabor, posibilitan la proliferacin de otros microorganismos no o dbilmente proteoliticos que utilizan el nitrgenos de los compuestos de degradacin originales por el ataque a las protenas. Si bien, en alimentos como leche, productos de mar, huevos, la actividad proteolitica es indeseable, en productos carnicos, hace parte del procesos de maduracin pero rpidamente se pasa a putrefaccin y en quesos son francamente deseables, definitiva para sabor, cuerpo y textura. Por esto, las opiniones difieren en cuanto a la utilidad de recuento de proteoliticos para evaluar prdida de calidad. En algunos casos es de valor para evaluar la vida til en almacenamiento refrigerado. Las especies proteoliticas son comunes entre los gneros bacillus, clostridium, pseudomonas y proteus. Hay tambin levaduras y mohos. Los microorganismos que llevan a cabo hidrlisis de protenas y fermentacin acida son llamados acido-proteoliticas, como, streptococcus faecalis var liquefacieus y micrococcus. Se han identificado proteasas estables al calor, con actividad despus de procesos de esterilizacin en leche; su accin es mejor a 40c , pero continua aun en refrigeracin. Las especies proteoliticas frecuentemente son psicrotroficas , favoreciendo el deterioro a bajas temperaturas. Gran

variedad de microorganismos productores de acido, se encuentran en el suelo, productos agrcola y ciertos alimentos procesados. Entre los ms importantes grupos de bacterias productoras de cidos se encuentran las acido lcticas. Las bacterias acido lcticas son cocos o bacillos gram positivos no esporulados, catalasa negativas, usualmente no mviles, fermentadores obligados que producen principalmente acido lctico y en ocasiones cidos voltiles y Co2 el grupo de bacterias acido lcticas est constituido por los gneros: -streptococcus -leuconostoc -pediococcus -lactobacillus Dentro de estos gneros existen especies homofermentativas las cuales tienen como producto principal el acido lctico y heterofermentativas quienes adems del acido lctico producen acido actico, etanol y CO2. Las bacterias acido lcticas tienen especial importancia en productos carnicos, lcticos y vegetales. Especies de propionibacterium y acetobacter son productoras de acido que juegan papel importante en varios procesos industriales como elaboracin del queso y vinagre. Para la determinacin de bacterias productoras de acido pueden utilizarse mtodos indirectos como el pH y la acidez titulable; la cual tiene el inconveniente que la neutralizacin depende de la capacidad taponadora que tenga el alimento. Para los recuentos en placa se utilizan medios adicionados de indicadores como el

prpura de bromocresol. Para organismos que producen cantidades considerables de acido preferible el verde de bromecresol o el azul de bromofenol y para los moderados el rojo del fenol. Existen medios especiales que pueden utilizarse para la diferenciacin de ciertas especies ; sin embargo la mayora de estos medios puede crecer otros microorganismos. La acida puede adicionarse para hacerlos ms selectivos. MATERIALES  Muestra de alimento  Frascos y tubos de ensayo con diluyentes  Cajas de petri  Agar tributirina (Base + glicerol tributirato)  Pipetas estriles  Bao, balanza e incubadora.  Muestra de alimento (segn grupo)  Frascos y tubos de ensayo con diluyente.  Cajas de petri con agar caseinato de calcio o cajas vacas o agar en fiola.  Balanza  Pipetas estriles  Licuadora o mortero estriles.  Incubadora.  Todo lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos. o caja de petri adicionadas de prpura de bromocresol (PCABCP) agar plate count prpura de bromocresol

o pipetas de 1 estriles o incubadora a 37c

ml

PROCEDIMIENTOS Parte I: Realice diluciones igual que para mesofilos aerobios. Marcar las cajas con fecha, nmero de grupo y dilucin correspondiente Realice siembra en profundidad (1 ml) Adicionar 15 mL de agar tributirina y homogenizar perfectamente, pues las lipasas solo actan en la interfase lpido- agua. Dejar solidificar las cajas e invertir. Incubar de 2 a 3 das. Sembrar controles negativos positivos y del medio de cultivo. Parte II: Realice las disoluciones a su muestra segn especificaciones dadas en diluyente igual que para mesoaerobicos marque las cajas de petri con la fecha, numero de grupo, muestra de dilucin correspondiente. marque una caja como control de diluyente y una como control de medio. para la siembra puede usarse la tcnica en superficie (o.1 ml ) en profundidad ( 1 mL) incube su serie de cajas a 21c por 72 horas invirtalas. Si se desea enumerar proteoliticos psicrotroficos, incube a 7c por 10 das. Parte III: preparar homogenizado y diluciones segn muestra, marcar las caja de agar prpura de bromocresol con fecha, numero de grupo muestra, y dilucin correspondiente. Pipetear a 0.1 mL de cada dilucin sobre cajas de petri con medio PC prpura de bromocresol y esparcir el inoculo con

varilla de vidrio. Incubar las cajas a 37c por 48 horas. RESULTADOS Y ANALISIS Determinacin de microorganismos lipoliticos Transcurrido el periodo de incubacin de 48 h y al evaluar el crecimiento y los controles realizados. Observamos que no existen inconvenientes lecturas, aplicando al las realizar reglas el de para las recuento conteo

protelisis con escasa acidez) ya que la muestra se encontraba pasteurizada o sea exenta del 95 % de los

microorganismos en general, y en el 5% de los restantes en la muestra existen valores microbiolgicos mnimos de proteolticos los cuales son los

expresados anteriormente en la tabla Determinacin de acido Transcurrido el tiempo de incubacin y al sacar las cajas para hacer el conteo de las unidades formadoras de colonias, reportamos las unidades formadoras de colonias de los microorganismos

observamos que no hubo presencia de microorganismos lipoliticos por ml de alimento, (0 UFC/ml) esto pudo ser debido a que la muestra utilizada estaba previamente sometida a tratamientos industriales. Determinacin de microorganismos proteolticos transcurrido el periodo de incubacin, y al sacar las cajas y al evaluar el control de diluyente y el de medio. Se observo que no existen inconvenientes para la lectura, por lo cual se las reglas de

productores de acido por mililitro de muestra como 0 UFC/ml ya que no hubo formacin de colonias amarillas. BIBLIOGRAFIA NMX-Z-013-1977. Gua para Redaccin, Estructuracin Presentacin de las Normas Mexicanas. la y

procedi a aplicar

recuento. Para las diluciones: Diluciones 10-1 10-2 UFC/ml 7 69

Valores microbiolgicos de referencia para los alimentos http://www.unavarra.es/genmic/curso% 20microbiologia%20general/14valores%20de%20referencia.htm Microbiologa de la leche y los productos lcteos. Edicin espaola 1999 Actualizada por el autor y Traducida del alemn por: Corinna schlter-ellner y Rodrigo schulz Guia practica microbiologa de alimentos Ingeniera de alimentos docente: Marlene Duran Lengua Bacteriologa msc 2011.

Los resultados mostrados en la tabla anterior no coinciden con los obtenidos por (Costa M, Gmez F y col 2002