To de Bacterias Nativas Con La Capacidad de Tolerar Compuestos Organicos Persistentes

AISLAMIENTO DE BACTERIAS NATIVAS CON CAPACIDAD DE TOLERAR COMPUESTOS ORGANICOS PERSISTENTES (DDT y METIL PARATHION) A PARTIR DE SUELO CONTAMINADO
CON XENOBIOTICOS EN EL MUNICIPIO AGUSTIN CODAZZI (CESAR).
GRIDIS YULIETH CORTES HENAO LUIS MARIANO VERGARA NIEBLES
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MICROBIOLOGA VALLEDUPAR 2006
AISLAMIENTO DE BACTERIAS NATIVAS CON LA CAPACIDAD DE TOLERAR COMPUESTOS ORGANICOS PERSISTENTES (DDT y METIL PARATHION) A PARTIR DE SUELO CONTAMINADO CON XENOBIOTICOS EN EL MUNICIPIO DE CODAZZI (CESAR).
GRIDIS YULIETH CORTES HENAO LUIS MARIANO VERGARA NIEBLES TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de MICROBIOLOGO AGROINDUSTRIAL Asesor Tcnico MARTHA LILIANA GOMEZ GARCIA Microbiloga Industrial Msc. Microbiologa Asesor Metodolgico NELSON VALERO VALERO Bilogo Msc. microbiologia
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MICROBIOLOGA VALLEDUPAR 2006 2
Notas de Aceptacin ______________________ ______________________ ______________________ ______________________
___________________________ Firma del Presidente Del Jurado
___________________________ Firma del Jurado
___________________________ Firma del Jurado Valledupar
DEDICATORIA Gridis
DEDICATORIA MARIANO
Agradecimientos
TABLA DE CONTENIDO Notas de Aceptacin .........3 RESUMEN..................................................................................................................11 INTRODUCCIN.......................................................................................................12 2. PROBLEMA DE INVESTIGACIN.....................................................................14 3. JUSTIFICACIN....................................................................................................15 4. ANTECEDENTES..................................................................................................16 5. OBJETIVOS............................................................................................................19 5.1 OBJETIVO GENERAL.....................................................................................19 5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................................19 6. PREGUNTA DE INVESTIGACION......................................................................20 7. HIPOTESIS DE TRABAJO....................................................................................21 8. MARCO TEORICO................................................................................................22 8.1 UBICACIN GEOGRFICA DEL MUNICIPIO DE CODAZZI...................22 .................................................................................................................................22 8.2 PLAGUICIDAS.................................................................................................23 8.2.1 Efectos del Uso de Plaguicidas en el Ambiente y en la Salud Humana.....24 8.2.2. Plaguicidas Organoclorados (DDT)..........................................................28 La degradacin aerbica del DDT por el ataque en las posiciones orto y meta por la accin de las dioxigenasas de Alkaligenes eutrophus A5 (Nadeau et al., 1994), producen el 4-clorobenzoato como un producto intermediario estable de esta transformacin.....................................................................................................31 Aerobacter aerogenes ..................................................................................................32 8.2.3 Pesticidas Organofosforados......................................................................33 8.2.3 Marco Normativo Sobre el Uso y Disposicin de los Plaguicidas.............36 9. METODOLOGA....................................................................................................37 9.1 SISTEMA DE VARIABLES............................................................................37 9.2 CRITERIOS PARA DELIMITAR EL REA DE MUESTERO.....................38 9.3 FASE DE CAMPO (MUESTREO, ALMACENAMIENTO Y PRESERVACION...................................................................................................39 9.4 FASE DE LABORATORIO .............................................................................39 9.4.1 Determinacin de las propiedades fsicas del suelo....................................40 9.4..2 Aislamiento de Cepas Nativas en las Estaciones Monitoreadas ...............40 9.4.3 Caracterizacin de las cepas aisladas..........................................................41 9.4.4 Lavado de clulas ......................................................................................42 9.4.5 Seleccin De Cepas Para Ensayo De Tolerancia........................................43 9.4.6 Caracterizacin Bioqumica .......................................................................45 9.4.7 Determinaciones Qumicas.........................................................................45 9.4.8 Tratamiento Estadistico..............................................................................45 10. RESULTDOS Y DISCUSIONES.........................................................................46 10.1 Fase De Campo (Muestreo, Almacenamiento Y Preservacin........................46 10.2 Determinacin de las propiedades fsicas del suelo.........................................47 10.3 Aislamiento de Cepas Nativas en las Estaciones Monitoreadas......................54 7
Antes de realizar el aislamiento de las cepas de las diferentes estaciones de muestreo, se hizo un recuento de viables inicial de la densidad de bacterias hetertrofas encontradas en el suelo, obteniendo los siguientes resultados (tabla. 7 ).............................................................................................................................54 ................................................................................................................................54 rea de Muestreo.....................................................................................................54 Recuento (clulas/ml)..............................................................................................54 A1............................................................................................................................54 1,20x10-5.................................................................................................................54 A2............................................................................................................................54 1,05x10-5.................................................................................................................54 A3............................................................................................................................54 8,9x10-4...................................................................................................................54 10.4.1 CMI en metil Parathion 6000 p.p.m 12.000 p.p.m ..............................60 10.4.2 Screaning Horizontal................................................................................62 10.5 Identificacin Bioqumica de Las cepas tolerantes a DDT y Metil Parathion. .................................................................................................................................63 11. CONCLUSIONES.................................................................................................65 12. RECOMENDACIONES........................................................................................66 BIBLIOGRAFIA.........................................................................................................67 LODOS........................................................................................................................71 ANEXO 9....................................................................................................................93 INDICE DE TABLAS Tabla 1: Determinacin de Porcentaje de Humedad A1..............................................49 Tabla 2:Determinacin de Porcentaje de Humedad A2...............................................49 Tabla 3: Determinacin de Porcentaje de Humedad A2..............................................50 Tabla 4:Resultados de Granulometria Muestra A1.....................................................52 Tabla 5: Resultados de Granulometria Muestra A2....................................................52 Tabla 6: Resultados de Granulometria Muestra A3....................................................53 Tabla 7: Recuento inicial de clulas viables................................................................54 Tabla 8: Recuento de clulas viales despues de 12 das en contacto con plaguicidas.54 Tabla 9: Cepas aisladas en el municipio de Codazzi (Cesar), con su contaminante y estacin de aislamiento respectivamente.....................................................................56 Tabla 10: resultado de cepas sometidas al screening horizontal Metil partin-DDT..62 Tabla 11: cepas identificadas mediante ell sistema de paneles BBL Crystal..............63 Tabla 12: clasificacin de suelo segun el tamao del grano........................................71
INDICE DE FIGURAS Fig. 1: mapa Codazzi...................................................................................................22 Fig. 2: Estructura Qumica del DDT. (Figura tomada de figura 13.23 Atlas y Bartha, 2002). ..........................................................................................................................29 Fig. 3: Ruta metabolica del DDT (tomado de Nadeau et al., 1994)............................32 Fig. 4: Estructura qumica del Metil Parathion (tomado de strand, 1992)..................33 Fig. 5: Ruta Metabolica del Paration..........................................................................35 Fig. 6: Muestreo A1.....................................................................................................38 Fig. 7: Muestreo A2.....................................................................................................38 Fig. 8: Muestro A3.......................................................................................................39 Fig. 9: Montaje para aislamiento a de cepas en caldos plaguicidas.............................41 Fig. 10: Ensayo CMI en Metil Paration para seleccin de cepas................................44 Fig. 11: Toma de las muestras de suelo en Las reas de muestreo 1,2 y control. (Fuente. Fotografa).....................................................................................................46 INDICE DE GRAFICAS Grfica 1: pH en reas de muestreo.............................................................................47 Grfica 2:Valores de temperatura obtenidas en las tres reas de muestreo.................48 Grfica 3: Porcentaje de Humedad en las areas de muestreo.....................................50 Grfica 4: Cantidad de cepas aisladas segn el contaminante.....................................57 Grfica 5: caracterstica microscpica de cepas aisladas.............................................58 Grfica 6: ensayos de seleccion de cepas tolerante a DDT y Metil Paration..............63
INDICE DE ANEXOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Medios de cultivo Tinciones Lavado quimico de materiales Metodologiade granulometria Guias de clasificacin morfologica Caracterizacion morfologica de las cepas Almacenamiento de ddt en colombia Marco normativo interacional y nacional de plaguicidas Plano de las reas de muestreo en el municipio Agustn Codazzi 66 67 68 69 70 72 78 84 93
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RESUMEN
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INTRODUCCIN La economa del departamento del Cesar se basa en la produccin agrcola y ganadera; sin embargo hace unos 25 aos uno de los principales pilares de la economa de esta regin era el cultivo de algodn, el cual trajo una gran bonanza al departamento (H. M. Rodrguez, 1999), pero tambin marc un gran impacto ambiental puesto que la aplicacin indiscriminada de agroqumicos a este cultivo deterior notablemente la calidad biolgica y la concentracin de materia orgnica del suelo en el municipio de Codazzi (cesar). La problemtica que hoy en da se vive en el municipio de Codazzi por la presencia de pesticidas qumicos, es el resultado de 45 aos de dao a la naturaleza. Desde que en 1960 se estableci all uno de los centros operativos de la Federacin Nacional de Algodoneros para el desmote de la fibra de algodn, desde entonces muchos son los plaguicidas que se han diseminado por aire, tierra y agua. Los plaguicidas son productos qumicos sintticos utilizados para eliminar plagas. Se estima que entre 1974 y 1994 se aplicaron en Codazzi y sus alrededores once millones de litros de agroqumicos y plaguicidas (H. M. Rodrguez, 1999), una cantidad como quizs no se tenga noticia en ningn otro sitio del pas1. Con todo esto las consecuencias mas graves se reflejaron en el medio ambiente, la saturacin de sustancias qumicas altamente toxicas y difcil de degradar en el suelo produjo un desequilibrio en el proceso trfico del mismo, esto sin contar con la diversidad de enfermedades de carcter gentico que se han presentado en el municipio de Codazzi y sus alrededores despus de la aparicin de los pesticidas en esta regin (H. M. Rodrguez, 1999) y que los acusa como los principales
USO, ALMACENAMIENTOY DISPOSICION DE PLAGUICIDAS. DEFENSORA DEL PUEBLO. RESOLUCION DEFENSORIAL N 011 /1998
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responsables de la aparicin de dichas enfermedades dentro de las cuales una de Gran incidencia es el CANCER2. Mediante este trabajo se busca aportar conocimiento bsico para contribuir a la bioremediacin3 de la contaminacin ambiental presente en suelos afectados por la exposicin a sustancias xenobioticas4. Este estudio tiene como propsito determinar la carga bacteriana del suelo contaminado y aislar las bacterias que tengan la capacidad de tolerar plaguicidas organoclorados y organofosforados como DDT y Metil Parathion respectivamente, que se sabe pueden bio-magnificarse5 transmitindose a pastos y otras plantas que puedan crecer a su alrededor y que por medio de la pirmide alimenticia puedan llegar a ser consumidas y acumuladas por el hombre (Atlas y Bartha, 2002), aumentando de esta forma la magnitud de los problemas hasta hoy reportados. contaminados por plaguicidas. Esto es importante para el conocimiento de microorganismos que puedan ser utilizados en procesos de biorremediacin de suelos
INSTITUO NACIONAL DE CANCEROLOGA (INC) INSTITUTO GEOGRAFICO AGUSTIN CODAZZI (IGAC), 2003. 3 BIORREMEDIACIN: Empleo de agente biolgicos para suprimir o detoxificar productos qumicos txicos o indeseables en un hbitat. 4 XENOBIOTICO: Producto Sinttico que no esta formado por procesos biosintticos naturales: sustancias extraas o venenosas. 5 BIOMAGNIFICACN: aumento de la concentracin de sustancias qumicas como plaguicidas cuando dichas sustancias pasan a niveles superiores de la cadena alimentaria
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2. PROBLEMA DE INVESTIGACIN Existe poca investigacin en el municipio de Codazzi (Cesar) sobre la descontaminacin por accin de los microorganismos en suelos afectados con sustancias xenobiticas (DDT y Metil Parathion entre otros); por consiguiente, no se conoce la capacidad que tienen los microorganismos nativos de esta regin de tolerar dichos compuestos.
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3. JUSTIFICACIN Los contaminantes en el suelo son en su mayora qumicos introducidos a los diferentes ecosistemas por actividades humanas que tienen el potencial de causar dao (GOMEZ 2003). En el municipio de Codazzi, desde 1963 se iniciaron los enterramientos de mas de 70 toneladas de diferentes plaguicidas, entre los que se encontraban DDT y Metil Paration (E. Cifuentes, 1998; H. M. Rodrguez, 1999), sustancias que por su composicin qumica y efectos en el ambiente han sido catalogados como extremadamente txicos6, lo que gener un gran impacto desfavorable al medio ambiente de esta zona. Por lo cual, es necesario Aislar y caracterizar las bacterias nativas involucradas en procesos de atenuacin natural, para dar a conocer la diversidad morfolgica encontrada en estos suelos contaminados con plaguicidas organoclorados y organofosforados; observar la capacidad de tolerar compuestos xenobiticos (DDT y Metil Parathion), y en posteriores estudios utilizar los microorganismos seleccionados por su eficiencia en tolerar y resistir diversas concentraciones de estos plaguicidas en procesos de biorremediacin, una alternativa econmica para la recuperacin de suelos contaminados, especficamente del municipio de Codazzi (Cesar). Este tipo de estudios son realmente importantes para la recuperacin de los ecosistemas de la zona norte de Colombia, especficamente el municipio de Codazzi (Cesar); afectado por el impacto ambiental causado por la aplicacin de agroqumicos a gran escala en el suelo, efecto que no solamente es nocivo para el suelo, si no, tambin, para las corrientes de agua cercanas y por supuesto los animales y el hombre (E. Cifuentes,1998).
MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE-MIONISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL, 1998
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4. ANTECEDENTES En 1975 haban registrado en Estados Unidos 1.170 plaguicidas. Esta cifra incluia 425 herbicidas, 410 fungicidas y 335 insecticidas (Atlas y. Barta 2002). La produccin total de plaguicidas orgnicos sintticos ese mismo ao fue de 725 millones de Kg. En Colombia, la industria de plaguicidas se inicia hacia el ao de 1962, con base en la importacin de ingredientes activos. En 1964 se ampla la tecnologa de la industria hacia la sntesis de algunos ingredientes activos. En 1997 se tenan registradas 98 empresas dedicadas a la produccin y comercializacin de plaguicidas. Algunos cultivadores de flores, tabaco, banano, palma, realizan importaciones directas de plaguicidas. La produccin en Colombia para 1997 se compona de 300 ingredientes activos, 900 formulaciones comerciales de las cuales 254 corresponden a insecticidas, 206 a fungicidas, 325 a herbicidas y 133 para otras formulaciones. Se estima que entre 1974 y 1994 se aplicaron en Codazzi y sus alrededores once millones de litros de agroqumicos y plaguicidas, una cantidad como quizs no se tenga noticia en ningn otro sitio del pas. Durante varios aos el Ministerio de Salud utiliz el DDT para el control de la malaria. Posteriormente la Resolucin No 10255 de 1993 de esa Cartera, prohibi la importacin, produccin, formulacin, comercializacin, uso y manejo de algunos productos, entre ellos el DDT, fijando como plazo un ao para el retiro definitivo del producto. Por su parte, el ICA en la Resolucin 891 de 1986 haba cancelado las licencias de venta de plaguicidas con DDT en su composicin. Con la finalidad de organizar el sector algodonero y de cuidar los diferentes aspectos ligados a la produccin, comercializacin e industrializacin del algodn se constituy la Federacin Nacional de Algodoneros que procedi a importar directamente los insumos para el cultivo de algodn, incluyendo los plaguicidas. Frente a la difcil situacin del sector algodonero, la Federacin Nacional de Algodoneros acumul existencias de plaguicidas que se convirtieron en obsoletas. stas fueron enterradas en reas de su propiedad ubicadas principalmente en el 16
departamento del Cesar, entre otros departamentos del pas (Anexo 7). El primer entierro se estableci en 1963, en las afueras del municipio de Codazzi, lugar donde funcionaba uno de los centros operativos de dicha Federacin. Esta entidad dej de operar en el rea en 1984 y en sus instalaciones entr a funcionar el Centro de Acopio Lechero INDULACE S.A. Posteriormente, en los aos noventa se instal en el mismo local el Instituto Tcnico Agropecuario Antonio Galo Lafaurie Celedn7 . En 1995, alumnos de ese Instituto, presentaron sntomas de intoxicacin por plaguicidas: dolores de cabeza, vmitos, brotes en la piel y desmayos. Una visita oficial que inclua funcionarios del Ministerio del Medio Ambiente, CORPOCESAR, la Secretara de Salud, el Jefe de Saneamiento Bsico del Hospital Agustn Codazzi y la Personera Municipal, recomend trasladar dicho Centro, previo el descubrimiento de ms de setenta canecas con txicos como DDT, Arseniato de Plomo, Metil Parathion, Etil Parathion y Endosulfan. Los referidos sntomas fueron constatados por el Servicio de Salud del Cesar que realiz una evaluacin del nivel de colinesterasa Examen que busca medir niveles de intoxicacin con organofosforados - en 40 alumnos. Los valores normales deben ser mayores al 75%, los anormales son menores. Tres de los jvenes presentaron un nivel menor del 50%, 19 de ellos entre 50% y 62.5%, 16 entre 63 y 75%, y solo dos resultaron normales (Rodrguez, 1999). A pesar de estos hallazgos, las autoridades no han actuado y las toneladas de desechos continan depositadas bajo tierra. Entre los efectos de lo anterior, se observa que las aguas subterrneas del municipio de Codazzi muestran altos grados de contaminacin. El arroyo El Pozn, que pasa cerca de los basureros detectados, desemboca en el ro Cesar que a su vez lleva estas aguas por Chiriguan, Chimichagua y desemboca ms adelante en el ro Magdalena. El 23 de marzo de 1998 una Comisin conformada por funcionarios de la alcalda municipal de Codazzi, CORPOICA, CORPOCESAR, Secretara de Salud Departamental y un consultor de la FAO visitaron el municipio de Codazzi.
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El
GEOSISMICA Y AMBIENTE CORPOCESAR, 1997.
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objetivo de la visita era reconocer la situacin actual y localizar otros sitios de posibles enterramientos (Anexo 7) y frente a los resultados de esta visita la FAO recomend: - Profundizar en la investigacin de posibles enterramientos, partiendo de la informacin recogida en el estudio realizado por Geoelctrica y Ambiente. - Establecer pozos de monitoreo que permitan identificar el grado de contaminacin. - Prohibir el pastoreo de ganado dentro de las pistas de fumigacin, puesto que, a travs de la cadena alimenticia, el contaminante o sus metabolitos afectan a los seres humanos. - Prohibir la manipulacin de los plaguicidas por parte de menores de edad. - Establecer medidas de prevencin para los operarios. - Realizar seminarios, talleres y cursos de capacitacin para explicar los riesgos que implica el uso inadecuado de estas sustancias (Vg. Utilizar material de las pistas para construir vivienda).
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5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GENERAL Aislar microorganismos nativos con capacidad de tolerar compuestos orgnicos persistentes (DDT y Metil Parathion), a partir de suelo contaminado con xenobioticos en el municipio de Codazzi (Cesar). 5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS. 5.2.1 Determinar propiedades fsicas (pH, textura, temperatura, y humedad) del suelo contaminado con sustancias xenobiticas en el municipio de Codazzi (Cesar). 5.2.2 Aislar bacterias capaces de tolerar compuestos orgnicos persistentes (DDT y metil Parathion) a partir de muestras de suelo en el municipio de Codazzi (Cesar). 5.2.3 Caracterizar macroscpicamente y microscpicamente las cepas bacterianas capaces de tolerar DDT y Metil Parathion, presentes en el suelo contaminado. 5.2.4 Seleccionar los microorganismos que posean la capacidad de tolerar DDT y metil Parathion. 5.2.5 Identificar bioqumicamente la cepas bacterianas capaces de tolerar DDT y Metil Parathion .
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6. PREGUNTA DE INVESTIGACION Existen bacterias Nativas En el suelo del municipio de Codazzi (Cesar) que tengan la capacidad de tolerar diversas concentraciones de DDT y Metil Parathion?
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7. HIPOTESIS DE TRABAJO En algunas reas de suelo en el municipio de Codazzi (Cesar) puede existir ausencia o presencia de microorganismos capaces de tolerar diferentes concentraciones de sustancias xenobioticas tales como DDT, Metil Paration o alguno de sus derivados.
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8. MARCO TEORICO 8.1 UBICACIN GEOGRFICA DEL MUNICIPIO DE CODAZZI. El municipio Agustn Codazzi, es un municipio colombiano perteneciente al departamento de Cesar. Dista de Valledupar 60 km, se encuentra localizado a 132 m de altitud sobre el nivel del mar y tiene una temperatura media anual de 28 C. (105 Norte y 7315 de longitud Oeste del meridiano de Greenwich)8, con los corregimientos de Casacar y becerril y una extensin de 2.731km2(Fig 1). Sus limites son: al Norte Robles, al Sur Cirhiguan, al Este Venezuela y al Oeste Chiriguan y Robles. Es un centro ganadero y agrcola, cuya actividad est dada fundamentalmente por los cultivos de algodn, caf, caa de azcar y ganadera incipiente no tecnificada (Geosismica y Ambiente, 1997).
Fig. 1: mapa Codazzi 1993-2003 Microsoft Corporation. /Agustin Codazzi- municipio Valledupar.
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8.2 PLAGUICIDAS. Los plaguicidas son compuestos qumicos diseados con fines agrcolas para el control y la destruccin de las diversas plagas -insectos, malezas y enfermedades- que afectan los cultivos, y en ciertos casos, plaguicidas como el DDT, tambin han sido empleados para programas de erradicacin de insectos vectores como los pertenecientes a los gneros Aedes, Culex y Anopheles transmisores de enfermedades como el paludismo, el dengue, la fiebre amarilla, la enfermedad de chagas, el tifus, entre otras (Vieira, et al., 2002; Machado et al., 2002; Atlas y Bartha, 2002).
Segn la FAO se define plaguicida qumico como caros, agentes patgenos, nemtodos,
todo
agente de naturaleza
qumica, que se utilice para la prevencin, represin, repulsin o control de insectos, malezas, roedores, u otros organismos nocivos a las plantas y a sus productos y derivados. Tambin incluye defoliantes, reguladores fisiolgicos de las plantas y coadyuvantes. (Ministerio del medio ambiente, 1998)
En la actualidad existen ms de 1000 plaguicidas preparados o mezclados en aproximadamente 40.000 productos; por lo general los plaguicidas se clasifican de acuerdo a su uso especfico en insecticidas, fungicidas, herbicidas y coadyuvantes (J. Routt y Reigart, 1999), tambin pueden ser clasificados teniendo en cuenta su naturaleza qumica (Bravo, 1998)de la siguiente manera:
Plaguicidas inorgnicos:
fabricados con base en minerales tales como
arsnico, boro, cobre, plomo, azufre y zinc principalmente. Plaguicidas derivados de vegetales: elaborados utilizando compuestos vegetales, como nicotina, rotenona, etc.
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Bioplaguicidas: son sustancias excretadas por los microorganismos utilizados en el control de plagas. Ejemplo coleopteros. Bacillus Thuringiensis produce una endotoxina cristalina para controlar lepidopteros, moscas negras, mosquitos y
Plaguicidas rgano-sintticos: producidos por el hombre, que contienen carbono e hidrgeno y uno o mas elementos como el cloro, fsforo, nitrgeno y azufre.
Sin embargo, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) opta por clasificar los plaguicidas segn su toxicidad aguda en las siguientes categoras: I. Extremadamente peligrosos, II. Altamente txicos, III Txicos, IV Medianamente txicos y V Ligeramente txicos.(J. Routt y Reigart, 1999).
8.2.1 Efectos del Uso de Plaguicidas en el Ambiente y en la Salud Humana. Los plaguicidas aunque han contribuido a mejorar las condiciones econmicas y alimentaras de la poblacin al incrementar la produccin agropecuaria, desbalancean qumicamente el hbitat natural ocasionando problemas de salud y ambientales los que se traducen en un nuevo riesgo y peligro para la vida humana. Se ha comprobado que su uso indiscriminado puede ocasionar resistencia y nuevas plagas, as como otros efectos en especies que no son el destino de las mismas, plaguicidas como clorados como el DDT, han ocasinado la muerte y la esterilidad de varias especies de rapaces (Athlas. R, Bartha. R, 2002) y feminizacin de Aves y reptiles (Fray, 1995; Vieira et al., 2000) 8.2.1.1 Contaminacin de Suelos por Plaguicidas Las principales alteraciones que se presentan en el recurso suelo estn dados por la salinidad, la alteracin de la fertilidad y la disminucin de la fauna y flora. 24
Sin perjuicio de las dificultades para evaluar los efectos sobre el suelo por parte de estas sustancias qumicas, se dispone de informacin sobre los efectos negativos que se causa en los microorganismos y en pequeos animales, que son esenciales para garantizar su fertilidad. Se considera que el 50% de los diferentes plaguicidas utilizados se asienta en los suelos, impidiendo su proceso natural de fertilizacin. Como consecuencia de ello, stos pierden capacidad, los productos son de menor calidad nutritiva y, en algunos casos, los niveles de contaminacin son peligrosos para la salud de quienes los van a consumir. Por otra parte, algunas variedades de insectos y hongos han desarrollado tolerancia a los pesticidas, lo que afecta particularmente a los monocultivos. En 1948 existan 14 tipos de insectos inmunes a los plaguicidas; dos aos despus se registraron 20. Para 1993 unos 620 resistan a la aplicacin de insecticidas. Como consecuencia de esta situacin se utilizan productos ms fuertes, con lo cual se entra en un crculo vicioso que acenta los efectos nocivos sobre los ecosistemas. Adicionalmente, el uso generalizado de plaguicidas elimina los sistemas bioqumicos naturales, es decir especies tiles que mantienen normalmente bajo control la proliferacin de plagas potenciales. (Muoz, 1998)9
8.2.1.2 Contaminacin de Alimentos por Plaguicidas La contaminacin de los productos de cosecha debida a sustancias qumicas txicas puede ocurrir por una de las siguientes vas: a. Aplicacin directa durante el crecimiento. b. Transporte o almacenamiento. c. Permanencia de estas sustancias en el suelo que se transportan en la cosecha. d. Contaminacin del agua que se usa para el riego o para consumo de personas y animales.
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e. Localizacin en los animales y aparicin en la carne, la leche y los huevos. La presencia de los residuos de plaguicidas en las cosechas de Hortalizas est relacionada directamente con los siguientes factores: uso, dosis, nmero de aplicaciones de las sustancias qumicas, degradacin de los compuestos, caractersticas de las formulaciones, caractersticas y manejo del cultivo y condiciones climticas. A travs de la cadena alimenticia y por el proceso de biomagnificacin, principalmente de insecticidas organoclorados de gran afinidad por las grasas, el organismo humano acumula estas sustancias producindose una intoxicacin crnica que puede manifestarse en desrdenes orgnicos no identificables con la exposicin a plaguicidas10.
8.2.1.3 Impactos de los Plaguicidas Sobre la Salud Humana En la salud humana se clasifican los efectos del uso indiscriminado de plaguicidas en agudos y crnicos. Los agudos dependen de la cantidad y del poder txico que contenga el producto; los daos aparecen rpidamente y suelen ser muy graves. Los efectos crnicos, en cambio, aparecen con el tiempo, muchas veces aos despus de haber estado en contacto con el producto.
Estos ltimos son mucho ms difciles de analizar, puesto que suelen afectar a grupos heterogneos de poblacin, no existe certeza sobre la dosis ingerida, adems de que existe multifactoriedad causal que puede incidir en el problema de salud. Adicionalmente los efectos aparecen a largo plazo y muchas veces su falta de especificidad hace que se confundan con otros problemas o enfermedades de los afectados. Los problemas derivados de la toxicidad aguda son ms concretos, se
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conocen con mejor precisin los productos implicados y se pueden valorar los efectos por ser inmediatos con sintomatologa especfica y definida.
Segn la Organizacin Mundial de Salud -OMS, alrededor de 500.000 personas por ao sufren envenenamiento por ingestin o inhalacin de pesticidas. De ellas mueren entre 30.000 y 40.000 cada ao (Muoz . E, 1998).
La mayora de los plaguicidas orgnicos que se emplean en la actualidad pueden ser mineralizados11 en gran parte en el tiempo que dura una cosecha o menos. Los procesos bioqumicos, son los responsables de su desaparicin. Si una sustancia puede ser atacada por un microorganismo, terminar desapareciendo del suelo; Una degradacin de este tipo en suelos es normalmente deseable, porque evita que se acumulen cantidades toxicas del compuesto. Sin embargo, compuestos qumicos de molculas muy parecidas pueden diferir grandemente en cuanto a degradabilidad, en relacin a la tasa relativa de persistencia de diferentes herbicidas, no obstante estas cantidades son solo aproximadas, dado que la descomposicin est influenciada por una variedad de factores ambientales como temperatura, pH, aireacin, y control de materia orgnica del suelo. Algunos plaguicidas clorados son tan recalcitrantes12 que persisten en los suelos hasta mas de 10 aos. En general cuanto mas cloros sustituidos tenga su molcula mas persistente es el producto (; Kenedy et. al 1990; Chaudry y Chapalmadugo 1991; Atlas y Bartha, 2002 ).
La persistencia de un plaguicida se define como el tiempo necesario para que pierda al menos el 95% de su actividad, bajo condiciones ambientales y tasas de aplicacin normales, o bien se ha inactivado debido a procesos qumicos o biolgicos . los productos qumicos no persistentes permanecen en el suelo de una a tres semanas; los
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MINERALIZACIN: Descomposicin de la materia orgnica en minerales inorgnicos por accin de los diversos microorganismos.
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RECALCITRNTE Producto qumico totalmente resistente al ataque microbiano.
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de persistencia moderada, de uno a 18 meses y los persistentes pueden durar de dos a mas aos. La mayora de los hidrocarburos clorados se clasifican como compuestos persistentes (Nilson. 1990).
Es posible imaginar muchas razones por las que un compuesto xenobiotico resulte recalcitrante a la biodegradacin. Sustituciones (como las realizadas con cloros y otros halgenos) y enlaces o secuencias de enlaces (en tomos de carbono terciarios o cuaternarios) poco usuales, anillos aromticos muy condensados y tamao molecular excesivo (en el caso del polietileno y otros plsticos)(Atlas y Bartha, 2002). Otras caractersticas comprenden la incapacidad de un compuesto para inducir la sntesis de las enzimas degradadoras, incluso cuando ese compuesto es susceptible a su accin. La imposibilidad del compuesto para entrar en la clula microbiana debido a la carencia de las permeasas apropiadas. Otros factores son la escasa disponibilidad del compuesto en disolucin por problemas de solubilidad o fenmenos de adsorcin, y la toxicidad excesiva del compuesto inicial o de sus productos metablicos (Atlas y Bartha, 2002). 8.2.2. Plaguicidas Organoclorados (DDT) Los hidrocarburos clorados estn bsicamente formados por esqueletos de carbono e hidrgeno a los que se unen tomos de cloro. Esta clase de plaguicidas es la que mas prevalece en el ambiente en la actualidad por dos razones: en primer lugar, por el uso acumulativo que excede al de cualquier otra clase y en segundo lugar, por su carcter recalcitrante (resistencia a la degradacin) en el ambiente (Gmez. 2003). En 1940 aparecieron en el mercado los primeros pesticidas organoclorados que tienen su mximo exponente en el dicloro-difenil-tricloroetano o DDT, el cual fue sintetizado en 1874 por Zeidler, quien descubri sus propiedades fsico-qumicas, pero , sus propiedades insecticidas fueron descubiertas por Mller en 1940, momento en que comenz su utilizacin masiva tanto en los tratamientos agrcolas como en el control de plagas ya que el DDT tambin se utiliz ampliamente en pases Desarrollados por
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su actividad contra insectos vectores responsables de la diseminacin del paludismo y el tifo (Vieira, et al., 2002; Machado et al., 2002; Atlas y Bartha, 2002).
El DDT es una molcula rgida (Fig.2) y liposoluble, es un plaguicida con menor nmero de tomos de cloro en su molcula que el Mirex o el Kepone (plaguicidas completamente clorados), puede sufrir ciertas transformaciones bioqumicas, pero su esqueleto carbonado bsico permanece en el ambiente durante un tiempo excesivamente largo (Athlas y Brtha, 2002). Con una aproximadamente 100 aos (Derache, 1990). vida media de
Fig. 2: Estructura Qumica del DDT. (Figura tomada de figura 13.23 Atlas y Bartha, 2002).
El DDT se acumula en los tejidos grasos de los seres vivos y sufre un proceso de biomagnificacin importante a lo largo de toda la cadena alimentaria (Falkenberg, 2001; Malato et al., 2001). Posee una bajsima tensin de vapor y una volatilidad muy escasa, lo que unido a su poca sensibilidad a la luz ultravioleta explica su notable persistencia en el medio ambiente. Inicialmente, la persistencia de estos productos se consider como una cualidad excepcional ya que el efecto biocida duraba largo tiempo en el medio de aplicacin. Con posterioridad, se pusieron de manifiesto los inconvenientes de este comportamiento ya que la estabilidad qumica resulta en una gran persistencia medioambiental y en una exacerbacin de los efectos biolgicos indeseables (Dich et al., 1997).
El tiempo en el que el uso del DDT era autorizado fue de treinta aos, si se cuenta desde su comercializacin hasta el fin de su empleo legal, tiempo excesivamente largo para un compuesto que ha demostrado ser persistente y bioacumulable. Durante 29
este tiempo el cmulo del pesticida en suelos, acuferos y en la cadena alimentaria ha sido muy importante de tal manera que no hay hoy da poblacin humana que no contenga niveles significativamente importantes de DDT y sus derivados en grasas y tejido adiposo. Esta aplicacin justifica, por s sola, el hecho de que la produccin mundial de DDT hoy da sea mayor que en pasado (Miller y cols., 1995).Por importante que sea el uso histrico de DDT y su residuo medioambiental, lo cierto es que DDT no es mas que un ejemplo de una gran familia de plaguicidas Organoclorados que comparten muchas caractersticas comunes, y aunque su uso est prohibido en la mayora de los pases industrializados (U.S. Department of health and human services, 2002; Connor et al., 2004)., puede encontrarse en cualquier ser vivo y en cualquier parte del planeta, y aun en aquellos individuos no expuestos de forma directa, si no a travs del residuo contenido en otros individuos que le sirven de alimentacin y de soporte (Olea & Fernndez 2001; Peterson & Dumanoski 1999).
En cuanto a la biodegradacin del DDT, se conoce que los enlaces carbono-halgeno son altamente estable y su rotura es un proceso endotrmico que requiere gran cantidad de energa para su degradacin, por esta razn es muy poco probable que los microorganismos desarrollen evolutivamente la capacidad de Carbono altamente halogenados como sustratos de crecimiento (Atlas y Bartha, 2002). Sin embargo, se ha reportado que los pesticidas clorados, incluido el DDT estn sujetos a una deshalogenacin reductora, es decir, a la separacin del tomo de cloro por microorganismos anaerobios (Genthner et al., 1989). En suelos inundados, el DDT se transforma a DDD con una degradacin de 31 das en suelos de rico contenido orgnico (Castro y Yoshida, 1971). La cintica de degradacin de este ambiente anxico se aumenta con el contenido orgnico, el ambiente anxico reducira el potencial de oxido-reduccindel suelo que activara las bacterias anoxigenicas presentes en el medio, en tanto el aumento del contenido orgnico facilitara la actividad de dichas bacterias al actuar como receptoras de electrones o Hidrgenos que resultaran de la funcin bacteriana (Mitras y Rahgu, 1998) 30 El hongo de la
podredumbre blanca, Fhanerochete crisoporium puede atacar al DDT (Bompus y Aust 1987; Kullman y Matsumura, 1995), de hecho Pfaender y Alexander (1972), demostraron la mineralizacin In Vitro del anillo carbonado del DDT mediante la utilizacin de extractos libres de clulas de una bacteria oxidadora de hidrogeno, de clulas enteras de Arthrobacter, la adicin de cosustratos y regimenes sucesivos de condiciones aerbicas y anaerobias(figura 3). No obstante llegaron a la conclusin de que en el ambiente, la mineralizacin bioqumica del DDT no se produce o si ocurre, es a tasas muy bajas. Aparte de la energa desfavorables del proceso de declaracin, no se hall ninguna otra explicacin.
La degradacin aerbica del DDT por el ataque en las posiciones orto y meta por la accin de las dioxigenasas de Alkaligenes eutrophus A5 (Nadeau et al., 1994), producen el 4-clorobenzoato como un producto intermediario estable de esta transformacin.
El cometabolismo del DDT por cepas de Burkholderia sp. degradadoras de bifenilos, producen la hidroxilacin de un anillo, incluido los productos del rompimiento del anillo (Arnett et al., 2000; Hay y Focht, 1998).
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Degradacin aerbica muy lenta

Eliminacin directa del HCl HCl
Degradacin relativamente rpida

H
anaerobia
CCl3 DDT H
Cl-
CCl2 DDE Persistente, a menudo un producto de cometabolismo OH
CHCl2
DDD o TDE HClEliminacin directa del HCl
CCl3 Dicofol, metabolito menor
CHCl
Posterior degradacin por
CH2Cl
Aerobacter aerogenes
HClEliminacin directa de HCl
CH2 Persistente
COOH
Clorobenzoato O
Fig. 3: Ruta metabolica del DDT (tomado de Nadeau et al., 1994)
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8.2.3 Pesticidas Organofosforados Los principales plaguicidas utilizados hoy da en los pases desarrollados pertenecen al grupo de los organofosforados, carbamatos y piretroides. Se trata de compuestos qumicos con una vida media mucho ms corta que los organoclorados, de tal manera que son menos persistentes y no se acumulan en el tejido adiposo.(Duran y cols., 1998). Los rganos fosforados presentan una estructura qumica en comn, pero ellos difieren grandemente en los detalles de su estructura, sus propiedades fsicas y farmacolgicas. El Metil Parathion (Fig.4)es un insecticida organofosforado cclico cuya molcula presenta un doble enlace de fsforo, azufre y uno o dos grupos metil unidos al tomo de fsforo activo (Geosismica y ambiente, 1997), fue sintetizado en Estados unidos en 1952 (U.S. Department of health and human services, 2001), es un plaguicida no sistmico, de contacto, inhibidor de la colinesterasa y alguna accin respiratoria (J. Routt y Reigart, 1999). Su efecto es rpido, pero no prolongado, y por esta razn es efectivo contra insectos masticadores, chupadores y otros especialmente en zonas de fuertes lluvias (Proficol EC, 2004); se encuentra clasificado como un propuesto toxico y su accin residual es mucho menor que la del DDT (Andrea et al., 1994).
Fig. 4: Estructura qumica del Metil Parathion (tomado de strand, 1992)
La tasa de degradacin de los Organofosforados como el metil partatin es usualmente rpida, y para una completa mineralizacin in vitro por bacterias se requieren aproximadamente dos das (Rani y Lalithakumari,1994; Sideramappa et al., 1973). Ls enzima OPH ( organophosphorus hydrolase) aislada de microorganismos del suelo, ha mostrado un vasto rango de hidrolizacion de pesticidas
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Organofosforados, la hidrlisis enzimatica del metil Parathion reduce su toxicidad cerca de 120 partes, y permit la formacin de p-nitrofenol (PNP) (Fig. 5) como subproductos, estos subproductos son considerablemente menos txicos, sin embargo, el efecto toxico del PNP en sistemas biolgicos ha permitido su En estudios sobre dbiodegradacion de pesticidas clasificacin como un contaminante de prioridad por la EPA en los Estados Unidos (Shimazu et al ., 2001). Organofosforados ha sido posible aislar cepas bacterianas como Moraella sp. Con la capacidad de degradar PNP (Shimazu et al., 2001; Leung et al., 1997; Nishino y Spain, 1993). Otros estudios muestran que el Metil Parathion es aun mas rapidamente degradado que el Parathion aunque poseen vas metablicas muy similares, estos compuestos pueden ser degradados en tres vas (Fig. 5), todas ellas requieren de un climatizacin para su expresin completa: 1. Hidrlisis a p-Nitrofenol y cido dietiltiofosfrico. Usualmente en suelos Aerobicos. El p-Nitrofenol es degradado generalmente por reduccin a paminofenol. 2. Reduccin a aminoparatin, el cual es luego hidrolizado a p-aminofenol y cido dietiltiofodfrico bajo condiciones de nivel bajo de oxigeno (microaerofilicos). Usual en ambientes anaerobicos. 3. oxidacin en pequeas cantidades a Paraoxon. Este es la principal via metablica en los mamferos. El Paraoxon es posteriormente degradado en el ambiente a p-Nitrofenol y cido dietiltiofosforico. La degradacin de este compuesto en suelos anoxicos esta dada principalmente por los siguientes microorganismos: Flavobacterium sp, pseudomonas sp, Qrthrobacter sp, Chlorella pyrenoidosa y Penicillium waksmani.
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Fig. 5: Ruta Metabolica del Paration
Los plaguicidas Organofosforados como el Metil Parathion ejercen su mecanismo de accin en los mamiferos incluido el hombre a travs de la fosforilacin de la enzima acetilcolinesterasa en las terminaciones nerviosas, provocando inhibicin de la misma. La enzima acetilcolinesterasa es la responsable de la destruccin y terminacin de la actividad biolgica del neurotransmisor acetilcolina, al estar esta inhibida se acumula 35
acetilcolina en el espacio sinptico alterando el funcionamiento normal del impulso nervioso. La acumulacin de acetilcolina se produce en las uniones colinrgicas neuroefectoras (efectos muscarnicos), en las uniones mioneurales del esqueleto y los ganglios autnomos (efectos nicotnicos) as como en el sistema nervioso central. Los rganos fosforados inactivan la actividad de la enzima Acetilcolinesterasa, mediante inhibicin enzimtica competitiva e irreversible (Muoz, 1998).
8.2.3 Marco Normativo Sobre el Uso y Disposicin de los Plaguicidas. Las directrices internacionales, elaboradas por los organismos de las Naciones Unidas, han servido como referencias para la reglamentacin en los diferentes pases. A rengln seguido se mencionan algunas: Cdigo Internacional de Conducta para la Distribucin y Utilizacin de Plaguicidas; Directrices de Londres; Procedimiento del Concepto Informado Previo PIC; Convenio de Basilea; Convenio sobre los Contaminantes Orgnicos Persistentes COPs. (Anexo4)
En cuanto a las normativas nacionales (Anexo 8) el marco normativo relacionado con el uso, manejo y disposicin de los residuos slidos es complejo y est disperso en diferentes normas, lo que hace difcil su conocimiento y por lo tanto su aplicacin. De otro lado, no hay total claridad sobre la definicin de competencias de las diferentes autoridades gubernamentales, lo que genera duplicidad y ambigedad en el cumplimiento de sus funciones; A esto se suma que no existe una verdadera coordinacin institucional entre las entidades del orden nacional Ministerios de Salud, de Agricultura y del Medio Ambiente y el ICA- entre s, ni con las entidades del orden regional Corporaciones Autnomas Regionales, Secretaras de Salud y
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Agricultura, lo cual se ve agravado por la poca operatividad del Consejo Nacional de Plaguicidas.
9. METODOLOGA En este estudio se realiz una investigacin de tipo exploratoria, ya que no se conoce la microflora del suelo del municipio de Codazzi contaminado con agroqumicos Organoclorados y Organofosforados (DDT y Metil Parathion); y una investigacin descriptiva debido a que dentro de los objetivos se pretende caracterizar y describir las cepas aisladas a partir de estas muestras de suelo. 9.1 SISTEMA DE VARIABLES Las variables que fueron tenidas en cuenta en el desarrollo de esta investigacin son: Variable Dependiente: Capacidad de los microorganismos nativos de tolerar y resistir sustancias xenobioticas (DDT y Metil Parathion) en suelos contaminados en el municipio de Codazzi (Cesar). Variables Independientes: las propiedades fisicoqumicas y microbiolgicas como parmetros a medir a partir de las muestras obtenidas del suelo del municipio de Codazzi (Cesar), registrando los datos de estas variables experimentalmente despus de un determinado tiempo. Estas variables son cualitativas y cuantitativas: Textura. PH. Temperatura. Cantidad de microorganismos. Caractersticas morfolgicas de los microorganismos seleccionados. Caractersticas bioqumicas de los microorganismos seleccionados. 37
9.2 CRITERIOS PARA DELIMITAR EL REA DE MUESTERO Se tendrn en cuenta tres zonas para realizar el muestreo (Anexo 9): Zona 1: rea contaminada con DDT y Metil Parathion ubicada en el lote sobre el cual funcionaba uno de los centros operativos de la federacin nacional de Algodoneros en el municipio de Codazzi (Cesar). (fig.)
Fig. 6: Muestreo A1
Zona 2: rea contaminada por entierros con DDT y Metil Parathion en los predios de la casa campesina del municipio de Codazzi (cesar) (Fig).
Fig. 7: Muestreo A2
Zona 3: rea control, ubicada en una zona no expuesta directamente a los plaguicidas DDT y Metil Paration en el municipio de Codazzi (Cesar).
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Fig. 8: Muestro A3
9.3
FASE
DE
CAMPO
(MUESTREO,
ALMACENAMIENTO
PRESERVACION El muestreo se realiz en cada una de las reas descritas anteriormente usando la misma metodologa (N.W. Osorio.BIBLIOGRAFIA) formando una muestra compuesta, constituida por 500 gramos de suelo para cada rea, colocadas en un empaque de papel aluminio pretratado qumicamente (Anexo 3), correctamente rotulados y transportadas en una cava con hielo para preservar las muestras durante su traslado al laboratorio de microbiologa. Para obtener las submuestras se escogieron 13 puntos diferentes distribuidos en forma de Zig-Zag distando 4m entre cada punto en direccin (fig. A1). Durante el proceso de muestreo fue necesario realizar la medicin in situ de 2 parmetros fisicoqumicos, Ph y Temperatura, para lo cual se us un multimetro porttil marcaca XXX XXXX.y un termmetro de bulbo marca XXXX respectivamente. 9.4 FASE DE LABORATORIO La fase experimental se llev a cabo en las instalaciones de la Unidad De Laboratorios del instituto de investigaciones marinas y costeras Jos Benito Vives de Andres (INVEMAR) sede Santamarta.
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9.4.1 Determinacin de las propiedades fsicas del suelo Las propiedades Evaluadas en esta parte del proyecto fueron escogidas debido a su importancia en el desarrollo y crecimiento normal de la flora microbiana que se pueda encontrar en este tipo de suelo; siendo las ms relevantes para este estudio: Textura Color Plasticidad Porosidad Ph Temperatura. Para cumplir con este propsito se aplic la tcnica de granulometra descrito en el Anexo 4. 9.4..2 Aislamiento de Cepas Nativas en las Estaciones Monitoreadas Para el aislamiento de las cepas de inters se seguir el protocolo propuesto por el doctor Roberto Nez (comunicacin personal). Organoclorados (DDT) y Organofosforado(MP). Se tomaron 50gr de suelo y se adicionaron en 450ml de agua destilada estril en un frasco (Schott Duran), se llevo a agitacin constante a 250r.p.m (shaker orbital BWR DS-500) por 10-15 minutos a temperatura ambiente, se dejo reposar por 15 minutos para permitir decantar el sedimento y separar de la fase acuosa (sobrenadante). Posteriormente se tomo 1 mililitro del sobrenadante para realizar pases sucesivos de (1ml) un mililitro de suspensin cada cuatro (4) das durante doce (12) das, en tubos de 9ml de caldo plaguicida (Anexo 1) mas DDT 2.000ng/L y Metil Parathion 2000ng/L por separado, cada procedimiento se realizo por triplicado y los inculos permanecieron en agitacin constante a 250r.p.m. a temperatura ambiente (Fig. 9 ). 40
Fig. 9: Montaje para aislamiento a de cepas en caldos plaguicidas
Pasados los 12 das, se tomaron las tres rplicas correspondientes del da doce y se realizaron diluciones en tubos de 9ml con agua peptonada de cada una de las replicas para montar los recuentos de viables por la tcnica de dilucin y re cuento en placas de agar nutritivo (Palittapongarnpim et al., 1998). Con los resultados obtenidos se procedio a seleccionar las sepas por morfotipos y aislar cada una de estas en una caja de petri con Agar nutritivo (Merck) ( Anexo 1). 9.4.3 Caracterizacin de las cepas aisladas La caracterizacin se efectu teniendo en cuenta dos caractersticas importantes: morfologa y fisiologa. 9.4.3.1 Caracterizacin morfolgica Se realiz una caracterizacin macroscpica, por medio de la observacin detallada de las caractersticas morfolgicas de las colonias en un estereoscopio Marca XXX y la comparacin de estas con guas de clasificacin morfolgica de colonias (Gua 1 de laboratorio manual de hojas de vida CBM INVEMAR) ( Anexo 5); a dems se realiz la caracterizacin microscpica a travs de un microscopio ptico MarcaXXXX, usando tcnicas de tincin como la tincin de Gram. y verde de malaquita (Anexo 2) de las bacterias aisladas y caracterizadas macroscpicamente. Luego de haber descrito las caractersticas morfolgicas tanto macroscpicas como microscpicas, se procedi a nominar cada una de las cepas con un cdigo de tres letras seguida un nmero de dos dgitos, Ej. BUC 01 (Bacteria Universidad del Cesar 01). 41
9.4.3.2 Caracterizacin fisiolgica La caracterstica fisiolgica valorada en esta fase del proyecto es la capacidad de las bacterias para tolerar plaguicidas organoclorados y la tolerancia de plaguicidas organofosforados. Para esto fue necesario realizar un lavado de clulas antes de proceder con el screening horizontal metodologa finalmente utilizada para caracterizar fisiolgicamente las cepas, garantizando de esta manera que las bacterias resultantes de este ensayo sean ciertamente tolerantes a las concentraciones de plaguicidas propuestas, y no bacterias que han sobrevivido por reservas de nutrientes del medio en el cual se encontraban anteriormente para su caracterizacin (Agar Nutritivo 16%). 9.4.4 Lavado de clulas Este procedimiento consiste en realizar pases sucesivos en un medio mnimo de sales ms contaminante (caldo plaguicida ms Metl Paration) a una concentracin determinada de la siguiente manera: A partir de los microorganismos aislados y caracterizados, se tom una asada y se inocul en tubos de ensayo con 5ml del caldo plaguicida Metil Paratin a 2000ng/lt. previamente marcado con el cdigo de cada cepa. Posteriormente se llevaron a incubar por 72 horas (Incubadora MarcaXXX) a una temperatura aproximada a la reportada en campo. Transcurridas las 72 horas, se procedi a realizar un pase de cada uno de los tubos con caldo plaguicida Metil Paratin 2000ng/L. A tubos con 5ml de caldo plaguicida Metil Paratin 400 p.p.m. (400g/L.). Posteriormente se llevaron a incubar por 72 horas a una temperatura aproximada a la reportada en campo. Finalmente, se procedi a realizar un pase de cada uno de los tubos con caldo plaguicida Metil Paratin 400 p.p.m. (400g/L.). A tubos con 5ml de caldo plaguicida Metil Paratin 400 p.p.m. (400g/L.). Posteriormente se llevaron a incubar por 72 horas a una temperatura aproximada a la reportada en campo. Transcurrido este tiempo se procedi a confirmar la pureza de las cepas resultantes de este
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procedimiento mediante la aplicacin de la tincin de Gram y su comparacin con los datos obtenidos de la caracterizacin microscpica inicial. 9.4.5 Seleccin De Cepas Para Ensayo De Tolerancia Con el fin de elegir bacterias que presentaron una capacidad de tolerancia competitiva se efectuaron dos pruebas: Concentracin Mnima Inhibitoria y seleccin horizontal en DDT y Metil Parathion (Fig.10). 9.4.5.1 Concentracin de MP Mnima Inhibitoria (CMI) Los ensayos de CMI se realizaron por triplicado y se evalu un rango de concentraciones en una escala de 6000ppm, 8000ppm, 10000ppm, 12000ppm de MP teniendo encuenta como referencia las concentraciones evaluadas por diferentes autores (Referencias), para lo cual se prepararon tubos de ensayos con 5ml de medio mnimo de sales (MMS) adicionado con MP, por cada bacteria a evaluar. Cada serie se inocul con una alcuota de 0.5 ml de un cultivo de 24 horas de crecimiento, ajustado al tubo numero 1 del patron de MacFarland (3x108 clulas/ml). Los cultivos se incubaron a 35 C y se realizaron observaciones peridicas por un periodo de 3 dias. Se estableci como tubos positivos aquellos cuyas cepas presentaron crecimientos despus que se realizo el pase a agar nutritivo y se incub a 37 C durante 24 horas. Se consider la CMI de MP como la concentracin mas baja de este compuesto, donde no se present crecimiento de bacterias (Fig.10).
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Fig. 10: Ensayo CMI en Metil Paration para seleccin de cepas
9.4.5.2 Screening horizontal Para este ensayo se tuvieron en cuenta las cepas que fueron aisladas inicialmente de metil Parathion ( Tabla ), debido a que nunca estuvieron expuestas a concentracin fijas de DDT en condiciones de laboratorio; adicionalmente tambin fueron sometidas a este screening las cepas aisladas del recuento inicial sin tratamiento de plaguicidas. Para el screening horizontal se tomaron cepas a partir de una solucin de caldo plaguicida mas metil Parathion a 12000ppm y se le realizo un pase a MMS mas DDT a 100ppm [1:1].
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Despus de transcurridas las 48 horas, se verific la pureza de las cepas por medio de una tincin de Gram, posteriormente se procedi a identificar bioqumicamente estas cepas. 9.4.6 Caracterizacin Bioqumica La caracterizacin bioqumica se realizo mediante el sistema de paneles BBL-Crystal para Gram positivos y el sistema de paneles BBL-Crystal para bacterias entricas, basados en la utilizacin y degradacin microbiana de sustratos especficos detectados por varios sistemas indicadores (Avelizapa et al., 1999). Las cepas aisladas se conservaron en el CBM del INVEMAR a 4 C en tubos inclinados con medios plaguicidas DDT y MP de acuerdo al contaminante de aislamiento y aceite mineral estril por el mtodo de subcultivo (bibliografia) a una temperatura de 0-4 9.4.7 Determinaciones Qumicas 9.4.8 Tratamiento Estadistico
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10. RESULTDOS Y DISCUSIONES 10.1 Fase De Campo (Muestreo, Almacenamiento Y Preservacin
Fig. 11: Toma de las muestras de suelo en Las reas de muestreo 1,2 y control. (Fuente. Fotografa)
Para cada una de las tres reas de muestreo, se obtuvieron 500gr de suelo los cuales fueron empacados y transportados con sus respectivos rtulos al laboratorio de microbiologa del Instituto de investigaciones marinas y costeras (INVEMAR).
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10.2 Determinacin de las propiedades fsicas del suelo Dentro de las propiedades fsicas que se analizaron de las muestras de suelo obtenidas en este estudio, se encuentran el pH, la temperatura, el porcentaje de humedad, textura, porosidad y plasticidad. Los datos de pH(Fig. 2) y temperatura (Fig. 3), por ser elementos muy sensibles y susceptible a posibles cambios durante el transporte de las muestras, debieron ser obtenidos en el momento del muestreo.
Valores de pH para las tres reasde muestreo
7 6 5
6,5 5,3 pH
pH
4 3 2 1 0 A1 A2 A3
reas de muestreo
Grfica 1: pH en reas de muestreo
Los valores de pH obtenidos para las muestras de las reas A1, A2 y A3 fueron de 6.0, 5.3 y 6.5 respectivamente. Con estos datos se observa que los valores de pH de las tres reas no se encuentran tan alejados entre si, mostrando el suelo con una caracterstica ligeramente cido.
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45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 A1
Temperatura
35,76 27 38,5
A2 Areas de Muestreo
A3 Temperatura
Grfica 2:Valores de temperatura obtenidas en las tres reas de muestreo
Los valores de temperatura obtenidos para las muestras de las reas A1, A2 y A3 fueron de 35.76 C, 27.0 C y 38.5 C respectivamente. Con estos datos se observa que los valores de temperatura entre las reas A1 y A3 no se encuentran muy alejados entre si, mientras que en el rea A2 la temperatura es mucho menor, lo cual se debe principalmente a que esta se encuentra ubicada a pocos metros de una acequia. La temperatura del ambiente es un factor que afecta la biodisponibilidad del hidrocarburo, ya que a bajas temperaturas la viscosidad y solubilidad en agua de los aceites incrementa, mientras que la volatilizacin se reduce (Venoza y zhu, 2003). La temperatura presente en las muestras analizadas, oscila en un rango entre 25 y 40 C, lo cual puede ser una ventaja durante un proceso de biodegradacin ya que a nivel del metabolismo microbiano la degradacin optima de estos compuestos se lleva a cabo en un rango de temperaturas de 10-40 C (Fernandez et al., 1998), por lo general las tasas de remocin de los hidrocarburos en suelos se presentan entre 20-30 C(Venoza y zhu, 2003), permitiendo que prevalezcan las poblaciones de microorganismos mesofilos (Atlas y Bartha, 2002).
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Luego de transportar las muestras al laboratorio, se realizaron los procedimientos para la determinacin del porcentaje de humedad de las muestras, a dems del anlisis de las propiedades cualitativas del suelo (tabla 1 )
Tabla 1: Determinacin de Porcentaje de Humedad A1
Replica A1R1 A1R2 A1R3
Peso Al + papel 0.9585gr 1.0398gr 1.0496gr
Peso dedal hmedo 9.0411gr 9.0939gr 9.0422gr
Peso seco dedal 8.2105gr 8.2850gr 8.2733gr
peso Muestra 0.8306gr 0.8089gr 0.7689gr
%Humedad = peso Muestra x 100 % / Peso Inicial %Humedad Total = %Humedad / Numero de Replicas %Humedad Total A1 = 8.862%
Tabla 2:Determinacin de Porcentaje de Humedad A2
Replica A1R1 A1R2
Peso Al + papel 0.9472gr 0.9379gr
Peso dedal humedo 9.7810gr 8.9998gr
Peso seco dedal 8.7067gr 7.9053gr
peso Muestra 1.0743gr 1.1945gr
%Humedad = peso Muestra x 100 % / Peso Inicial %Humedad Total = %Humedad / Numero de Replicas %Humedad Total A2 = 12.128%
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Tabla 3: Determinacin de Porcentaje de Humedad A2
Replica A1R1 A1R2
Peso Al + papel 0.9661gr 0.9595gr
Peso dedal humedo 9.1316gr 8.9827gr
Peso seco dedal 9.0100gr 8.7908gr
peso Muestra 0.1216gr 0.1919gr
%Humedad = peso Muestra x 100 % / Peso Inicial %Humedad Total = %Humedad / Numero de Replicas %Humedad Total A2 = 1.756% El procedimiento para la determinacin de % de Humedad Total de realiz por duplicado. El rea de muestreo numero uno posee una replica adicional (A1R3) debido a que este procedimiento es un requisito previo en la metodologa de extraccin de plaguicidas en sedimentos (Anexo), haciendo necesario utilizar esta muestra como estndar (con concentracin de DDT conocida) para darle validez al mtodo.
Determinacin de % de Huemdad Total

14,00% %Humedad Total 12,00% 10,00% 8,00% 6,00% 4,00% 2,00% 0,00% A1 A2 reas de Muestreo A3
%humedad Total 1,76% 8,86% 12,13%
Grfica 3: Porcentaje de Humedad en las areas de muestreo
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El comportamiento de la humedad en las reas A1, A2 y A3 se encontraron variables, con porcentajes desde 1.76% en el rea numero 3 hasta 12.13% en el rea numero 2. mientras que el rea numero 1 presentaba una humedad de 8.86%. El rea numero 1 present una humedad intermedia con respecto a A2 y A3, debido a encontrarse vegetacin ya que las races de estas permiten mantener el nivel de humedad en el suelo. El rea numero 2 presenta una humedad alta con respecto a A1 y A3, debido a que se encuentra ubicada a pocos metros de un arroyo y con una buena vegetacin aumentando as la capacidad de retencin y almacenamiento de fluidos en el suelo. El rea numero 3 presenta una humedad baja con respecto a A1 y A2 por ser una rea rida, suelo arenoso lodoso, sin vegetacin, y con exposicin directa del sol. por tal razn no se puede a retener la humedad. Es importante resaltar que sta rea es un campo de ftbol. Geosismica y Ambiente (1997). Encontraron resultados parecidos cuando determinaron los componentes geosfericos del municipio de Agustn Codazzi reportando que el suelo tiene contenido de hierro y magnesio que impiden la penetracin de las races, limitando su uso, por ende disminuye la capacidad de retencin y la capacidad de almacenar fluidos.
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Textura:
Tabla 4:Resultados de Granulometria Muestra A1
Numero de tamiz 1 2 3 4 5 6 <63 m
Dimetro de la Red 2.0 mm 1.0 mm 500 m 250 m 125 m 63 m <63 m
Peso de Muestra (gr) 1.91 3.54 8.51 11.34 10.41 9.75 54.54
Segn la clasificacin de sedimentos de la plataforma continental colombiana por el tamao del grano, la muestra de suelo es de tipo Arenas Lodosas, debido a que del 10 al 90 % de las partculas presentan un dimetro menor a 63 m .
Tabla 5: Resultados de Granulometria Muestra A2
52
Tabla 6: Resultados de Granulometria Muestra A3
Es importante resaltar que la textura del suelo es importante tanto para las races de las plantas como para las comunidades microbianas que viven en el suelo. Los suelos arenosos, son pobres en nutrientes, con una capacidad de retencin de agua y de intercambio inico muy baja, se secan fcilmente, pero estn bien drenados y por ellos se mantienen xicos (Atlas & Bartha, 2002), caracterstica que favorece al establecimiento en el suelo de la microbiota aislada en ste estudio.
53
10.3 Aislamiento de Cepas Nativas en las Estaciones Monitoreadas. Antes de realizar el aislamiento de las cepas de las diferentes estaciones de muestreo, se hizo un recuento de viables inicial de la densidad de bacterias hetertrofas encontradas en el suelo, obteniendo los siguientes resultados (tabla. 7 ).
Tabla 7: Recuento inicial de clulas viables
rea de Muestreo A1 A2 A3
Recuento (clulas/ml) 1,20x10-5 1,05x10-5 8,9x10-4
En la tabla 7 se observan los recuentos de clulas viables encontradas en las tres reas de muestreo, obteniendo valores que oscilan entre 10-4 para el A3 o rea control y 105
para las reas A1 y A2, demostrando que en el rea control existe una mayor
densidad de bacterias hetertrofas disponibles en el suelo. Pasados 12 das, despus de realizar los pases sucesivos de los inculos en los caldos plaguicidas DDT y metil Parathion 2000 ng/lt, se realiz un segundo recuento de viables para las tres reas de muestreo con tres replicas cada una, teniendo en cuenta ambos plaguicidas, procedimiento que arrojo los siguiente resultados (tabla 8):
Tabla 8: Recuento de clulas viales despues de 12 das en contacto con plaguicidas rea de Muestreo A1 A2 A3 R1 6,14X10-7 1,54X10-7 3,56X10-6 Metil Parathion R2 7,60X10-7 1,36X10-7 3,88X10-6 R3 9,12X10-7 1,40X10-7 7,78X10-6 R1 7,67X10-7 3,00X10-7 2,13X10-7 DDT R2 6,43X10-7 3,66X10-7 1,33X10-7 R3 8,42X10-7 6,70X10-7 1,22X10-7
La tabla 8 muestra que los recuentos obtenidos en las tres Replicas despus doce das de contacto directo con los plaguicidas DDT y Metil Parathion es similar para las reas de muestreo A1 y A2 con valores de 10-7, aunque se aleja significativamente de 54
los resultados obtenidos en el rea de muestreo A3 o rea control que presenta una mayor densidad de bacterias hetertrofas viables que en las reas anteriores con valores de 10-6 UFC, mantenindose una proporcin similar a la obtenida en el recuento inicial. La diferencia entre los recuentos obtenidos, se debe principalmente a que las reas de muestreo A1y A2 han estado expuestas a sustancias que alteran el equilibrio y las propiedades fsico-qumicas del suelo, afectando tambin la disponibilidad de nutrientes para necesarios para el metabolismo microbiano (Geosismica y ambiental, 1997).
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Tabla 9: Cepas aisladas en el municipio de Codazzi (Cesar), con su contaminante y estacin de aislamiento respectivamente
Cepa
BUC1 BUC2 BUC3 BUC4 BUC5 BUC6 BUC7 BUC8 BUC9 BUC10 BUC11 BUC12 BUC13 BUC14 BUC15 BUC16 BUC17 BUC18 BUC19 BUC20 BUC21 BUC22 BUC23 BUC24 BUC25 BUC26 BUC27 BUC28 BUC29 BUC30 BUC31 BUC32 BUC33 BUC34 BUC35 BUC36 BUC37
Contaminante
Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial DDT Metil Parathion DDT Metil Parathion Metil Parathion DDT Metil Parathion DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT
Estacin
A2 A2 A2 A2 A2 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 AC AC A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 A1 AC
Cepa
BUC38 BUC39 BUC40 BUC41 BUC42 BUC43 BUC44 BUC45 BUC46 BUC47 BUC48 BUC49 BUC50 BUC51 BUC52 BUC53 BUC54 BUC55 BUC56 BUC57 BUC58 BUC59 BUC60 BUC61 BUC62 BUC63 BUC64 BUC65 BUC66 BUC67 BUC68 BUC69 BUC70 BUC71 BUC72 BUC73 BUC74 BUC75
Contaminante
DDT DDT DDT DDT DDT Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion DDT DDT DDT DDT DDT DDT Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion Metil Parathion DDT Metil Parathion Metil Parathion DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT DDT
Estacin
A1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC AC A1 A1 A2 AC AC AC AC AC A2 AC
56
En esta etapa se aislaron 75 cepas en total (tabla 9), entre las tres reas de muestreo, de las cuales 20 fueron aisladas a partir del recuento inicial y sin la adicin de ningun tipo de plaguicida; 21 a partir de Metil Partin y 34 a partir de DDT (grafica 4), mostrando que la mayor cantidad de cepas aisladas poseen la capacidad de tolerar el DDT a 2000ng/litro
Aislamientos de contaminantes iniciales Numero de cepas 40 30 20 10 0

34 21 20
Serie1
DDT
Metil Paration
recuento inicial
Contaminante
Grfica 4: Cantidad de cepas aisladas segn el contaminante
10.4 Caracterizacin de las cepas aisladas las 75 cepas aisladas fueron caracterizadas por su morfolgia microscpica, obteniendo que un 54 % de estas fueron bacilos Gram negativos, un 43% bacilos Gram positivos, y slo un 3% cocos Gram positivos (grafica 5). Este resultado se debe principalmente a que la mayora de las bacterias reportadas en los procesos de degradacin de Hidrocarburos pertenecen al grupo de las Gram negativa (Ruberto et al., 2003), los lipopolisacaridos de las membrana de las bacterias Gram negativas ayudan en la formacin y estabilizacin de emulsiones de hidrocarburos y contribuyen al incremento en la superficie de ataque del contaminante confirindoles a estas una ventaja comparativa para la asimilacin de 57
hidrocarburos (Sikkema et al.,1995). Sin embargo, la posibilidad de las bacterias Gram positivas de producir endosoras representa un gran elemento de adaptacin a condiciones adversa como la exposicin directa a diversos contaminantes (Madigan et al., 2001).
Morfologias Aisladas
Bacilos Gram Negativos Bacilos gram Positivos cocos gram positivos
3% 43% B 54%
Grfica 5: caracterstica microscpica de cepas aisladas
58
59
10.4 Seleccin De Cepas Para Ensayo De Tolerancia
10.4.1 CMI en metil Parathion 6000 p.p.m 12.000 p.p.m Las 75 cepas aisladas y caracterizadas morfolgicamente fueron sometidas a un ensayo de concentracin minima hinhibitoria CMI en un rango de 6000 p.p.m 12.000 p.p.m de Metil Parathion, de lo cual se obtuvo que 39 cepas fueron tolerantes a una concentracin de 12000p.p.m de Metil Paratin
60
61
10.4.2 Screaning Horizontal A partir de las cepas obtenidas en el CMI, se escogieron aquellas cepas que nunca haban estado en contacto directo con el DDT, para determinar cuales de estas eran tolerantes al DDT, y asi poder confirmar que poseen la capacidad de tolerar tanto el Metil Parathion como el DDT; a este ensayo sobrevivieron 7 cepas tal como lo indica la tabla N 10.
Tabla 10: resultado de cepas sometidas al screening horizontal Metil partin-DDT CEPA BUC1 BUC2 BUC3 BUC5 BUC6 BUC9 BUC10 BUC12 BUC22 BUC27 BUC29 BUC43 BUC44 BUC45 BUC48 BUC49 BUC51 BUC52 BUC53 TOLERANCIA AL DDT Negativa Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Positiva Positiva Negativa Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Positiva Negativa
Finalmente, se obtuvieron 15 cepas tolerantes a los plaguicidas Metil partin y DDT; en la grafica N 6 se observa claramente la selecci realizada, pueto que de las 75 cepas aisladas inicialmente, 39 cepas que corresponden al 52% del total aislado fueron tolerantes a Metil Parathion a 12000p.p.m, pero solo 15 de las 75 cepas iniciales que correspnden al 20% del total de cepas aisladas fueron tolerantes a Metil Parathion a 12000p.p.m y a DDT 100p.p.m.
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seleccion de cepas
80 70
75
Numero de cepas
60 50 40 30 20 10 0 cepas iiciales tolerancia a 12000 tolerancia a DDT y metil p.p.m de metil paration paratin
39 15
Ensayos
Grfica 6: ensayos de seleccion de cepas tolerante a DDT y Metil Paration
10.5 Identificacin Bioqumica de Las cepas tolerantes a DDT y Metil Parathion.

Tabla 11: cepas identificadas mediante ell sistema de paneles BBL Crystal Codigo de Cepa BUC2 BUC5 BUC9 BUC23 BUC27 BUC29 BUC31 BUC38 BUC39 BUC41 Nombre de la Cepa Bacillus brevis Bacillus brevis Bacillus brevis Bacillus cereus Corynebacterium pseudogenitallum Pseudomonas aeuroginosa Burkholderia cepacia Corynebacterium pseudogenitallum Posiblemente Burkholderia sp Burkholderia cepacia Validez de Biotipo Confianza 3,350,809 99% 6,593 99% 7623 99,90% 65,88 99% 8,982,009 50% 732,342 77,80% 2,233 99% 998,001 69% 17,564,205 97,80% 20,532 97%
63
BUC45 BUC52 BUC58 BUC67 BUC68
Vibrio cholerae Burkholderia cepacia Bacillus brevis Burkholderia cepacia Bacillus subtillis
25,000,000 25,000,000 3381 20,324 10,000,000,000
25% 98% 99% 99% 43%
Quince cepas correspondientes a los gneros Bacillus (Bacillus brevis, B. subtilis B. cereus) Corynebacterium pseudogenitallum, Burkholderia tambin conocida como Pseudomonas (Burkholderia cepacia, Burkholderia sp., Pseudomonas aeuroginosa) Vibrio cholerae, se identificaron mediante el sistema BBL Cristal (Tabla.11). Estos resultados son coherentes si tenemos en cuenta que dentro de los gneros de bacterias mas recuentes en el suelo podemos encontrar Bacillus, Burkholderia o Pseudomonas y Corynebacterium, con proporciones de 7-76%, 3-15% y 2-12% respectivamente (Atlas y Baartha, 2002); a dems, en ambientes de suelos contaminados con sustancias xenobioticas se reportan generalmente la presencia de diferentes especies de los gneros Bacillus (Maarquez Rocha et al., 2005; Gmez, 2004)y Burkholderia o Pseudomonas (Arnett et al., 2000; Hay y Focht, 1998).
64
11. CONCLUSIONES El suelo del municipio de Codazzi (Cesar), es un suelo de tipo Arenas lodosas, con caractersticas ligeramente cido. De un total de 75 cepas aisladas, 39 toleran Metil Parathion a 12000p.p.m, y 15 cepas tienen la capacidad de tolerar tanto Metil Parathion a 12000p.p.m, como DDT a 100p.p.m. el 54% de la cepas aisladas fueron bacilos Gram negativos, el 43% fueron bacilos Gram positivos; mientras que de las cepas seleccionadas como tolerantes a Metil Parathion a 12000p.p.m y DDT a 100p.p.m.el 53,3% correponden a bacilos Gram positivos y el 46,6% son bacilos Gram negativos. Las cepas seleccionadas como tolerantes a Metil Parathion a 12000p.p.m y DDT a 100p.p.m. se identificaron bioqumicamente como Bacillus (Bacillus brevis, B. subtilis B. cereus); Corynebacterium pseudogenitallum; Burkholderia tambin conocida como Pseudomonas (Burkholderia cepacia, Burkholderia sp., Pseudomonas aeuroginosa) y Vibrio cholerae.
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12. RECOMENDACIONES
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BIBLIOGRAFIA
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ANEXO 1. Medios de cultivo Agar Nutritivo Composicin (g/litro) Peptona de Carne Extracto de Carne AgarAgar Medio Plaguicidas (Gomez, 2003) Componentes Fundamentales Del Caldo Plaguicidas Nutriente FeSO4 KH2PO4 NaCl MgSO4 *7H2O CaCl2 *2H2O Extracto de levadura Fenol K2HPO4 Microelementos Caldo Plaguicida Nutriente Cantidad H3BO3 0,4 mg/litro ZnSO4 *7HO 0,43 mg/litro MnCl2 *H2O 0,6 mg/litro Na2Mo4 *2H2O 0,2 mg/litro CuSO4 0,32 mg/litro Adicionar el Volumen de plaguicida dependiendo de la concentracin deseada. Cantidad 4,67 mg/litro 0,45 gr/litro 0,9 gr/litro 0,2 gr/litro 0,04 gr/litro 1,0 gr/litro 10,0 gr/litro 0,9 gr/litro 5,0 3,0 12,0
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AENXO 2. Tinciones Tincin de Gram Componentes:
Cristal Violeta solucin de Iodina Alcohol acetona Safranina.

Tincin de Esporas Componentes: Verde de Malaquita Eosina amarillenta Safranina
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ANEXO 3 Lavado Qumico De Materiales (INVEMAR 2005) Sumergir el material de vidrio sucio en aguas con bastante jabn por un periodo no menor de 24 horas. Posteriormente lavar con abundantes agua y sumergir el material en Extran alcalino 5%. Dejar en remojo por 24 horas. Pasadas las 24 horas, lavar con abundante agua del grifo. Con mucho cuidado impregne el material con solucin de cido crmico (sln sulfocrmica), de tal manera que el vidrio Lavar con agua destilada, las cavidades internas del material de vidrio. Lavar con agua preextraida, las cavidades internas del material de vidrio, posteriormente lavar con metanol. Tomar con cuidado el material lavado y colocarlo en el horno, que se encuentra en el Laboratorio de Qumica. Solicitar el encendido del Horno al auxiliar encargado del manejo de estos equipos del Lab. de Qumica. Secar a 150C por 2 horas, excepto el material de vidrio volumtrico como probetas y balones aforados.
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ANEXO 4. Metodologa De Granulometria Para cada una de las muestras recolectadas en campo se separaron 250 g, que se pesaron en una balanza de precisin METTER PE 600, para secar en horno a temperatura de 90 5 durante un tiempo de 48 horas, luego se disgregaron y pesaron 100 1 g de cada muestra recogida. Los 100 1g se tamizaron en un Rotap Fritch Vibratory Sieve Sharker durante 15 minutos, con 6 tamices de dimetro de ojo de malla de 2 y 1mm, 500, 250, 125, 63 m y el fondo para el tamao menor de 63 m. Para la clasificacin de sedimentos segn su granulometra se utiliz la tabla de tamao de grano de Wentworth (en Restrepo, 2001),
Tabla 12: clasificacin de suelo segun el tamao del grano
CLASIFICACIN mm 2 1 500 m 250 m 125 m 63m <63 m GRNULOS
CLASE GRAVAS
ARENAS MUY GRUESAS ARENAS GRUESAS ARENAS ARENAS MEDIAS ARENAS FINAS ARENAS MUY FINAS LIMOS LODOS
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ANEXO 5. Guias de Classificacin Morfolgica
72
73
ANEXO6 Clasificacin morfolgica de las Cepas Aisladas

Caracteristica Microscopica Nmero de Cepa BUC1 BUC2 BUC3 BUC4 BUC5 BUC6 BUC7 BUC8 BUC9 BUC10 contaminante Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Recuento inicial Gram Bacilo Gram positivo Bacilo Gram positivo Bacilo Gram negativo corto Bacilo Gram negativo Forma concentrica concentrica redonda redonda irregular y Bacilo Gram positivo Terminal expansiva Bacilo Gram negativo corto Negativa redonda Bacilo Gram positivo Positivas rizoide Bacilo Gram positivo Terminal redonda Bacilo Gram positivo Central filiforme Bacilo Gram positivo Central filiforme irregular y Bacilo Gram positivo Central expansiva irregular y Bacilo Gram positivo Subterminal expansiva Bacilo Gram positivo Positivas rizoide Bacilo Gram Positivo Positivas arrugada irregular y Bacilo Gram positivo Central expansiva Bacilo Gram negativo Gordo Negativa redonda irregular y Bacilo Gram positivo Positivas expansiva Esporas Central Central Negativa Negativa Caracteristicas Morfolgicas Macroscopicas Color blanca beige blanca beige beige amarillo blanca blanca blanca blanca beige SuperficieOpacidad rugosa opaca lisa brillante lisa brillante lisa brillante lisa lisa rugosa lisa rugosa lisa lisa lisa rugosa rugosa lisa lisa rugosa opaca brillante opaca opaca opaca opaca brillante opaca opaca opaca opaca brillante opaca Bordes ondulado ondulado entero entero ondulado entero lobulado ondulada lobulada hilos entero lobulado dentado lobulado irregular entero lobulado 4.0 mm 2,4 mm 2.0 mm 1.8 mm 6.0 mm 7.0 mm Tamao de Colonia 3.0 mm 2.5 mm 9.0 mm 1.0 mm 2.0 mm 1.7 mm 2.8 mm 0.5 mm 6.5 mm 3.0 mm Elevacion umbonada umbonada umbonada convexa plana abultada crateriforme plana montuosa plana plana plana umbonada montuosa plana convexa Consistencia granigienta viscosa viscosa viscosa mucosa viscosa granigienta mucosa granigienta viscosa mucosa viscosa granigienta granigienta viscosa mucosa
BUC11 Recuento inicial BUC12 Recuento inicial BUC13 Recuento inicial BUC14 Recuento inicial BUC15 Recuento inicial BUC16 Recuento inicial BUC17 Recuento inicial
blanca blanca beige beige blanca
crateriforme granigienta
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BUC18 Recuento inicial BUC19 Recuento inicial BUC20 Recuento inicial BUC21 DDT BUC22 Metil Paration BUC23 DDT BUC24 Metil Paration BUC25 Metil Paration BUC26 DDT BUC27 Metil Paration BUC28 BUC29 BUC30 BUC31 DDT DDT DDT DDT
Bacilo Gram neativo Grande Bacilo Gram negativo Delgado Bacilo Gram positivo Bacilo Gram negativo Bacilo Gram positivo Bacilo Gram positivo Bacilo Gram positivo
Negativa Negativa Positivas negativa Positivas Central Terminal
concentrica concentrica concentrica redonda arrugada irregular y expansiva redonda con margen radial irregular y expansiva concentrica redonda
blanca beige
lisa lisa lisa lisa rugsa rugosa lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa rugosa lisa lisa lisa lisa
brillante brillante opaca brillante opaca opaca opaca
entero ondulado irregular entero lobulado ciliado ciliado
3.5 mm 5.0 mm 2.5 mm 1.3 mm 3.8 mm 6.5 mm 3.5 mm 1.0 mm 2.5 mm 1.5 mm 1 mm 3.0 mm 1,3 mm 2.2 mm 2.0 mm 1.5 mm 4,2 mm 2.0 mm
umbonada umbonada plana convexa montuosa montuosa plana plana convexa umbonada convexa convexa convexa montuosa convexa convexa
viscosa viscosa viscosa viscosa granigienta viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa viscosa mucosa viscosa viscosa mucosa viscosa
blanca blanca blanca beige verde verde transpare nte blanca blanca blanca
Bacilo Gram positivo Positivas Bacilo Gram negativo cortos negativa Bacilo Gram positivo Bacilo Gram negativo Gordo Cocos Gram Positivos Bacilo Gram negativo Gordo Bacilo Gram negativo negativa negativa negativa negativa negativa
opaca ondulado brillante ondulado fluorescent e ondulado brillante brillante brillante brillante brillante brillante brillante brillante fluorescent e fluorescent e fluorescent e brillante entero ondulado ondulado ondulado entero ondulado entero entero
BUC32 DDT BUC33 DDT BUC34 DDT BUC35 DDT BUC36 DDT BUC37 DDT BUC38 DDT BUC39 DDT BUC40 DDT
Bacilo Gram negativo negativa Bacilo Gram negativo Gordo negativa Bacilo Gram negativo Bacilo Gram positivo negativa Positivas
redonda redonda redonda redonda redonda(expan siva) verde redonda geige beigeconcentrica verde redonda crema
crateriforme mucosa convexa mucosa
Bacilo Gram negativo Bacilo Gram Positivo pequeo Bacilo Gram negativo Bacilo Gram negativo
negativa negativa negativa negativa
concentrica redonda con margen rizoide verde beigeexpansiva verde redonda crema
lisa lisa lisa lisa
lobulado ondulado ondulado entero
1.0 mm 2.5 mm 2,6 mm 1,0 mm
umbonada convexo convexo abultada
viscosa viscosa mucosa viscosa
75
BUC41 BUC42 BUC43 BUC44 BUC45
DDT DDT Metil Paration Metil Paration Metil Paration
BUC46 Metil Paration BUC47 Metil Paration BUC48 Metil Paration BUC49 BUC50 BUC51 BUC52 BUC53 BUC54 BUC55 BUC56 Metil Paration Metil Paration Metil Paration Metil Paration Metil Paration DDT DDT DDT
Bacilo Gram negativo Bacilo Gram negativo Gordo Cocos Gram Positivos Bacilo Gram negativo Bacilo Gram negativo Bacilo Gram Positivo pequeo Bacilo Gram negativo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo pequeo Bacilo Gram Positivo Bacilo gram positivo Bacilo Gram negativo Gordo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram negativo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Posotivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo
Negativa negativa negativa negativa negativa negativa negativa Positivas negativa negativa Subterminal negativa Positivas negativa Positivas Positivas
expansiva redonda redonda redonda concentrica redonda redonda redonda redonda redonda arrugada redonda
beigeverde blanca beige beige amarillo beige amarillo
lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa rugosa lisa
fluorescent e brillante brillante brillante brillante brillante brillante opaca brillante brillante brillante brillante transparent e brillante opaca brillante brillante brillante opaca brillante brillante opaca opaca opaca
ondulado entero ondulado entero ondulado entero ondulado ondulado entero entero lobulada entero entero ondulado lobulado ondulado lobulado lobulado lobulado entero lobulado ramificado ciliado lobulado
2,6 mm 1.5 mm 3.0 mm 1.5 mm 1.8 mm 2.5 mm 1.2 mm 1.2mm 1.5 mm 1.3 mm 2.8 mm 0.7 mm 0.5 mm 1.8 mm 4.7 mm 2.8 mm 1,2 mm 1,2 mm 9.5 mm 1,2 mm 2.5 mm 4,8 mm 2.0 mm 2,3 mm
convexo convexa convexa abultada umbonada umbonada convexa plano convexa convexa umbonada convexa convexa convexa montuosa montuosa convexo convexo montuosa montuosa plana plana plana montuosa
mucosa viscosa mucosa mucosa viscosa viscosa viscosa granigienta viscosa mucosa mucosa mucosa mucosa mucosa granigienta viscosa viscosa viscosa granigienta viscosa viscosa mucosa granigienta viscosa
amarillo
BUC57 DDT BUC58 BUC59 BUC60 BUC61 BUC62 DDT DDT Metil Paration Metil Paration Metil Paration
BUC63 Metil Paration BUC64 DDT
redonda concentrica formaL-F compleja redonda con borde Positivas festonado redonda con borde Subterminal festonado Positivas rizoide Terminal arrugada Central filiforme Positivas filamentosa redonda con Positivas margen radial negativa arrugada
beige beige transpare nte lisa lisa blanca rugosa blanca rugosa blanca blanca beige beige blanca blanca blanca blanca lisa lisa rugosa rugosa lisa rugosa rugosa rugosa
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pequeo BUC65 Metil Paration BUC66 Metil Paration BUC67 DDT BUC68 DDT BUC69 DDT BUC70 DDT BUC71 DDT BUC72 BUC73 BUC74 BUC75 DDT DDT DDT DDT Bacilo Gram Postivo Bacilo Gram variable delgado Bacilo Gram negativo delgado Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram negativo delgado Bacilo Gram negativo pequeo Bacilo Gram Positivo delgado Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram Positivo Bacilo Gram negativo Gordo Positivas negativa negativa Positivas Positivas negativa negativa negativa Positivas Positivas negativa Irregular y expansiva irergular y expansiva redonda expansiva concentrica concentrica concentrica lisa blanca blanca transpare nte blanca beigeverde amarillo lisa lisa lisa lisa lisa lisa transparent e entero opaca brillante brillante opaca brillante brillante ciliado entero lobulado Entero entero entero 1.5mm 8.9 mm 1,5 mm 1.2 mm 1.3 mm 3.0 mm 1,0 mm plana mucosa
crateriforme viscosa convexa plana convexa convexa umbonada mucosa viscosa granigienta mucosa viscosa
redonda redonda filiforme
naranja blanca blanca
lisa lisa lisa
brillante brillante opaca
entero ondulado ciliado
2.0 mm
convexa 0,8convexa 7.8 mm plana
viscosa mucosa mucosa
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ANEXO 7. Marco normativo internacional y nacional 7.1 Internacional Las directrices internacionales, elaboradas por los organismos de las Naciones Unidas, han servido como referencias para la reglamentacin en los diferentes pases. A rengln seguido se mencionan algunas. a. Cdigo Internacional de Conducta para la Distribucin y Utilizacin de Plaguicidas. Adoptado por la Conferencia de la FAO en su vigsimo tercer perodo de sesiones, mediante la Resolucin No. 10 de 1985. Uno de sus objetivos es promover las prcticas que fomenten el uso eficaz y seguro de los plaguicidas. Para ello recomienda a los gobiernos y las industrias de plaguicidas que realicen esfuerzos concertados para elaborar y promover la aplicacin de Sistemas Integrados de Control de Plagas. En 1997 la FAO estim que en los pases en desarrollo existan unas cien (100) mil toneladas de sustancias txicas y que su eliminacin, sin daos al medio ambiente, podra costar hasta quinientos (500) millones de dlares. Por su parte, los pases del Sur acumulan cien mil toneladas de plaguicidas obsoletos. La FAO denuncia que " Las existencias obsoletas de plaguicidas son bombas de tiempo potenciales...". Culpa a los pases donantes, a las organizaciones de asistencia, a las empresas agroqumicas y a los pases receptores de la acumulacin de estas sustancias. Entre las posibles soluciones frente a este peligro plantea devolverlos a los pases de origen- Caso Yemen-, prohibir su importacin y promover programas de control ecolgico de las plagas. b. Directrices de Londres: Tienen su origen en una decisin del Consejo Directivo del Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), entre cuyos objetivos estn mejorar el manejo de sustancias qumicas en todos los pases, a travs del intercambio
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de informacin cientfica, tcnica, jurdica y econmica, y darle prevalencia a las consideraciones ambientales y de salud. c. Procedimiento del Concepto Informado Previo -PIC. Se trata de un procedimiento voluntario adoptado por la FAO y el PNUMA en 1989, frente a las denuncias de los pases en desarrollo, acerca del riesgo implcito derivado del incremento del uso de agroqumicos. Para el efecto se cre la lista de sustancias PIC. El propsito del PIC es permitir a los Estados evaluar el riesgo-beneficio del producto qumico, considerando su bioacumulacin, toxicidad, persistencia y movilidad, para adoptar las decisiones respecto a su reglamentacin y futura importacin. d. Convenio de Basilea: Su principal finalidad es el control de los desplazamientos transfronterizos de desechos peligrosos y su eliminacin por parte de los pases generadores. Este mecanismo regula el comercio y movimiento de los residuos txicos provenientes de los pases desarrollados. e. Convenio sobre los Contaminantes Orgnicos Persistentes COPs- Firmado por Colombia el 23 de mayo de 2001. Reconoce que los contaminantes orgnicos son un problema global, que se debe proveer asistencia tcnica y tecnolgica a las naciones en desarrollo para cumplir el convenio y seala la lista denominada "La docena sucia", que incluye igual nmero de qumicos, entre ellos el DDT. Las directrices internacionales, elaboradas por los organismos de las Naciones Unidas, han servido como referencias para la reglamentacin en los diferentes pases. A rengln seguido se mencionan algunas.
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7.2 Nacional Una de las causas de descoordinacin entre las diferentes entidades radica en la dispersin del marco legal para la regulacin del uso y manejo de plaguicidas. Algunas de estas normas se mencionan a continuacin: a. Ley 9 de 1979. Cdigo Sanitario Nacional. Incluye normas generales sobre la produccin, formulacin, almacenamiento, distribucin, movilizacin, aplicacin area de los plaguicidas. b. Decreto 1843 de 1991. Reglamenta la Ley 09 de 1.979 sobre uso y manejo de plaguicidas con el objeto de evitar que afecten la salud de la comunidad, la sanidad animal y vegetal o causen deterioro al medio ambiente. Crea el Consejo Nacional y los Consejos Seccionales de Plaguicidas. c. Ley 101 de 1993 y Decreto 1840 de 1994. Asignan al Instituto Colombiano Agropecuario -ICA las funciones del Ministerio de Agricultura en materia de plaguicidas. El citado Decreto contempla, entre otras actividades el control y vigilancia epidemiolgica en el uso y manejo de plaguicidas que ayuden a prevenir efectos nocivos en la salud, sanidad ambiental y vegetal, y el establecimiento de controles, tales como el concepto toxicolgico y permiso de uso, que debe otorgar el Ministerio de Salud, y la Licencia de Venta que expide el ICA. d. Resolucin del ICA 3079 de 1995 Por la cual se dictan disposiciones sobre la industria, comercio y aplicacin de bioinsumos y productos afines, de abonos o fertilizantes, enmiendas, acondicionadores del suelo y productos afines; plaguicidas qumicos, reguladores fisiolgicos, coadyuvantes de uso agrcola y productos afines. e. Resolucin del ICA 30 de 1995. Por la cual se adopta el Manual Tcnico de Procedimientos para la Acreditacin y Muestreo de Insumos Agrcolas. Establece como funciones del ICA el control tcnico de los insumos agrcolas que se comercialicen en el
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pas, la autorizacin para exportar plaguicidas y la de llevar los registros de productores e importadores. f. Resolucin del ICA 1068 de 1996. Adopta el Manual Tcnico en materia de aplicacin area y terrestre de los insumos agrcolas. g. Ley 99 de 1.993. Otorga al Ministerio del Medio Ambiente la funcin de expedir Licencia Ambiental para la importacin y produccin de plaguicidas, teniendo en cuenta los Estudios de Impacto Ambiental, y de reglamentar lo concerniente a la ubicacin de las plantas de produccin de los mismos. h. Decreto 1753 de 1.994 En su artculo 7 establece los casos en los cuales se requiere de licencias ambientales y en su ordinal 8. se especifica esta licencia para la produccin, importacin de plaguicidas y aquellas sustancias, materiales y productos sujetos a controles por virtud de tratados, convenios y protocolos internacionales ratificados por Colombia. Corresponde a las Corporaciones Autnomas Regionales en su respectiva jurisdiccin otorgar Licencia Ambiental o implementar Planes de Manejo Ambiental para el transporte y almacenamiento de plaguicidas, as como para las pistas de fumigacin. i. Ley 253 de 1996 Por medio de la cual se aprueba el Convenio de Basilea. j. Ley 430 de 1.998: Regula la prohibicin de introducir desechos peligrosos al pas. k. Poltica de Uso y Manejo de Plaguicidas. Aprobada por el Consejo Nacional Ambiental en julio de 1998. Tiene por objetivo general prevenir y minimizar los impactos y riesgos sobre los seres humanos y el medio ambiente, que pueden ocasionarse en las diferentes etapas del ciclo de vida de los plaguicidas. Entre los objetivos especficos, se plantea minimizar, aprovechar y disponer adecuadamente de los residuos de plaguicidas; recuperar las reas altamente contaminadas por malas prcticas de manejo y disposicin, y reducir el uso de dichas sustancias.
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Las estrategias y lneas de accin se basan en la articulacin con las dems polticas gubernamentales del Plan Nacional de Desarrollo, el fortalecimiento institucional, el establecimiento de un sistema de calidad ambiental sobre plaguicidas, la promocin de la produccin ms limpia, la promocin de la autogestin, y por ltimo, la regulacin, formulacin e implementacin de instrumentos econmicos. l. Proyecto de Asistencia Tcnica Ministerio del Medio Ambiente- Ministerio de Salud-Organizacin de Naciones Unidas para la alimentacin y la Agricultura (FAO). La FAO se compromete a apoyar al Gobierno de Colombia brindando asistencia tcnica, capacitacin de personal en el tema, y coordinacin de acciones y bsqueda de recursos para la financiacin de la disposicin final adecuada de plaguicidas obsoletos. De lo expuesto se puede sealar que las entidades competentes en torno al tema de este Informe, son, en el nivel nacional, los Ministerios de Salud y del Medio Ambiente y el ICA. Regionalmente, actan las corporaciones autnomas regionales, los departamentos administrativos y las secretaras de salud. 4. Casos Objeto de la Investigacin Defensorial La investigacin defensorial se fundament en el anlisis y seguimiento de los siguientes casos, algunos de estos visitados por una Comisin Interinstitucional de la cual hizo parte la Defensora del Pueblo. 1. Manejo y disposicin de los excedentes de DDT de propiedad del Ministerio de Salud. 2. Almacenamiento inadecuado de plaguicidas utilizados en la produccin de algodn en el corregimiento de Caracolicito, municipio del Copey, departamento del Cesar y en el municipio de Codazzi, departamento del Cesar. 4.4 Situacin Pistas areas de fumigacin 4.5 Prohibicin del uso del plaguicida Endosulfan
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Es de anotar que en desarrollo del Convenio suscrito entre la FAO y los Ministerios de Salud y Medio Ambiente, se firm el Proyecto FAO TCP 0065 "Asistencia Tcnica para la eliminacin de plaguicidas obsoletos", que tiene previstos los siguientes resultados:

Inventario Nacional de entierros y depsitos Proyecto de Poltica Nacional para la prevencin de futuras existencias de plaguicidas obsoletos Bsqueda de recursos para la disposicin final, con prioridad Copey, Codazzi y DDT Ministerio De Salud.
El citado Proyecto fue presentado por parte del Ministerio del Medio Ambiente a diferentes entidades del Estado, entre ellas a la Defensora del Pueblo, el pasado 2 de febrero de 2001
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ANEXO 8. Almacenamientos de DDT en Colombia a. Honda Tolima El 27 de febrero de 2001 la Defensora del Pueblo, Delegada para los Derechos Colectivos y del Ambiente, visit las Bodegas del Ministerio de Salud en el municipio de Honda, conjuntamente con tres expertos de la FAO y funcionarios de los Ministerio del Medio Ambiente y de Salud, de la Corporacin Autnoma Regional del Tolima - CORTOLIMA y de la Secretara de Salud del Tolima. Se pudo constatar lo siguiente en relacin con el almacenamiento del txico:
Para la custodia de las bodegas el Ministerio de Salud cuenta con una persona, que no dispone de ningn tipo de proteccin para ingresar a stas. Adicionalmente su vivienda familiar, lugar donde ejerce todas su actividades domsticas, se ubica dentro de las mismas instalaciones, aproximadamente a cinco (5) metros del lugar de almacenamiento del DDT.
Los olores, frecuentes en la zona, se perciben desde la llegada al lugar. Segn los expertos de la FAO, el material almacenado se encuentra en uno de los ms altos grados de concentracin (DDT al 75%).
Parte del producto est empacado en cajas de cartn, rotas y hmedas, lo que ocasiona que el txico se disperse por el suelo. El resto se encuentra en canecas plsticas las cuales fueron empacadas, al parecer, como parte del contrato con la firma DIAQUIN LTDA.
No existe la iluminacin adecuada, ni la sealizacin respectiva, adems los techos se encuentran deteriorados. Lo anterior permite presumir que en poca de lluvias, se presentan filtraciones que generan arrastre de la sustancia.
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Las condiciones de ventilacin dentro de las bodegas son deficientes. La ubicacin de las canecas es inapropiada. Impide el fcil ingreso para realizar labores de mantenimiento y supervisin.
La poblacin de Honda est en una situacin de alto riesgo, dada la proximidad (100 metros) de la planta de potabilizacin de agua.
No se cuenta con el respectivo permiso de CORTOLIMA, de conformidad con la normatividad vigente en materia ambiental en el pas.
En sntesis, existe un almacenamiento de desechos peligrosos que no se somete al marco normativo nacional e internacional.
b. Bogot, Distrito Capital El 15 marzo de 2001 la Defensora del Pueblo, Delegada para los Derechos Colectivos y del Ambiente, visit en compaa de un funcionario del Ministerio de Salud las bodegas de almacenamiento del DDT, ubicadas en la Avenida Caracas al sur de la Calle Primera, costado occidental de la Capital. En resumen lo observado fue lo siguiente:
En las bodegas propiedad del Ministerio de Salud, donde se encuentra almacenado el DDT, funciona tambin el almacn central del Ministerio y el cuarto fro donde se localizan las existencias de productos orientados a los programas de vacunacin que adelanta a nivel nacional dicha Cartera.
Asimismo, en una parte de la bodega opera un taller de mecnica particular. Segn informacin proporcionada por funcionarios de dicho Ministerio tal espacio fue dado en arrendamiento. Sin embargo, las personas que trabajan en el taller no conocen del contenido de las canecas, a pesar de que laboran a tres metros de ellas.
Cincuenta (50) canecas plsticas estn al aire libre expuestas a las condiciones climticas. El da de la visita llova fuertemente lo que permiti apreciar el aceleramiento en el deterioro de los empaques y el desprendimiento de las etiquetas por la accin del agua.
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Se evidencia la existencia de cajas rotas, colocadas unas sobre otras, sin ningn orden de almacenamiento. Tambin se observ la presencia de cartones, plsticos y papeles impregnados de DDT, esparcidos por las bodegas. La sealizacin de peligro y la iluminacin son inadecuadas.
c. Cartagena, Bolvar, Guaina y Antioquia Basados en el Acuerdo de Cooperacin Econmica, Cientfica y Tcnica entre el Gobierno de la Repblica Cooperativa de Guyana y la Repblica de Colombia, el Gobierno de Colombia entreg a la Repblica de Guyana en calidad de donacin doce (12) toneladas de DDT, producto que fue transportado desde el municipio de Honda a la ciudad de Cartagena en camiones pagados por el gobierno guyans y embarcado el cuatro de abril de 1998. El contenedor enviado por Guyana y perteneciente a la compaa P&Q Nedloyd no cont con la suficiente capacidad. Parte del producto tuvo que ser almacenado bajo la custodia del Departamento Administrativo Distrital de Salud. En la actualidad se desconocen las condiciones de su almacenamiento. Otros depsitos, segn informacin reciente del Ministerio de Salud, se encuentran en los departamentos de Antioquia(1613 kilos) y Guaina (604 kilos).
d. Municipio de Codazzi, Departamento del Cesar. El primer entierro se estableci en 1963, en las afueras del municipio de Codazzi, lugar donde funcionaba uno de los centros operativos de dicha Federacin. Esta entidad dej de operar en el rea en 1984 y en sus instalaciones entr a funcionar en los aos noventa el Instituto Tcnico Agropecuario Antonio Galo Lafaurie Celedn. Una visita oficial que inclua funcionarios del Ministerio del Medio Ambiente, CORPOCESAR, la Secretara de Salud, el Jefe de Saneamiento Bsico del Hospital Agustn Codazzi y la Personera Municipal, recomend trasladar dicho Centro, previo el descubrimiento de ms de setenta canecas con txicos como DDT, Arseniato de Plomo, Metil Parathion, Etil Parathion y Endosulfan.
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Por otra parte, la firma Geoelctrica y Ambiente realiz un estudio solicitado por CORPOCESAR, financiado por el Fondo Nacional de Regalas, en el que se ubican tres posibles enterramientos de plaguicidas en la zona y se disea un relleno sanitario para sustancias txicas. A pesar de estos hallazgos, las autoridades no han actuado y las toneladas de desechos continan depositadas bajo tierra. Entre los efectos de lo anterior, se observa que las aguas subterrneas del municipio de Codazzi muestran altos grados de contaminacin. El arroyo El Pozn, que pasa cerca de los basureros detectados, desemboca en el ro Cesar que a su vez lleva estas aguas por Chiriguan, Chimichagua y desemboca ms adelante en el ro Magdalena. El 23 de marzo de 2001 una Comisin conformada por funcionarios de la alcalda municipal de Codazzi, CORPOICA, CORPOCESAR, Secretara de Salud Departamental y un consultor de la FAO visitaron el municipio de Codazzi. El objetivo de la visita era reconocer la situacin actual y localizar otros sitios de posibles enterramientos. A continuacin se resume lo observado por la Comisin:
El lugar indicado como enterramiento principal, sealado en el estudio realizado por Geoelctrica y Ambiente, presenta fuertes olores a txico. La pista de fumigacin de FADECO Fumigaciones Areas de Codazzi, se encuentra activa, pese a no aplicar las medidas ambientales y sanitarias que exige la Ley, tales como la prevencin para los operarios en las actividades de lavado de las aeronaves y la de impedir la participacin de menores de edad en las mismas.
Tampoco existe un tratamiento adecuado de los desechos lquidos y slidos. Los primeros desembocan en un pozo superficial, con grave impacto sobre el arroyo El Pozn.
Adems, paralelo a la pista, aproximadamente a 15 metros del eje de sta, se ubica un corral de ordeo, cuyo producto es vendido sin procesar en el permetro urbano del municipio.
En otra de las pistas inspeccionadas se estaba realizando una quema, a cielo abierto y sin ninguna clase de precaucin, de empaques de Methil Parathion, material txico de uso restringido. Al igual que en la anterior, en las instalaciones se encontraba ganado caprino y bovino. 88
El barrio de invasin denominado La Pista, ubicado en la calle 22 entre carreras 18 y 19, se localiza en el sitio en el que anteriormente oper una pista de fumigacin denominada SALA Ltda.
Frente a lo anterior, la FAO recomend:
Profundizar en la investigacin de posibles enterramientos, partiendo de la informacin recogida en el estudio realizado por Geoelctrica y Ambiente. Establecer pozos de monitoreo que permitan identificar el grado de contaminacin. Prohibir el pastoreo de ganado dentro de las pistas de fumigacin, puesto que, a travs de la cadena alimenticia, el contaminante o sus metabolitos afectan a los seres humanos.
Prohibir la manipulacin de los plaguicidas por parte de menores de edad. Establecer medidas de prevencin para los operarios.
e. Corregimiento de Caracolcito, municipio del Copey, departamento del Cesar Mediante oficio de fecha enero 24 de 1996, la Secretara de Medio Ambiente del municipio de Soledad, Atlntico, elev una denuncia ante la Corporacin Autnoma Regional del Atlntico - CRA, por la forma antitcnica como la Empresa Almacn General de Depsitos - ALPOPULAR tena almacenados, en las bodegas ubicadas en Barranquilla, unos tanques deteriorados de propiedad de la Federacin Nacional de Algodoneros que contienen sustancias txicas. En el concepto tcnico No. 122 de la CRA de abril 9 de 1996 se determin que en "Las bodegas de la Almacenadora Popular, ALPOPULAR. Se observaron unos tanques a cielo abierto con pesticidas organofosforados de nombre METHIL PARATHION, TOXAFENO Y FEDEMETIL. Debido a la temperatura que alcanzan por la accin de los rayos solares, evaporan los agentes activos voltiles cargados de olores desagradables que impactan hacia sitios a donde se dirige el viento". La Resolucin No. 00152 de la CRA de mayo 16 de 1996, concedi un plazo de treinta das para que ALPOPULAR reubicara y le diera tratamiento tcnico a los tanques que contienen las citadas sustancias, de tal forma que mitigue, corrija, compense y maneje los efectos ambientales que stas puedan generar.
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La CRA emiti la Resolucin 00293 de agosto 26 de 1.996 en la que impuso a la almacenadora ALPOPULAR el cumplimiento, de manera perentoria, de varias obligaciones para el manejo de los qumicos, con fundamento en el concepto tcnico No 084 96 del Ministerio del Medio Ambiente. Entre las recomendaciones de dicho concepto se estableci "Otorgar un trmino perentorio de setenta y dos (72) horas al representante de ALPOPULAR para que reubique y remueva cuidadosamente las canecas evitando la exposicin de personas a efectos nocivos, particularmente por va inhalatoria". La Corporacin, en visita a las instalaciones de ALPOPULAR, el 17 de julio de 1.997, observ que los tanques haban sido trasladados a una bodega en Caracolito, desde mayo de 1996. Mediante concepto tcnico No 207 del 29 de julio de 1.997 se expres que ALPOPULAR dio cumplimiento a lo requerido por la CRA, en la Resolucin citada. Asimismo, se conceptu que la CRA deba notificar a la Corporacin Autnoma Regional del Cesar - CORPOCESAR a cuya jurisdiccin se movilizaron los tanques y los residuos slidos contaminados con los productos en mencin. Lo anterior con el fin de prevenir a la autoridad ambiental del Cesar sobre los riesgos ambientales inherentes al almacenamiento antitcnico que se le dio a los mismos y la inadecuada disposicin final de los residuos slidos (tanques desocupados). Pese a lo anterior, el traslado y descargue de las sustancias qumicas se llevaron a cabo sin advertir a la comunidad, ni a los trabajadores que movilizaron de los camiones las canecas, sobre las precauciones que deban ser tomadas sobre dichos qumicos. Frente a estos hechos, algunos ciudadanos interpusieron Accin de Tutela contra la Federacin Nacional de Algodoneros y CORPOCESAR por considerar haban vulnerados sus derechos fundamentales. El Tribunal Superior del Distrito Judicial de Valledupar mediante providencia de fecha septiembre 30 de 1997 tutel los derechos fundamentales a la salud y a la vida de los demandantes y orden al Ministerio del Medio Ambiente que, en coordinacin con el Ministerio de Salud, evaluara las caractersticas qumicas y fsicas de los productos almacenados en las bodegas del Centro Nacional de Algodn, CENALGODON 800 tanques metlicos de 55 galones con Methil Parathion y Toxafeno - a fin de determinar la conducta que debe seguirse. 90
De la misma manera, en esta Providencia se dispone compulsar copias a la Fiscala General de la Nacin y a la Procuradura General para que si se considera oportuno se iniciaran las correspondientes investigaciones. Esta Defensora ha solicitado a los mencionados organismos informar sobre el particular. El Ministerio del Medio Ambiente dio cumplimiento al fallo de tutela mediante la expedicin de la Resolucin 968 de 31 de octubre de 1997 ordenando a la Federacin Nacional de Algodoneros
Realizar en forma inmediata las adecuaciones necesarias para garantizar las condiciones seguras de almacenamiento de los plaguicidas. Identificar y clasificar las canecas. Comercializar el Methil Paration siguiendo las respectivas pautas. Destruir, mediante incineracin controlada el Toxafeno y Methil Paration que no se comercializare. Destruir trmicamente las canecas vacas.
Las medidas impuestas por el Ministerio del Medio Ambiente no fueron acatadas por la Federacin Nacional de Algodoneros, aduciendo siempre falta de presupuesto para realizar tales actividades, razn por la cual el Tribunal Superior de Valledupar sancion con arresto al representante legal de la Federacin y le impuso multa a sta. Por su parte, CORPOCESAR mediante Resolucin 015 de mayo 25 de 2.000, sancion a la Federacin Nacional de Algodoneros con multa por valor de trescientos (300) salarios mnimos mensuales. Dicha sancin no ha sido notificada al gerente liquidador de la Federacin, para lo cual CORPOCESAR ha decidido comisionar a la Corporacin Autnoma Regional CAR, para que adelante esta diligencia. Sobre el particular, esta Corporacin inform que adelanta una investigacin interna por cuanto la resolucin mencionada, un ao despus de expedida, an no se encuentra ejecutoriada. El da 29 de febrero de 2001 la Defensora del Pueblo realiz una visita a las bodegas de CENALGODON ubicadas en el corregimiento de Caracolicito, municipio del Copey. En la misma participaron funcionarios de CORPOCESAR, Secretara de Salud Departamental,
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FAO, Personero Municipal del Copey, Alcalde Municipal del Copey, Procurador Judicial Ambiental del Cesar y Ministerio del Medio Ambiente. Durante la visita se pudieron constatar los siguientes hechos:
Las instalaciones no cuentan con ningn tipo de seguridad. Cualquier persona y animal puede acceder a ellas sin ningn obstculo. Las instalaciones han sido saqueadas y se han retirado, sin permiso canecas con los productos almacenados. A escasos dos metros del lugar de almacenamiento de las sustancias, pastan vacas y burros. Las canecas que contienen los productos, se encuentran oxidadas y corrodas. Consecuencia de lo anterior es que parte de los productos se encuentran en el piso.
En Comisin posterior organizada por la FAO, se realiz inventario de los productos almacenados, que arroj un total de 654 canecas de 55 galones y 119 canecas de 16 galones cada una. En esta oportunidad, tambin se visit la Escuela Mixta Camilo Torres, construida en 1993, que cuenta con 300 alumnos en dos jornadas. En el rea donde funciona este centro docente existi una pista para fumigacin area denominada SERVIAEREOS. Debido a los fuertes olores, se present denuncia ante la Secretara de Salud. Entidad que recomend la reubicacin de la institucin educativa, lo cual, cuatro aos despus, no se ha llevado a cabo. La Comisin encontr nios jugando desnudos expuestos al contacto con los txicos que todava se encuentran en el lugar, tales como residuos de manguera. Tambin se observ ganado pastando en la zona. La FAO a travs de su comisionado recomend:

El traslado del centro educativo. La prohibicin del pastoreo de ganado en dicha rea.
92
ANEXO 9
93

To de Bacterias Nativas Con La Capacidad de Tolerar Compuestos Organicos Persistentes

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AISLAMIENTO DE BACTERIAS NATIVAS CON CAPACIDAD DE TOLERAR COMPUESTOS ORGANICOS PERSISTENTES (DDT y METIL PARATHION) A PARTIR DE SUELO CONTAMINADO

CON XENOBIOTICOS EN EL MUNICIPIO AGUSTIN CODAZZI (CESAR).

GRIDIS YULIETH CORTES HENAO LUIS MARIANO VERGARA NIEBLES

Notas de Aceptacin ______________________ ______________________ ______________________ ______________________

___________________________ Firma del Presidente Del Jurado

___________________________ Firma del Jurado

___________________________ Firma del Jurado Valledupar

MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE-MIONISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL, 1998

GEOSISMICA Y AMBIENTE CORPOCESAR, 1997.

fabricados con base en minerales tales como

RECALCITRNTE Producto qumico totalmente resistente al ataque microbiano.

Degradacin aerbica muy lenta

Degradacin relativamente rpida

CCl2 DDE Persistente, a menudo un producto de cometabolismo OH

DDD o TDE HClEliminacin directa del HCl

CCl3 Dicofol, metabolito menor

Posterior degradacin por

HClEliminacin directa de HCl

Fig. 3: Ruta metabolica del DDT (tomado de Nadeau et al., 1994)

Fig. 4: Estructura qumica del Metil Parathion (tomado de strand, 1992)

Fig. 5: Ruta Metabolica del Paration

Fig. 9: Montaje para aislamiento a de cepas en caldos plaguicidas

Fig. 10: Ensayo CMI en Metil Paration para seleccin de cepas

10. RESULTDOS Y DISCUSIONES 10.1 Fase De Campo (Muestreo, Almacenamiento Y Preservacin

Grfica 1: pH en reas de muestreo

Grfica 2:Valores de temperatura obtenidas en las tres reas de muestreo

Replica A1R1 A1R2 A1R3

Peso Al + papel 0.9585gr 1.0398gr 1.0496gr

Peso dedal hmedo 9.0411gr 9.0939gr 9.0422gr

Peso seco dedal 8.2105gr 8.2850gr 8.2733gr

peso Muestra 0.8306gr 0.8089gr 0.7689gr

Tabla 2:Determinacin de Porcentaje de Humedad A2

Replica A1R1 A1R2

Peso Al + papel 0.9472gr 0.9379gr

Peso dedal humedo 9.7810gr 8.9998gr

Peso seco dedal 8.7067gr 7.9053gr

peso Muestra 1.0743gr 1.1945gr

Tabla 3: Determinacin de Porcentaje de Humedad A2

Replica A1R1 A1R2

Peso Al + papel 0.9661gr 0.9595gr

Peso dedal humedo 9.1316gr 8.9827gr

Peso seco dedal 9.0100gr 8.7908gr

peso Muestra 0.1216gr 0.1919gr

Determinacin de % de Huemdad Total

Grfica 3: Porcentaje de Humedad en las areas de muestreo

Numero de tamiz 1 2 3 4 5 6 <63 m

Dimetro de la Red 2.0 mm 1.0 mm 500 m 250 m 125 m 63 m <63 m

Tabla 5: Resultados de Granulometria Muestra A2

Numero de tamiz 1 2 3 4 5 6 <63 m

Dimetro de la Red 2.0 mm 1.0 mm 500 m 250 m 125 m 63 m <63 m

Tabla 6: Resultados de Granulometria Muestra A3

Numero de tamiz 1 2 3 4 5 6 <63 m

Dimetro de la Red 2.0 mm 1.0 mm 500 m 250 m 125 m 63 m <63 m

Tabla 7: Recuento inicial de clulas viables

Recuento (clulas/ml) 1,20x10-5 1,05x10-5 8,9x10-4

Aislamientos de contaminantes iniciales Numero de cepas 40 30 20 10 0

Grfica 4: Cantidad de cepas aisladas segn el contaminante

Grfica 5: caracterstica microscpica de cepas aisladas

10.4 Seleccin De Cepas Para Ensayo De Tolerancia

Grfica 6: ensayos de seleccion de cepas tolerante a DDT y Metil Paration

10.5 Identificacin Bioqumica de Las cepas tolerantes a DDT y Metil Parathion.

BUC45 BUC52 BUC58 BUC67 BUC68

25,000,000 25,000,000 3381 20,324 10,000,000,000

Notas de Aceptacin