UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

PROCESSOS FERMENTATIVOS

Trabalho acadmico apresentado disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paran ministrada.

CURITIBA 2008

SUMRIO

1- USO DE MICRORGANISMOS NA FERMENTAO....................................

2- DEFINIO DE FERMENTAO.................................................................. 8 3- METABOLISMO MICROBIOLGICO............................................................ 10

3.1- FERMENTAO ETANLICA................................................................. 15 3.2- FERMENTAO DE CIDO LCTICO................................................... 3.3- FERMENTAO DO GLICEROL............................................................ 3.4- FERMENTAO ACETONA-BUTANLICA........................................... 19 20 22

3.5- FERMENTAO BUTANOL-ISOPROPANLICA................................... 24 3.6- FERMENTAO ACETONA-ETANLICA.............................................. 3.7- FERMENTAO DO CIDO PROPINICO........................................... 3.8- FERMENTAO DO CIDO CTRICO................................................... 4- CULTIVO DE CLULAS MICROBIANAS...................................................... 4.1- BACTRIAS............................................................................................. 4.2- FUNGOS.................................................................................................. 25 26 27 28 28 29

4.3- LEVEDURAS............................................................................................ 29 5- CULTIVO DE CLULAS ANIMAIS E VEGETAIS.......................................... 31

6- APLICAES DA FERMENTAO.............................................................. 35 6.1- PRODUO DE ALIMENTOS................................................................. 6.2- PRODUO DE ANTIBITICOS............................................................ 36 39

6.3- PRODUO DE ENZIMAS...................................................................... 40 6.4- PRODUO DE ANTICORPOS.............................................................. 6.5- PRODUO DE INOCULANTES............................................................ 6.6- TRATAMENTO AMBIENTAL................................................................... 40 41 42

6.7- PRODUTOS RECOMBINANTES............................................................. 43 7- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................... 46 8- ANEXO............................................................................................................ 49

1- USO DE MICRORGANISMOS NA FERMENTAO

A utilizao de microrganismos na biotransformao da matria vem desde a antiguidade. Atravs da observao do ambiente ao seu redor, o ser humano passou a perceber que certos processos se desenvolviam devido presena de microrganismos no meio. A descoberta de microrganismos que podiam modificar um determinado substrato possivelmente foi feita ao acaso, como ao perceber que a carne seca resistia a deteriorizao; ou que ao deixar o leite azedar era possvel retirar o lquido do coalho para fabricar queijo; ou ainda que ao secar os gro antes da estocagem era possvel evitar o aparecimento de fungos. (TORTORA et al., 2006) A partir dessas observaes, foi possvel estudar mais a fundo e utilizar esses microrganismos de forma a atender da melhor forma as nossas necessidades. Os babilnios e os sumrios usavam leveduras na produo de lcool antes de 6000 AC (NAJAFPOUR, 2007). J os egpcios, em 2000 AC, utilizavam leveduras para a produo de pes. Na sia, antes do nascimento de Cristo, utilizava-se Penicillium rouquefortii na produo de queijos. A 2500 anos atrs, na China, o fungo Aspergillus oryzae era usado no processo de fabricao de koji, que foi levado tambm para o Japo no sculo VII (PANDEY et al., 2007). Na metade do sculo XIX, Luis Pasteur estudou a funo de microrganismos na produo de vrios produtos como alimentos fermentados, vinho, cervejas, queijo, leite, iogurte, combustveis e qumica fina. Ele identificou muitos processos microbiolgicos e descobriu um dos principais princpios da fermentao: a utilizao de substratos por microrganismos para a produo de metablitos primrios e secundrios de interesse ao homem (NAJAFPOUR, 2007). Atravs do isolamento de alguns microrganismos e cultivo em meio adequado, Pasteur tambm conseguiu desvendar a base do que hoje recebe o nome de biotecnologia. Para se conseguir um bom rendimento muitas vezes necessria presena de um cultivo puro com somente um microrganismo isolado e evitar o aparecimento de microrganismos indesejados, que podem alterar o processo. Alm disso, uma vez terminado o processo, necessrio que os microrganismos presentes tambm sejam desativados. Para isso, Pasteur desenvolveu em 1864 o processo de pasteurizao, que consiste em aquecer um determinado meio a uma temperatura de 60C por 30 minutos (SCHWARTZ, 2001).

Durante a Primeira Guerra Mundial comeou-se a utilizar microrganismos para a produo de substncias como etanol, acetona e cido ctrico. Foi durante esse perodo que foi feito pela primeira vez um cultivo microbiolgico assptico em larga escala, quando Chaim Weizmann usou um fermentador lquido para a produo de acetona por Clostridium acetobutylicum (STANBURY et al.,1995). A partir da Segunda Guerra Mundial, os microrganismos tiveram importncia na produo em larga escala de antibiticos. (TORTORA et al., 2006) As usinas de bioprocessos so muito importantes na indstria de alimentos, qumica fina, e farmacutica. Apesar de que a produo de produtos como cervejas, vinhos e queijos j vm acontecendo desde a antiguidade, atualmente a produo muito mais controlada e eficiente (NAJAFPOUR, 2007). Por exemplo, primeiramente, os pes eram fermentados com leveduras presentes no meio ambiente. Mais tarde passou-se a manter uma cultura prpria de leveduras, guardando uma parte da produo anterior para servir de inculo para a prxima. Atualmente pode-se comprar o fermento produzido industrialmente de forma padronizada. (TORTORA et al., 2006) Processos como a produo de pes, vinhos e queijos, que antes eram realizados em casa ou pequenas propriedades, passaram a ser realizados em grades indstrias, evidenciando a grande vantagem que a microbiologia pode dar indstria (PRESCOTT et al., 1959). Exemplificando, pode-se citar a ao de leveduras em extratos de frutas ou gros, fazendo fermentao alcolica, onde os carboidratos so reduzidos a piruvato e ento ocorre a reoxidao da forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotdeo (NADH) e a produo de molculas de etanol. Outro tipo de fermentao inclui o cultivo de bactrias acticas na produo de vinagre. Bactrias lcteas so responsveis pela preservao do leite, produo de iogurte e queijo. Num cultivo pode-se visar tambm produo de biomassa, onde as clulas esto em meio nutritivo que favorece a multiplicao, como na produo de fermento (NAJAFPOUR, 2007). A tabela 1 mostra alguns produtos de fermentao.

Tabela 1- Produtos de origem fermentativa Produto da fermentao Etanol (no utilizado em bebidas) cido 2-cetoglucnico Pectinase, protease Amilase bacteriana Protease bacteriana Dextrano Sorbose Cobalamina (vitamina B12) cido Glutmico cido glucnico cido Ltico cido ctrico Acetona-butanol Insulina, interferon Incio de cultura Microrganismo Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp. Aspergillus niger, A. aureus Bacillus subtilis B. subtillis Leuconostoc mesenteroides Gluconobacter suboxydans Streptomyces olivaceus Brevibacterium sp. Aspergillus niger Rhizopus oryzae Aspergillus niger, A. wentii Clostridium acetobutylicum Aplicao Qumica fina Intermedirio para o cido Daraboascrbico Agente clarificante em sucos de frutas Amido modificado, tratamento de papel Tratamento de fibras, removedor manchas Estabilizante alimentcio Manufatura de cido ascrbico Suplemento alimentar Aditivo alimentar Produtos farmacuticos Alimentos e produtos farmacuticos Alimentos, medicamentos Solventes, intermedirios qumicos Terapia humana Produo de pes, queijo e iogurte Suplemento alimentar Antibiticos Antibiticos Antibiticos

E. coli recombinante Levedura de po, Lactobacillus bulgaricus Protena microbiana Candida utilis Penicilina Penicillium chrysogenum Cefalosporina Cephalosparium ecremonium Eritromicina Streptomyces erythreus Fonte: NAJAFPOUR, 2007

Os microrganismos utilizam uma fonte orgnica e produzem metablitos primrios como o etanol, que so formados durante a fase de crescimento exponencial, ao mesmo tempo em que as novas clulas so produzidas, e a curva de produo do metablito segue a curva de crescimento celular quase que paralelo, como mostra o grfico esquerdo da figura 1. Outros produtos como a penicilina e polissacardeos so considerados metablitos secundrios, sendo produzidos durante a fase estacionria. A fase de crescimento exponencial anterior a produo de metablitos secundrios camada de trofofase, e a etapa estacionria em que h produo chamada de idiofase, como mostra o grfico da direita da figura 1.

Um metablito secundrio pode ser a simples converso de um metablito primrio ou tambm pode ser originado de outros compostos, mas pode necessitar uma quantidade suficiente de clulas ou metablitos primrios acumulados

(NAJAFPOUR, 2007; TORTORA et al., 2006).

Figura 1- Metablito primrio e secundrio.

Fonte: TORTORA et al., 2006. Os bioprocessos vm substituindo uma srie de processos que antigamente s podiam ser feitos quimicamente. Eles apresentam algumas vantagens como a possibilidade de utilizar matria-prima barata e disponvel no mercado (como por exemplo, o bagao de cana), o processo pode ser desenvolvido sob presses e temperaturas normais (evitando sistemas pressurizados caros e perigosos), e no h a produo em quantidade de resduos txicos (e quando h a produo, ainda existe a possibilidade de utilizar um outro processo microbiolgico no tratamento do resduo). (TORTORA et al., 2006) Os processos desenvolvidos no cultivo de microrganismos se desenvolvem geralmente em equipamentos denominados biorreatores. Eles consistem em um sistema aberto ou fechado, onde h a manipulao dos parmetros fsicos (pH, concentrao de reagentes, transferncia de calor e massa, aerao) de forma a regular a catlise, promovendo um melhor rendimento em biomassa e/ou produto, alm de tentar minimizar os custos de produo (PURICH & ALLISON, 2000). Eles

geralmente so tanques cilndricos que apresentam ou no sistema de agitao, mas tambm podem ser um simples erlenmeyer. Novos modelos de biorreatores aparecem constantemente, de forma a melhorar a qualidade do processo dependendo do tipo de clula a ser cultivada (bactrias, fungos, tecidos animais ou vegetais, clulas ou enzimas imobilizadas, etc.) (DORAN, 1995). Ao se utilizar um biorreator, procura-se atender, se no todos, a maioria dos requisitos listados abaixo: O recipiente onde ocorrer o cultivo dever permanecer em condies asspticas durante um grande perodo de tempo. Devem ser promovidas condies adequadas de agitao e areao para satisfazer as condies metablicas dos microrganismos, mas sem haver danificao mecnica das clulas dos mesmos devido ao processo. O consumo de energia deve ser minimizado. Deve haver um controle de temperatura e pH. Deve haver uma forma de retirar amostras do fermentado para o controle do processo. No deve haver perdas excessivas devido evaporao. No deve haver a necessidade de uma grande quantidade de trabalhadores para a sua operao, limpeza e manuteno do tanque de fermentao, minimizando assim os custos com relao mo-de-obra. Materiais mais baratos, mas que ainda propiciam um rendimento desejado, devem ser utilizados. (STANBURY et al.,1995)

O cultivo dos microrganismos pode ocorrer em diferentes tamanhos, como em escala de bancada, piloto ou de planta industrial. Biorreatores de escala laboratorial variam de 2 100 litros, mas durante operaes em larga escala na indstria eles podem chegar a 100000 litros. Inicialmente utiliza-se biorreatores menores para se investigar qual o melhor microrganismo a ser utilizado, qual meio de cultivo proporcionar um melhor crescimento e quais condies operacionais so mais favorveis para a formao do produto desejado. So feitos estudos sobre parmetros como: transferncia de massa, agitao, taxa de cisalhamento, formao de espuma, energia necessria, taxa de diluio, forma e tamanho do biorreator, pH, temperatura, entre outros. Isso

deve ser feito em pequena escala porque no seria vantajoso fazer esses testes em larga escala, correndo o risco de perder grandes quantidades de material e ter um prejuzo econmico (NAJAFPOUR, 2007). O processo de mudana de escala est exemplificado esquematicamente na figura 2. Aps a fase de testes em frascos de 250mL a 1L e anlise dos fatores de produo, passa-se para um biorreator de bancada com capacidade de 1 a 2 litros, o qual normalmente equipado com sensores de ajuste de temperatura, pH e aerao. Isso propicia uma anlise mais cuidadosa de alguns parmetros e um controle maior sobre o processo do que o cultivo em erlenmeyer. Nessa etapa tambm deve-se observar se o processo se desenvolve melhor em batelada, semibatelada ou contnuo. Prximo passo o cultivo em um biorreator em escala piloto de 100 a 1000 litros. A cada processo de aumento de escala deve-se observar se h alguma alterao na resposta celular com relao ao rendimento do processo. Se tudo estiver correto, a etapa final seria um biorreator de escala industrial (DORAN, 1995).

Figura 2- Processo de aumento de escala

Fonte: Adaptada de DORAN, 1995

Mas ao mudar de escala laboratorial para escala industrial no ocorre somente a mudana do tamanho em proporo. Devem-se preservar alguns parmetros de forma a continuar tendo um bom processo. Esses parmetros seriam: Nmero de Reynolds ou fatores de momento semelhantes. Consumo de energia constante por unidade de volume de lquido. Velocidade da p de agitao constante. Mistura do lquido e tempos de recirculao semelhantes. Coeficiente volumtrico de transferncia de massa constante.

Manter todos os fatores ambientais constantes para o microrganismo. (NAJAFPOUR, 2007)

O cultivo de microrganismos pode ser feito utilizando substratos de baixo valor comercial, muitas vezes podendo ser resduos de outros processos. A produo de lcool e solventes orgnicos muitas vezes utiliza resduos como fonte de carbono ou nitrognio, sendo o bagao de cana, por exemplo, bem importante na indstria alcooleira. Isso bastante vivel no cultivo de microrganismos, mas j no cultivo de clulas animais isso j no possvel devido s vrias exigncias da clula, o que geralmente encarece o processo de cultivo de clulas animais (NAJAFPOUR, 2007). O papel de um engenheiro de bioprocessos entender o mecanismo de produo e selecionar o melhor biocatlisador (microrganismo ou enzima) para tal. Aps, deve-se estudar as melhores condies ambientais que propiciam um melhor crescimento e uma melhor produo. Tambm cabe ao biotecnologista otimizar o processo procurando recursos mais econmicos, mas que ainda produzam um rendimento satisfatrio (NAJAFPOUR, 2007). O artigo em anexo mostra a funo de um engenheiro de bioprocessos e os conceitos bsicos que um profissional dessa rea deve ter para o desenvolvimento de um bom trabalho.

2- DEFINIO DE FERMENTAO

Antes de se elucidar o papel dos microrganismos na fermentao, ela era definida de forma diferente do conceito aceito atualmente. Por exemplo, em 1839, Liebig definiu o termo fermentao como sendo ... a putrefao de substncias vegetais que se realiza sem que haja a liberao de nenhum odor, ou pelo menos nenhum desagradvel.. J Luis Pasteur tentou associar o processo de fermentao com o desenvolvimento de organismos: ... fermentao, longe de ser o fenmeno sem vida, um processo vivo... todo fenmeno de fermentao correlacionado com o desenvolvimento de clulas micodrmicas e plantas, as quais eu preparei e estudei em estado puro e isolado. (SCHWARTZ, 2001) Atualmente, o termo fermentao pode apresentar diferentes significados dependendo o setor do conhecimento que o utiliza. O sentido geral do termo

significa qualquer processo de cultivo microbiolgico que ocorre com ou sem ar. O significado bioqumico da fermentao o processo metablico onde o substrato orgnico atua como doador e como receptor final de eltrons, ocorrendo em condies anaerbias, mas sem a utilizao de uma cadeia respiratria, como acontece na respirao anaerbia. (TORTORA et al., 2006) O termo fermentador tambm pode gerar alguma discordncia devido a esses conceitos. Ele primeiramente foi utilizado para descrever os tanques onde ocorria o cultivo. Como a maioria dos cultivos realizados nesses tanques era de forma aerbica, props-se um novo nome para no contradizer a definio bioqumica de fermentao. O termo biorreator ento comeou a ser usado para descrever o local onde eram realizados cultivos de microrganismos em condies aerbicas e anaerbicas (NAJAFPOUR, 2007). A fermentao ocorre como uma forma de reoxidar as coenzimas reduzidas NADH e NADPH que so formados durante a gliclise, de forma a manter o balano de reduo-oxidao dentro da clula. Os eltrons so transferidos das coenzimas para um composto orgnico, fornecendo NAD + e NADP+ suficientes para a continuao da gliclise. (TORTORA et al., 2006) Durante uma fermentao, um mesmo composto orgnico pode sofrer uma oxidao ou outras a reduo dependendo do microrganismo. Por exemplo, no caso do cido pirvico, ele pode sofrer uma oxidao formando cido actico ou pode sofrer uma reduo e formar cido lctico. (CROCOMO, 1967) O tipo de fermentao realizada vai depender da espcie de microrganismo utilizada, do substrato que est sendo fornecido e dos tipos de enzimas que ele possui e esto ativas. A anlise do tipo de produto final formado na fermentao tambm pode ser utilizada como forma de identificao de microrganismos, realizando testes bioqumicos. A figura 3 mostra o tipo de fermentao que segue alguns microrganismos.

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Figura 3 Produtos finais de fermentao dependendo do microrganismo

Fonte: TORTORA et al., 2006 3- METABOLISMO MICROBIOLGICO

Antes do processo metablico que inclui a fermentao, h as reaes de quebra do substrato, que geralmente a glucose. Essa via recebe o nome de gliclise ou via de Embden-Meyerhof, onde a glucose catabolisada a piruvato e a energia livre liberada estocada na forma de ATP e NADH.

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Figura 4- Gliclise

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

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Como mostra a Figura 4, a gliclise pode ser dividida em duas etapas, a fase preparatria e a fase de pagamento. Na fase preparatria, inicialmente ocorre a fosforilao da glucose em C-6 atravs da enzima hexoquinase. Para isso deve haver o gasto de uma molcula de ATP. H ento uma converso entre glucose-6fosfato em frutose-6-fosfato atravs da fosfoexose isomerase. Aps, a molcula sofre outra fosforilao, mas agora em C-1, formando frutose-1,6-bifosfato. Essa molcula j est pronta para sofrer uma quebra em duas molculas de trs carbonos, uma diidroxiacetona fosfato e um gliceraldedo-3-fosfato. nesse passo que ocorre a lise da molcula, e por isso ela se chama gliclise. A diidroxiacetona isomerizada em outro gliceraldedo-3-fosfato. Aqui termina a etapa de preparao, onde a molcula de glucose preparada com o gasto de 2 ATP, para que depois essa energia armazenada possa gerar lucros energticos. A fase de pagamento inicia-se com duas molculas de gliceraldedo-3-fosfato, as quais so oxidadas e fosforiladas por fsforo inorgnico, formando 1,3bifosfoglicerato. A partir desse ponto acontecer a liberao de energia, onde o pagamento feito na forma de produo de ATP atravs da fosforilao nvel de substrato, diferentemente da fosforilao ligada a respirao que ocorre na cadeia respiratria. Um dos fsforos do 1,3-bifosfoglicerato ser transferido para uma molcula de ADP atravs da ao da enzima fosfoglicerato quinase, formando 3fosfoglicerato. A enzima fosfoglicerato mutase ir ento fazer uma transferncia reversvel do grupo fosfato do C-3 para o C-2, sendo que a transferncia ocorre em duas etapas. Primeiramente um grupo fosfato presente no stio ativo da enzima se liga ao C-2 do substrato, e depois o grupo fosfato em C-3 transferido para a enzima. Depois desse processo tem-se 2-fosfoglicerato. Essa molcula ir ento sofrer uma desidratao atravs da enolase, formando fosfoenolpiruvato (PEP). O PEP uma molcula de alto potencial de transferncia do grupo fosforila, e isso ocorrer com a ao da enzima piruvato quinase. Esta enzima requer a presena de ons K+ e Mg2+ ou Mn2+, e nesse ponto acontece mais uma fosforilao a nvel de substrato, com a formao de mais uma molcula de ATP por PEP. O resultado final a formao de piruvato. Considerando inicialmente uma molcula de glucose e desconsiderando desvios para outras vias, a cada molcula de glucose metabolizada, tem-se no final duas molculas de piruvato, dois ATP e dois NADH formados.

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Essa a via pela qual a maioria dos organismos realiza a quebra da glucose. No entanto, alguns microrganismos procariotos utilizam a via de Entner-Doudoroff, pois no apresentam fosfofrutoquinase-1 e no pode converter frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifosfato. No entanto, a via das pentoses-fosfato (ou ciclo da hexose monofosfato) pode ser feita ou no por esses organismos (RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001). Inicialmente, a glucose-6-fosfato ento transformada em cido 6fosfoglucnico por uma enzima desidrogenase. Esse cido ento transformado em piruvato atravs de duas reaes:
-HOH

6-P-gluconato 2-ceto-3-desoxi-6-P-gluconato (CDGP) CDGP piruvato + gliceraldedo-3-fosfato (CROCOMO, 1967) A gliceraldedo-3-fosfato ir seguir o resto da via glicoltica normal at chegar a piruvato. A Figura 5 mostra a via Entner-Doudoroff. Essa via geralmente realizada por organismos como Pseudomonas, Azotobacter, Rhizobium,

Enterococcus faecalis e Zymomonas mobilis.(TORTORA et al., 2006) Figura 5: Via de Entner-Doudoroff

H+ + NADPH

ATP

ADP

NADP+

Glucose

Glucose-6-P

cido 6-fosfoglucnico H2O

Etapas 6 a 10 da gliclise

cido Pirvico

GA-3P

CDGP

Fonte: Adaptada de TORTORA et al., 2006

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Depois de ocorrida a transformao de glucose at piruvato, em condies aerbias ocorrer o ciclo de Krebs, como mostra a Figura 6. Mas como se pode observar, esse ciclo de reaes gera muitos NADH os quais seguem para a cadeia respiratria e h a transferncia de eltrons, onde o aceptor final o oxignio. No entanto, em condies de anaerobiose, a clula no conseguir manter o balano adequado de NAD+/NADH, pois no poder utilizar essa cadeia.

Figura 6: Ciclo de Krebs (ou ciclo do cido ctrico)

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

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Portanto, em condies anaerbias evita-se o ciclo do cido ctrico (exceto nos casos de produo de metablitos para biossntese), e utiliza-se as vias fermentativas, as quais, apesar de no gerar tantas molculas de ATP como o ciclo de cido ctrico, conseguem reoxidar NADH suficientemente para manter o funcionamento celular. A Figura 7 mostra algumas das possveis vias de fermentao.

Figura 7- Vias Fermentativas

* Reaes em que h reoxidao de NADH

Fonte: RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001

seguir

sero

discutidas

em

maiores

detalhes

algumas

dessas

fermentaes.

3.1- FERMENTAO ETANLICA

possvel obter etanol de trs formas: por via destilatria, por via sinttica (a partir de hidrocarbonetos no saturados e de gases de petrleo e da hulha) e por via fermentativa. A forma fermentativa uma das mais vantajosas aqui no Brasil, pois h uma grande disponibilidade de matria-prima (LIMA et al., 2001).

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O processo reacional do etanol j comeou a ser descrito em 1815 por Gay Lussac atravs da equao: C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 G=-56000 cal/mol (CROCOMO, 1967) O francs Luis Pasteur provou que a natureza dessa reao microbiana, e se realiza atravs de uma fermentao em condies anaerbias (LIMA et al., 2001). Ele observou que a presena de O2 no meio inibia a formao de etanol, diminuindo o consumo de acar pela levedura e aumentando o crescimento celular. Essa propriedade foi chamada de Efeito Pasteur. (CROCOCOMO, 1967) No entanto, o efeito Pasteur somente observado em culturas quimioestticas quando a concentrao de substrato limita o crescimento ou quando o cultivo feito na ausncia de fontes de nitrognio (LAGUNAS et al., 1982). Lagunas e colaboradores fizeram experimentos aerbicos e observaram que S. cerevisiae cultivada na presena de fonte de nitrognio usava somente 3 a 20% do acar metabolizado para respirao, o restante ia para a via fermentativa do etanol. J leveduras cultivadas em meios sem nitrognio utilizavam 25 a 100% dos acares metabolizados para respirao. No entanto, isso no significava que ouve um aumento da respirao, mas sim uma perda da funo fermentativa devido inativao dos sistemas de transporte de acares (LAGUNAS et al., 1982). Com o avano dos estudos, foram elucidados os mecanismos reacionais intermedirios da produo de etanol a partir de glucose. At a formao de piruvato a reao segue exatamente igual a gliclise. O cido pirvico formado descarboxilado a acetaldedo e dixido de carbono. Essa etapa da reao um processo irreversvel que exige a presena da enzima carboxilase, da coenzima difosfato de tiamina e de ons magnsio. O acetaldedo ento reduzido a etanol atravs da ao da enzima desidrogenase alcolica, ocorrendo tambm nessa etapa a reoxidao de um NADH (Figura 8). O conjunto de reaes que resultam na formao de lcool etlico e CO 2 partir de um carboidrato recebe o nome de via de Embden-Meyer-Parnas. Essa via metablica foi demonstrada in vitro pela primeira vez em 1950 por Koshland e Westheimer, utilizando glucose com carbono marcado radiativamente em C1, e aps o seu consumo por leveduras, verificou-se que havia carbono radioativo na molcula de etanol, mais especificamente nodo grupo metil (CROCOMO, 1967).

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Figura 8 Transformao de piruvato a etanol

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

Nesse tipo de fermentao h um rendimento de 2 ATP por molcula de glucose consumida, pois so gastos dois ATP na reao da hexoquinase, mas so formados quatro ATP (na reao de formao de cido 3-fosfoglicrico e na formao de piruvato). As leveduras podem consumir alm da glucose outros acares, como manose e galactose. A manose sofre uma fosforilao atravs da hexoquinase, formando manose-6-fosfato, que por sua vez transformada em frutose-6-fosfato pela isomerase de manosefosfato, possibilitando assim a sua entrada na gliclise. J a galactose sofre uma transfosforilao, formando galactose-1-fosfato (CROCOMO, 1967). Tambm podem ser utilizados acares exgenos como maltose e sacarose, e endgenos como glicognio e trealose, como mostra a figura 9. Durante o cultivo, pode ocorrer tambm a formao de produtos secundrios atravs de outras vias metablicas realizadas para a o crescimento celular e produo de biomassa. Estima-se que 95% dos acares metabolizados tem como destino a produo de etanol e CO2. Os outros 5% so desviados para a formao de glicerol, cidos orgnicos (como cido succnico, actico e pirvico), lcoois superiores, acetaldedo, acetona, butilenoglicol, entre outros (LIMA et al., 2001). A fermentao alcolica realizada normalmente por leveduras como Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus, S. carlbergensis e S. warum, e bactrias como Zymomonas mobilis, sendo que as leveduras so os microrganismos mais utilizados na indstria.

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Figura 9- Utilizao de outros carboidratos na fermentao por Saccharomyces

Fonte: LIMA et al., 2001

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3.2- FERMENTAO DE CIDO LCTICO

O cido ltico foi isolado pela primeira vez a partir do leite azedo por Scheele. Pasteur tambm realizou estudos com relao fermentao lctica. Ele observou que assim como sempre encontrada levedura na produo de cerveja, onde o fermento promove a converso de acares em lcool e dixido de carbono, deve haver um fermento que produza cido lctico - a levedura lctica - convertendo acares em lactato. Ele tambm verificou que nessa fermentao o produto principal o cido lctico, mas tambm possvel encontrar no caldo fermentado outros produtos como cido butrico, lcool e manitol, sendo que suas propores podem variar (PASTEUR, 1857). Evitar essas outras vias e direcionar os compostos de carbono somente para a produo de lactato uma forma de otimizar a sua produo.

Figura 10- L-lactato a partir de piruvato

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

O cido ltico pode ser produzido atravs da fermentao de bactrias como os bactrias homofermentativos (Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L. pentosus, L. casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras e ficomicetos, e tambm de algumas algas. Ele tambm pode ser produzido de forma sinttica, atravs da hidrlise da lactonitrila (LIMA et al., 2001). O cido ltico pode apresentar duas formas esterioqumicas, devido ao carbono quiral presente. Durante a fermentao so formadas as duas formas, formando uma mistura racmica (PRESCOTT et al, 1959). A fermentao ocorre em temperaturas relativamente altas e depender do microrganismo utilizado. Lactobacillus delbrueckii cresce bem temperatura de 45C; L. bulgaricus, pode ser incubado em 45-50C; j L. pentosus, L. casei, e Streptococcus lactis podem ser cultivados em 30C (PRESCOTT et al, 1959).

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O cido ltico bastante utilizado na indstria de alimentos como acidulante e conservante de refrigerantes, gelias, xaropes e sucos de frutas (LIMA et al., 2001).

3.3- FERMENTAO DO GLICEROL

O glicerol usado amplamente como solvente, adoante, constituinte de loes, anti-spticos, adesivos, tintas, agente anti-congelante. Ele tambm utilizado na preparao de meios nutritivos biolgicos e na produo de nitroglicerina, borracha sinttica e massa de modelar (PRESCOTT et al., 1959). Ao estudar vinhos e cervejas, Luis Pasteur observou que leveduras regularmente formavam glicerol. Um pouco antes da Primeira Guerra Mundial, Neuberg, ao tentar elucidar a fermentao alcolica atravs da suplementao do meio de cultivo com sulfito de sdio, acabou descobrindo que dessa forma havia um incremento na produo de glicerol por leveduras (PRESCOTT et al., 1959). Normalmente, produz-se cerca de 3% de glicerol durante a fermentao alcolica, mas, ao se alterar o pH atravs da adio de sais alcalinos (carbonato de amnio, bicarbonato de sdio, acetato de sdio ou fosfato dissdico), possvel obter de 9 a 16% de glicerol (CROCOMO, 1967). Segundo os trabalhos de Neuberg, a produo de glicerol pode ser feita de quatro maneiras: fermentao alcolica normal, presena de sulfito, solues alcalinas ou solues neutras. No primeiro caso (Figura 11), durante a fermentao alcolica, pode ser desviado um pouco de gliceraldedo 3-fosfato, transformado em diidroxiacetona fosfato. Esta, por sua vez, sofre a ao de desidrogenase de glicerofosfato, reduzindo um NADH e formando glicerol 3-fosfato. A enzima fosfatase retira o fosfato desse composto e forma o glicerol. (CROCOCOMO, 1967)

Figura 11- Produo de glicerol durante a fermentao alcolica

Fonte: Adaptado de CROCOMO, 1967.

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J na presena de sulfito, haver acmulo maior de glicerol. Isso ocorre devido a fixao do acetaldedo pelo sulfito de sdio, atravs da reao: CH3-CHO + Na2SO3 + H2O CH3-CHO-HSO3Na + NaOH (PRESCOTT et al, 1959) Normalmente o acetaldedo transformado em etanol, mas como ele est sendo fixado e a reduo a etanol no acontece, uma outra molcula faz o papel de aceptor de hidrognio do NADH. Isso faz com que a via de formao de glicerol seja favorecida (PRESCOTT et al, 1959). A fermentao utilizando sulfito foi utilizada pelos alemes durante a Primeira Guerra Mundial. Outros agentes que impeam a transformao de aldedo a lcool tambm podem ser utilizados, como carvo, hidrazidas e oxalato de fenilhidrazina, desde que no haja impedimento de outras reaes in vivo (CROCOMO, 1967). Quando a fermentao ocorre em meio alcalino, h uma alterao no curso normal da fermentao, gerando a produo de etanol, cido actico, glicerol e CO 2. Nessas condies, o acetaldedo no reduzido a etanol, mas sim sofre a ao da mutase aldedica, formando cido actico e etanol (Figura 12). Como no ocorreu a reoxidao do NADH, a formao do glicerol a partir de diidroxiacetona fosfato favorecida (CROCOMO, 1967).

Figura 12- Ao da mutase aldedica

Fonte: CROCOMO, 1967.

A ltima forma de fermentao seria em meio neutro. Nesse caso no haver produo de etanol nem CO2, sendo acumulados glicerol e cido pirvico. Essa reao ainda no est muito bem elucidada, mas representada como: C6H12O6 CH3-CO-COOH + CH2OH-CH2OH-CH2OH

(CROCOMO, 1967)

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3.4- FERMENTAO ACETONA-BUTANLICA

Pasteur foi o primeiro pesquisador a mostrar que o lcool butlico era um produto direto da fermentao, atravs dos seus experimentos da fermentao butrica do cido ltico e do lactato de clcio em 1861: M. Pasteur... croit pouvoir affirmer que lalcool butylique est um produit ordinaire de la fermentation butyrique. (PRESCOTT et al., 1959). No entanto, foi somente em 1905 que Schardinger notificou a produo de acetona atravs da fermentao (JONES & WOODS, 1986). A partir de 1910, o qumico Chaim Weizmann trabalhou junto com outros pesquisadores no processo de fabricao de borracha sinttica. Para isso seriam necessrios compostos como butanol e isoamil, que seriam produzidos atravs de microrganismos. Em 1910 eles acharam um microrganismo capaz de produzir butanol quando cultivado em batatas. Entre 1912 e 1914 Weizmann isolou vrias culturas, as quais ele chamou de BY (e que atualmente so classificadas como bactrias da espcie Clostridium acetobutylicum). Durante a Primeira Guerra Mundial a Inglaterra precisou de grandes quantidades de acetona, e foi o microrganismo isolado por Weizmann que propiciou um aumento na produo. Como durante esse perodo no houve necessidade de butanol, ele foi estocado em grandes quantidade, sendo ele posteriormente a guerra muito utilizado como solvente na indstria automobilstica (JONES & WOODS, 1986). A produo desses solventes em escala industrial era feita antigamente na forma de batelada, usando fermentadores sem agitao mecnica e com capacidade de 50000 a 200000 gales. Os fermentadores eram enchidos de 90 a 95% de sua capacidade e o restante era preenchido com uma camada gasosa de dixido de carbono estril. O dixido de carbono tambm era borbulhado antes e depois da inoculao para facilitar a mistura (JONES & WOODS, 1986). As bactrias freqentemente utilizadas para a fermentao acetona-butanol so do gnero Clostridium. Esses microrganismos so esporulados, apresentam uma forma de basto e so sacarolticos (fermentam acares). Devido a esses fatores o isolamento dessas bactrias relativamente fcil. Elas so geralmente encontradas em associao com plantas como batatas, razes de legumes e cereais. (JONES & WOODS, 1986). Cada empresa que produz esses solventes pode possuir uma cepa de bactrias diferente. A maioria dessas culturas utilizada em processos j

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patentiados (BEESCH, 1952). As diferenas que as cepas de Clostridium podem apresentar podem ser com relao proporo de solventes que produzem, como, por exemplo: C. beijeirinckii (C. butylicum) produz solventes na mesma proporo que C. acetobutylicum, mas ao invs de acetona produz isopropanol; C. aurantibutyricum produz tanto acetona quanto isopropanol junto com butanol; j C. tetanomorphum produz quantidades equimolares de butanol e etanol (JONES & WOODS, 1986). A temperatura tima para a fermentao aceto-butanlica em torno de 30,6C, podendo variar de 28,9 at 33,3C tomando as devidas precaues de controle do processo. Os microrganismos so estritamente anaerbios e tem um maior rendimento em condies anaerbias. O pH pode variar de 5 a 7, dependendo da cepa. Usualmente utiliza-se um pH inicial de 5,5-6,5 e final de 5,2-6,2 (BEESCH, 1952). A maioria das bactrias desse gnero necessita de nitrognio de protenas degradadas no meio nutritivo para otimizar o processo fermentativo. Essa fonte de nitrognio inclui produtos intermedirios de degradao de protenas, como polipeptdeos e aminocidos, e tambm produtos finais de degradao como amnia e seus sais. Os sais de amnia e a prpria amnia do resultados satisfatrios, mas prefervel utilizar a amnia acompanhada de outros compostos nitrogenados mais complexos. Elas tambm precisam de uma fonte de fosfato, caso as fontes de carbono utilizadas (como melao ou bagao) no contenham quantidades mnimas necessrias (BEESCH, 1952). A via metablica de produo de acetona e butanol est presente na figura 13. Durante a fase inicial de crescimento (tambm chamada de fase acidognica), a bactria produz hidrognio, dixido de carbono, acetato e butirato, resultando na diminuio do pH do meio. Quando o cultivo entra em fase estacionria (chamada tambm de fase solventognica), o metabolismo passa a produzir solventes como acetona e butanol, e tambm ocorre a reassimilao dos cidos produzidos na primeira fase, ocasionando a elevao do pH (JONES & WOODS, 1986).

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Figura 13- Produo de Acetona-Butanol

Fonte: RHEM & REED, 1981.

3.5- FERMENTAO BUTANOL-ISOPROPANLICA

A formao de butanol e isopropanol como produtos principais ocorre atravs do microrganismo Clostridium butyricum, que uma bactria anaerbia formadora de esporos, com temperatura tima de 37C, flagelada e Gram-positiva em culturas jovens (podendo ser Gram-negativa em culturas mais velhas). Durante a Segunda Guerra Mundial utilizava-se Clostridium toanum para esse processo. Em 1926, Morikawa tambm isolou um microrganismo que produzia isopropanol e butanol denominado Bacillus technicus (PRESCOTT et al, 1959). Os produtos finais da fermentao incluem butanol, isopropanol, dixido de carbono, hidrognio, pequenas quantidades de cido actico e butrico, e possivelmente traos de acetona e cido frmico (PRESCOTT et al, 1959). O rendimento da fermentao de aproximadamente 53-65% de butanol, 19-44% de isopropanol, 1-24% de acetona e 3% de etanol (LIMA et al., 2001). O caminho metablico seguido at a formao de isopropanol e butanol est exemplificado na figura 14.

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A fermentao otimizada quando o suprimento de nitrognio feito atravs de protenas parcialmente hidrolisadas (como no caso anterior) e a adio de malte, extrato de leveduras, peptonas, gua de macerao de milho ou glten. A adio de acetona ou de outros aceptores de hidrognio aumentam o teor de isopropanol no meio fermentado (LIMA et al, 2001). Certas substncias podem inibir a formao de alguns produtos. A adio de bicarbonato de sdio durante a fermentao pode inibir a formao de solventes, principalmente o isopropanol, formando mais sais de cidos actico, ltico, pirvico e frmico (LIMA et al, 2001)

Figura 14- Fermentao Butanol-isopropanlica

Fonte: Adaptada de RHEM & REED, 1981.

3.6- FERMENTAO ACETONA-ETANLICA

A produo de acetona e etanol em conjunto acontece por microrganismos como Bacillus macerans e Bacillus acetoethylicus. No final da fermentao pode-se ter como produtos a acetona, o etanol, o cido actico e o cido frmico (LIMA et al., 2001). Schardinger em 1905 foi o primeiro a descobrir a acetona como produto de uma fermentao bacteriana. O microrganismo por ele isolado era o Bacillus

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macerans. Essa uma bactria mvel, esporulada, Gram-negativa e anaerbia facultativa (PRESCOTT et al, 1959). A temperatura ideal para a fermentao varia entre 40 e 43C e a fermentao dura aproximadamente 6 dias. O pH do meio influencia o produto formado. Em pH elevado h a formao de mais cidos volteis e menos etanol, enquanto em pH 5,8-6,0 h estmulo da produo de solventes (LIMA et al., 2001). No entanto, o pH timo de crescimento para B. aceoethylicus 8-9. (PRESCOTT et al, 1959). Ao meio de cultura geralmente adicionado carbonato de clcio para neutralizar os cidos formados.

3.7- FERMENTAO DO CIDO PROPINICO

Bactrias produtoras de cido propinico, em geral, podem ser caracterizadas como Gram-positivas, catalase positivas, no-esporuladas, imveis, e aerbicas facultativas. Alguns exemplos so: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. peterssonii, P. shermanii, P. pentosaceum, P. rubrum, P. technicum, P. thoenii, P. raffinosaceum, P. arabinosum e P. zeae. Elas podem ser isoladas de fontes como leite, queijo, solo, silagem, e excreta de gado (PRESCOTT et al., 1959). Micrococcus lactilycus (Veillonella gazogenes) e Clostridium propionicum tambm fazem esse tipo de fermentao (CROCOMO, 1967). As bactrias que produzem cido propinico podem fermentar um grande nmero de carboidratos, poliis e cidos orgnicos, como pentose, 2-cetogluconato, lactato, piruvato, glucose, galactose, lactose, maltose, malato, sorbitol, manitol, glicerol, entre outros. Abaixo h a estequiometria de algumas dessas fermentaes a partir de diferentes substratos: 3 glucose 2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 lactato 2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 piruvato + HOH propionato + 2 acetato +2 CO2 glicerol propionato + HOH (CROCOMO, 1967)

A figura 15 mostra a formao de propionato a partir de glicerol ou glucose. J a figura 16 mostra em mais detalhe a formao de propionato e acetato a partir de cido ltico.

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Figura 15- Produo de Propionato

Figura 16- Produo de Propionato

Fonte: CROCOMO, 1967.

Fonte: RHEM & REED, 1981.

Alm da produo de propionato, podem aparecer como subprodutos de fermentao o acetato e o dixido de carbono.

3.8- FERMENTAO DO CIDO CTRICO

O cido ctrico normalmente encontrado em frutas ctricas, abacaxis, pras, figos e pssegos. Wehmer em 1893 demonstrou a ocorrncia de cido ctrico como metablito microbiano de Citromyces pfefferianus e C. glaber em meio contendo sacarose e carbonato de clcio (PRESCOTT et al, 1959). Em 1922, Mollinard descobriu culturas de Aspergillus niger que produziam cido ctrico em condies de deficincia de fosfato. At 1953, o cido ctrico era obtido a partir de citrato de clcio. Com a descoberta de microrganismos capazes de produzi-lo, passou-se a utilizar a via fermentativa. H trs processos fermentativos que podem ser utilizados: o processo Koji (em substrato slido utilizando uma cepa especfica de Aspergillus niger), a

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fermentao em superfcie (o miclio de A. niger cresce sobre um meio de cultura esttico, sendo o produto recolhido do meio) e a fermentao submersa (meio de cultura lquido sob agitao) (LIMA et al., 2001). As espcies Aspergillus niger, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Paecilomyces divacatum, Mucor piriformis e Ustilina vulagris so usadas em laboratrio ou comercialmente para a produo desse cido, mas a importncia maior cabe ao A. niger. O pH influencia fortemente a produo de cido ctrico. A partir do controle do pH com sais inorgnicos possvel variar a proporo de cido ctrico e oxlico formados. Um pH mais baixo favorece a formao de citrato e suprime a formao oxalato, alm de minimizar as chances de contaminao (PRESCOTT et al., 1959). 4- CULTIVO DE CLULAS MICROBIANAS

4.1- BACTRIAS

Bactrias so organismos unicelulares e sem compartimentalizao interna por um sistema de membranas, ou seja, so procariticos. Elas so envolvidas por uma parede celular peptidioglicana, sendo que elas podem apresentar vrias formas, como bacilos, cocos ou espirilos. O crescimento bacteriano ocorre com o aumento do nmero de clulas, e no com o aumento do volume de uma clula. Elas se reproduzem normalmente por diviso binria, mas algumas podem fazer brotamento. Outras podem ainda se fragmentar e a partir de cada fragmento se inicia uma nova clula (TORTORA et al., 2006). Uma cultura bacteriana apresenta inicialmente uma fase lag, quando as bactrias ainda no se multiplicam e sofrem somente pequenas variaes para se adaptar ao novo meio de cultivo. Elas se encontram em um estado de latncia. Aps determinado tempo, podendo levar de horas a dias, a cultura passa para a fase log, ou crescimento exponencial. Nesse perodo os mecanismos de reproduo

encontram-se amplamente ativos e so bastante sensveis a mudanas ambientais. Depois de um longo perodo de crescimento ocorre a fase estacionria, e a taxa de diviso se torna equivalente a taxa de mortalidade. Isso pode ocorrer devido ao trmino de nutrientes, ao acmulo de produtos de degradao ou a mudanas no pH

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danosas clula. Em determinado momento, a populao microbiana entra em fase de morte celular (ou declnio), quando o nmero de mortes excede a produo de novas clulas (TORTORA et al., 2006). A maioria das bactrias cresce em pH perto da neutralidade (6,5-7,5), sendo que poucas delas (as acidfilas) conseguem crescer em pH 4. Elas podem ser cultivadas tanto em meio slido quanto em meio lquido (TORTORA et al., 2006).

4.2- FUNGOS

Os fungos pertencem ao reino Fungi e so organismos eucariticos, quimioheterotrficos, multicelulares (exceto leveduras), e com parede celular formada de glicanas, mananas e quitina. Os fungos multicelulares so classificados com relao a sua morfologia da colnia e dos esporos reprodutivos (TORTORA et al. 2006). No seu ciclo de vida pode acontecer a reproduo assexuada, atravs da fragmentao de suas hifas ou pela formao de esporos assexuais, e tambm a reproduo sexuada, atravs de esporos sexuais. Os fungos filamentosos suportam ambientes que poderiam ser hostis a bactrias. Eles conseguem suportar uma variao de pH maior que as bactrias, mas os valores timos se encontram geralmente em pH 5-6. Eles so mais resistentes presso osmtica, sendo que alguns podem crescer em concentraes relativamente altas de sais e acares. Substratos com atividade de gua muito baixa tambm podem favorecer o crescimento de fungos. A maioria deles possui metabolismo aerbico. Eles tambm conseguem metabolizar carboidratos mais complexos que as bactrias j no tm capacidade, como, por exemplo, degradar a lignina (TORTORA et al., 2006).

4.3- LEVEDURAS

Leveduras so organismos eucariticos, unicelulares, no filamentosos, e de forma oval que pertencem ao reino dos fungos. Esses organismos estariam entre as bactrias e os macro-fungos (PRESCOTT et al., 1959). Assim como as bactrias, a identificao de leveduras pode ser feita atravs de testes bioqumicos. (TORTORA et al., 2006)

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Elas podem apresentam como forma de propagao vegetativa o brotamento (gemulao), sendo que algumas podem sofrer fisso binria, como

Schizosaccharonyces (PRESCOTT et al., 1959). Em algumas espcies, como Candida albicans, o broto pode no se separar da clula me, formando o que pode ser chamado de pseudo-hifa. (TORTORA et al., 2006) As clulas de levedura so capazes de realizar metabolismo anaerbico facultativo, podendo utilizar tanto o oxignio quanto outros compostos orgnicos como aceptor final de eltrons. Elas vm sendo bastante estudadas por serem organismos eucariticos relativamente fceis de manipular, sendo ento consideradas como modelo metablico, molecular e gentico para os eucariotos assim como a bactria Escherichia coli considerada como modelo para os procariotos (BADOTTI et al., 2008). Leveduras como Saccharomyces cerevisiae so utilizadas em vrios processos, como a produo de fermento de po, extrato de levedura, cerveja, aditivos alimentcios (vitaminas, protenas, enzimas), protenas heterlogas (vacinas e outros componentes teraputicos), e produtos de interesse farmacutico atravs da manipulao de novas vias metablicas e do aumento da produo com a engenharia gentica, uma vez que o genoma de leveduras j foi inteiramente seqenciado (BADOTTI et al., 2008). Para se cultivar leveduras pode-se utilizar vrios meios de cultivo. Em meio slido, as clulas de levedura formam colnias semelhantes s de bactrias (TORTORA et al., 2006). A maioria deles consiste em uma formulao que dispe dos nutrientes necessrios para o crescimento de leveduras e ingredientes que inibem o desenvolvimento de bactrias e bolores. Um dos meios bastante indicados para o isolamento de leveduras o YM (yeast malt extract medium). Sendo organismo saprfitos, as leveduras exigem a presena de uma fonte de carbono elaborada para conseguir energia. Tambm pode ser necessria a adio de vitaminas (tiamina e cido pantotnico), de nitrognio, fsforo, enxofre, potssio, magnsio, clcio, zinco, mangans, cobre, ferro, cobalto, iodo e outros elementos trao (LIMA et al., 2001). As leveduras da espcie Saccharomyces cerevisiae utilizam nitrognio na forma amoniacal (NH4+), amdica (uria) ou amnica (na forma de aminocidos), no

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conseguindo metabolizar nitrato ou protenas do meio. O fsforo absorvido na forma de H2PO4-, e o enxofre na forma de sulfato, sulfito ou tiosulfato. Elas so microrganismos mesfilos, com temperatura tima em aproximadamente 26 a 35C, e com pH timo por volta de 4 a 5. A manuteno dessas condies evita a contaminao do cultivo por outros microrganismos (LIMA et al., 2001). 5- CULTIVO DE CLULAS ANIMAIS E VEGETAIS

Apesar da utilizao de protenas recombinantes em bactrias como Escherichia coli, algumas modificaes estruturais ps-traducionais s podem ser feitas eficientemente em outros tipos de clula, como de mamferos e insetos. O cultivo de clulas de mamfero tem grande importncia na produo de estruturas especficas como anticorpos, que atualmente apresenta uma demanda bastante elevada. (SCHEPER et al., 2006) Tambm de grande importncia na produo de vacinas virais, citocinas, bioinseticidas (como o baculovrus), enzimas (asparaginase, colagenase, citocromo P450, fatores sangneos VII, VIII e IX, pepsina, renina, tripsina, uroquinase), hormnios de cadeia longa (luteinizante, corinico, folculo estimulante) e de clulas para testes toxolgicos, bioensaios ou fabricao de tecidos artificiais (LIMA et al., 2001). A Tabela 2 mostra o desenvolvimento de processos que utilizam clulas animais.

Tabela 2- Histrico de cultivo de clulas animais

Ano 1949 1954 1955 1962 1963 1964 1967 1969 Evento Crescimento de vrus em cultura de clulas. (Enders e col.) Vacina inativada Salk contra poliomielite (com clulas de rim de macaco) Vacina atenuada Sabin contra poliomielite (com clulas de rim de macaco) Estabelecimento de uma linhagem de clulas diplides humanas WI-38 (Hayflick) Vacina contra sarampo (com clulas de embrio de galinha) Vacina contra raiva (com clulas WI-38) Vacina contra caxumba (com clulas WI-38) Vacina contra rubola (com clulas WI-38)

1970- a)Vacinas humanas experimentais (varicela, citomegalovrus, e outros); 1974 b)Vrias vacinas veterinrias.

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1975 1979
1980

Produo de anticorpos monoclonais. (Kohler e Milstein) Primeira linhagem de clulas recombinantes

Ampliao da escala de produo para 8000L (vacina contra a febre aftosa e interferon)

1981
1982 1986

Primeiro kit de diagnstico com anticorpo monoclonal

Primeiro produto farmacutico resultado da tecnologia do DNA recombinante (insulina) a)Licena para a produo de -Interferon linfoblastide; b)Testes clnicos com vrios produtos resultantes da tecnologia do DNA recombinante; c)Vacinas contra poliomielite e raiva produzidas com clulas VERO. Licena para produo de OKT3 anticorpo envolvido na imunologia de transplantes

1987

1988 1989

Licena para a produo de tPA recombinante (ativador de plasminognio) Testes clnicos de eritropoetina

1990- Testes clnicos de diversos produtos oriundos da tecnologia de recombinao do 1995 DNA (antgeno da hepatite B, fatores sangneos VIII e IX, anticorpos monoclonais, anticorpos envolvidos na imunologia de transplantes, diversas citocinas, e outros).

Fonte: LIMA et al., 2001

Os processos de manipulao, esterilizao, quantificao, controle de qualidade, ampliao de escala e formao do produto so semelhantes aos de bactrias, fungos e leveduras. No entanto, alguns cuidados especiais devem ser tomados, pois clulas animais apresentam um crescimento mais lento, so mais frgeis (no suportando grandes taxas de agitao), apresentam necessidades nutricionais mais complexas, e, em muitos casos, necessitam de um suporte de adeso para o crescimento. Devido a essas peculiaridades, muitas vezes o cultivo de clulas animais pode ser muito mais caro (LIMA et al., 2001). Originalmente, as clulas animais no conseguem crescer livres no meio de cultivo assim como os microrganismos. Por isso so feitos cultivos primrios, nos quais clulas vindas diretamente de tecidos animais so cultivadas em meio e dissociadas cuidadosamente em clulas individualizadas. Isso realizado atravs da fragmentao do tecido em pedaos suficientemente pequenos. Quando o

crescimento in vitro acontece e as clulas formam uma monocamada aderida ao suporte, ocorre o descolamento das mesmas com o auxlio de enzimas e as clulas so diludas em meio de cultivo fresco para originar novas culturas (LIMA et al., 2001). Os meios de cultivo utilizados para o cultivo de clulas animais eram originalmente oriundos em fluidos biolgicos. Devido falta de uniformidade,

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comeou-se a formulao de meios semi-sintticos. Cada tipo de linhagem celular requer um tipo diferente de meio, mas a maioria deles apresenta caracterstica como: Glucose e glutamina como fontes de carbono para o catabolismo. Sais que garantem a isotonicidade do meio, evitando a desregulao osmtica. Sistemas de tampo bicarbonato/CO 2, succinato de sdio/cido succnico, e de tampes orgnicos do tipo HERPES (cido 4-(2 hidroxietil)-1-piperazina-N-2 etanossulfnico) e do tipo TRIS (2-amino2-hidroximetil-1,3 propanodiol). Suplementao com soro sangneo (complexo de protenas para a nutrio, adeso e crescimento celular, para a proteo biolgica antioxidantes e antitoxinas e para proteo mecnica durante a agitao e aerao). Como os soros utilizados so geralmente de origem bovina ou eqina, ele tambm pode ser fonte de contaminao por parasitas, bactrias, fungos ou vrus. Para evitar isso, tenta-se substitu-lo por outras composies, o que pode encarecer o processo. Antibiticos como penicilina (100UI/mL), estreptomicina (50 g/mL) e anfotericina B (25 g/mL). gua desmineralizada, destilada e isenta de pirognio. (LIMA et al., 2001)

A maioria das clulas animais se desenvolve bem entre 35 e 37C, podendo tolerar temperaturas mais baixas, mas morrem em temperaturas mais altas. O pH timo se encontra entre 7,2 e 7,4, sendo que algumas linhagem podem suportar extremos como 6,8 e 7,8 (LIMA et al., 2001). J as cultivo de clulas vegetais tem como objetivo a produo de metablitos secundrios em processos em biorreatores ou a produo de mudas padronizadas atravs das tcnicas de micropropagao. Atravs da manipulao gentica tambm pode-se fazer um melhoramento de plantas, protoplastos (clulas sem parede) podem ser fusionadas de forma a produzir novos hbridos, e clulas transgnicas podem ser desenvolvidas a plantas inteiras (WALKER & GINGOLD, 1997). A figura 17 mostra algumas das utilidades do cultivo de clulas vegetais.

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Com plantas, podem ser realizados cultivos com plantas inteiras, parte delas, tecidos, ou clulas nicas. O cultivo feito em meios estreis, contendo sais, vitaminas, fontes de carbono e reguladores de crescimento vegetal. Quando h o cultivo de tecidos organizados, permitindo posteriormente a obteno de plantas inteiras, possvel obter um cultivo sem alterao do material gentico. J um cultivo de clulas desorganizadas ou que passaram por um processo de manipulao, possvel regenerar uma planta inteira modificada atravs da biotecnologia (WALKER & GINGOLD, 1997).

Figura 17- Utilidades do cultivo vegetal

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

Atravs do cultivo in vitro de plantas possvel obter condies ambientais especficas, as quais so livres de enfermidades e pragas, e o cultivo pode ser realizado continuamente. A produo pode ocorrer em fermentadores, onde o crescimento celular ocorre at a fase estacionria, e depois ocorre extrao do produto; ou ainda em biorreatores de leito fixo, onde as clulas so imobilizadas na forma de agregados celulares em matrizes inertes como gis, espumas ou fibras ocas, e o produto coletado de forma contnua ou semicontnua (WALKER & GINGOLD, 1997).

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Clulas vegetais, tecidos e cultura de rgos podem ser cultivadas tanto em meio slido quanto em meio lquido, sendo que a cultura em meio lquido facilita o aumento de escala de laboratrio para a indstria. Recentemente, biorreatores de cultivo vegetal em escala piloto no Japo tinham capacidade de 20 000L (VOGEL & TODARO, 1997). Os metablitos secundrios que podem ser produzidos por plantas podem ser divididos em frmacos, essncias, perfumes, pigmentos e agentes qumicos de utilidade na agricultura. No entanto, a maioria desses compostos produzida em baixas concentraes, devido, entre outros fatores, a instabilidade de expresso gnica durante o cultivo (WALKER & GINGOLD, 1997). 6- APLICAES DA FERMENTAO

Os produtos biotecnolgicos esto presentes em vrios setores da economia, como na rea qumica, farmacutica, energtica, alimentcia e agricultural. Os tipos de servios que uma indstria de bioprocessos pode oferecer podem ser classificados em: Produo de biomassa: onde o objetivo a produo em grande quantidade de biomassa de bactrias, leveduras ou fungos. A biomassa de levedura pode ser utilizada no processo de panificao; j a biomassa da microalga Spirulina pode ser utilizada no enriquecimento de alimentos. Produo de metablitos celulares: visa produo em larga escala de produtos de metabolismo celular. Eles podem ser intra ou extracelulares. Produo de protenas recombinantes: atravs da engenharia gentica possvel manipular genes e introduzi-los em microrganismos de forma a chegar a produtos que antes eram produzidos em outras clulas ou ainda melhorar a especificidade de uma enzima. Produo de enzimas: so os produtos celulares mais usados na indstria. Elas podem ser extradas de animais ou plantas, mas a produo por microrganismos pode fornecer uma maior rendimento. Biotransformao de compostos: h a transformao de substncias do meio em outras. Esse recurso bastante til principalmente na rea ambiental,

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onde possvel fazer com que microrganismos retirem substncias txicas do meio e convertam a produtos de toxicidade menor.

6.1- PRODUO DE ALIMENTOS

Os microrganismos so amplamente utilizados na produo de alimentos, tanto para consumo humano como animal. Aqui sero discutidos alguns exemplos de produtos de fermentao na indstria alimentcia. Antigamente, a produo de pes era feita guardando-se um pouco das sobras da ltima formada para servir como inculo para a prxima. Atualmente, encontra-se levedura (fermento) comercialmente, sendo selecionadas as cepas mais produtivas para tal atividade. A produo de biomassa de levedura para a panificao feita em meio lquido contendo melao ou licor de milho, com pH 4-5 e aerao. Ao final do cultivo as clulas so recuperadas por centrifugao e filtrao. adicionado um pouco de leo vegetal para agir como plastificante, e a biomassa moldada na forma de blocos e embalada para comercializao (NAJAFPOUR, 2007). Na produo de queijos necessria a formao do coalho, que causada pela ao da renina sobre a casena do leite. O tipo de bactria ltica inoculada tambm pode fornecer um sabor e odor caracterstico. Queijos como o Cheddar e o suo so maturados atravs do crescimento anaerbico de bactrias lticas em seu interior. J queijos como o Limburger so maturados por bactrias e outros microrganismos contaminantes que crescem na superfcie. Queijos como o blue e o Roquefort so maturados pelos fungos Penicillium inoculados no queijo. Derivados do leite como a manteiga, o iogurte, o kefir e o kumiss tambm so produzidos atravs da fermentao (TORTORA et al., 2006). Pode ocorrer tambm de o prprio microrganismo ser o alimento. No entanto um pr-requisito bsico para utilizao de biomassa de microrganismos como alimento e medicamento a aprovao de sua segurana toxicolgica. Alguns microrganismos podem produzir toxinas que podem fazer mal ao organismo de quem a ingerir (SILVA et al., 2007). Cogumelos so um dos tipos de organismos utilizados na alimentao. Seu uso bastante difundido em vrios pases, principalmente asiticos, onde eles so consumidos na forma de ch, extratos ou em conjunto com outras ervas. Seu uso se

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d principalmente devido a propriedades antibacterianas, antifngicas, antivirais, imunomoduladoras, antialergnicas, antiinflamatrias, antiaterognico e antitumoral, hipolipidemica e hipoglicemica. (LIMA et al., 2007) Existem aproximadamente duas mil espcies de cogumelos que podem ser consumidas por humanos, mas somente 25 delas so as normalmente usadas na alimentao. Daqueles que apresentam atividade biolgica comprovada ento o Ganoderma lucidum (Reishi), Lentinus edodes (Shiitake), Agaricus brasiliensis (Cogumelo do Sol), Inonotus obliquus (Chagas), G. frondosa (Maitake). Compostos que apresentam atividade biolgica esto presentes na biomassa desses fungos ou ento so excretados. Esses compostos incluem argenina, esterides, lipdeos, lectina e polissacardeos, sendo esse ltimo importante na ao antitumoral e imunomoduladora. (LIMA et al., 2007) Outra biomassa de poder nutritivo e teraputico das cianobactrias como a Spirulina sp. podem produzir importantes compostos bioativos como metablitos secundrios que podem ser constituintes de complementos alimentares ou ainda a biomassa ser utilizada como um novo alimento. Compostos por elas produzidos podem apresentar ao anticancergena, antioxidante, antibacteriana, antiviral e antifngica (SILVA et al., 2007). As tabelas 3 e 4 mostram alguns dos principais alimentos e bebidas que utilizam a fermentao. Tabela 3- Alimentos fermentados
Alimentos e Produtos Laticnios Queijos (maturados) Coalho de leite Streptococcus spp., Leuconostoc spp. Kefir Leite Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Candida spp. Kumis Leite de gua L. bulgaricus, L. leichmannii, Candida spp. Iogurte Produtos de Carne e Peixe Presuntos curados Salsichas Molho de peixe Presunto de porco Porco, carne de gado Pequenos peixes Aspergillus, Penicillium spp. Pedicoccus cerevisiae Bacillus spp haloflicos Leite, slidos do leite S. thermophilus, L. bulgaricus Ingredientes Crus Microrganismos Fermentadores

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Produtos de Plantas Cacau (chocolate) Gro de caf Fruto do cacau Fruto do caf Candida krusei, Geotrichum spp. Erwinia dissolvens, Saccharomyces spp. Kimchi Repolho e outros vegetais Miss Gros de soja Aspergillus oryzae, Zygosaccharomyces rouxii Azeitonas Azeitonas verdes Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum Poi Repolho azedo Razes de taioba Repolho Bactrias lcticas Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum Molho de soja Gros de soja A. oryzae, A. soyae, Z. rouxii, Lactobacillus delbrueckii Pes Bolos, pes e outros Po azedo de Farinha de trigo So Farinha de trigo Saccharomyces cerevisiae S. exiguus, Lactobacillus sanfrancisco Bactrias lcticas

Francisco

Fonte: TORTORA et al., 2006 Tabela 4- Bebidas fermentadas

Bebida Cerveja e vinho Cerveja, cerveja lager Saccharomyces cerevisiae Cerveja, ale S. cerevisiae Converter acar em lcool e CO 2. A levedura cresce no fundo do recipiente. Converter acar em lcool e CO 2. A levedura cresce no topo do recipiente. Saqu Vinho, natural Vinho, espumante (champanhe) Bebidas destiladas Rum Conhaque Usque Levedura selvagem S. cerevisiae S. cerevisiae Converte acar em lcool. Converte acar em lcool. Converte acar em lcool. S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae Converter acar em lcool. Converter acar da uva em lcool. Na fermentao secundria produz CO 2. A levedura assenta rapidamente. Levedura Funo da levedura

Fonte: TORTORA et al., 2006

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6.2- PRODUO DE ANTIBITICOS

Antibiticos so produtos secundrios do metabolismo que, em contato com outros microrganismos, podem inibir o crescimento do mesmo. No ramo dos antibiticos, um dos principais a penicilina, onde h a produo de praticamente 33 milhes de toneladas mtricas anuais movimentando praticamente US$ 400 milhes. A venda mundial dos trs principais grupos de antibiticos (penicilina, cefalosporina, tetraciclina e eritromicina) gera US$ 4,2 bilhes por ano (NAJAFPOUR, 2007). No incio dos anos 40, Alexander Fleming notou a produo de penicilina pelo fungo Penicillium notatum, a qual inviabilizou a cultura de Staphylococcus aureus. Atualmente, a produo desse antibitico feita por uma outra espcie, Penicillium chrysogenum, pois assim h a formao de uma maior quantidade de produto (aproximadamente 1000 vezes mais). J antibiticos como a estreptomicina so produzidos por Actinomicetos. O cultivo submerso tambm favoreceu a produo de antibiticos em larga escala (NAJAFPOUR, 2007). Para a produo de penicilina, podem ser utilizados resduos industriais como melao. As etapas de produo consistem basicamente em: 1. Preparao do inculo. 2. Preparao e esterilizao do meio. 3. Inoculao do meio no fermentador. 4. Aerao forada com ar estril durante a incubao. 5. Aps a fermentao h a remoo do miclio formado. 6. Extrao e purificao da penicilina.

A penicilina produzida a partir da L-cistena e L-valina. A produo se d de forma no ribossomal, por meio de um dipeptdeo composto de L--aminoadpico (L-AAA) e L-cistena ou um produto de degradao da cistationina. Aps, ela se conecta a L-valina atravs de uma epimerizao. O produto da ciclizao do tripeptdeo a isopenicilina N. A benzilpenicilina produzida no intercmbio de L- AAA com cido fenilactico ativado. (LIMA et al., 2001) Dos antibiticos de origem microbiana, somente 123 so produzidos por fermentao, o resto produzido de forma sinttica ou semi-sinttica. As bactrias

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produzem um nmero de 950 antibiticos, j os actinomicetos pruduzem 4600 antibiticos, e os fungos 1600 (LIMA et al., 2001).

6.3- PRODUO DE ENZIMAS

As enzimas so amplamente utilizadas na indstria. Como exemplo pode-se citar o uso de amilases para a produo de xaropes do amido de milho, na produo de papis e na produo de glicose de amidos. No entanto, pode-se utilizar o microrganismo inteiro para o processo ou somente a enzima. Percebendo isso, indstrias resolveram se especializar somente na produo de enzimas (TORTORA et al, 2006). Vrios fungos sintetizam e excretam grandes quantidades de enzimas no meio de cultivo. Culturas como a de Aspergillus, Penicillium, Mucor e Rhizopus so bastante utilizadas na indstria (NAJAFPOUR, 2007). A produo de enzimas em larga escala se d principalmente atravs da fermentao submersa, embora em pases orientais chega-se a utilizar fermentao semi-slida (LIMA et al., 2001). Elas podem ser separadas do meio de cultivo aps a fermentao atravs de solventes como etanol ou adio de sais inorgnicos como sulfato de amnio (NAJAFPOUR, 2007).

6.4- PRODUO DE ANTICORPOS

Anticorpos so protenas da famlia das imunoglobulinas, que so sintetizadas normalmente pelo corpo de animais de forma a responder a molculas estranhas. necessrio haver uma grande produo de anticorpos, pois sua demanda bastante elevada. E para isso, as plantas de produo tm aumentado em tamanho e quantidade nas ltimas dcadas. Tambm nessa poca houve o desenvolvimento de anticorpos recombinantes que so produzidos in vitro em grande quantidade como se fossem produzidos por clulas in vivo. Isso foi obtido atravs da procura de clulas com alto coeficiente de produtividade (SCHEPER & HU, 2006). O cultivo em batelada raramente utilizado nesse caso, exceto em escala laboratorial. mais freqente o uso de batelada alimentada ou cultivo contnuo com reteno de clulas (SCHEPER & HU, 2006).

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A produo de anticorpos monoclonais tem sido bastante estudada, principalmente a potencialidade de seu uso como uma droga teraputica devido a sua especificidade de ligao. Dentro da farmacoterapia, anticorpos monoclonais tem sido utilizados no tratamento de doenas infecciosas (Synagis TM), cncer (HerceptinTM) e doenas autoimunes (RemicadeTM). No entanto, esses tratamentos ainda continuam sendo muito caros devido ao processo de produo. Eles eram prduzidos antigamente em camundongos, mas atualmente possvel produzir alguns tipos em Escherichia coli atravs de tcnicas de DNA recombinante (SCHEPER & HU, 2006).

6.5- PRODUO DE INOCULANTES

A biotecnologia no utilizada na agricultura somente atravs de organismos vegetais geneticamente modificados. tambm bastante importante a tcnica de produo de inoculantes agrcolas. Ela consiste na utilizao de microrganismos para melhorar o solo em que ocorrer o cultivo, propiciando a fertilizao natural do solo, reduzindo os danos causados por doenas, estimulando o crescimento vegetal e reduzindo a carga de inseticidas que podem eventualmente permanecer no solo. bastante utilizado nessa rea o fato de que algumas bactrias e fungos podem fazer simbiose com vegetais. Bactrias como Bradyrhizobium e Rhizobium so importantes na simbiose com leguminosas como soja e feijo, auxiliando na fixao do nitrognio atmosfrico. Fungos so utilizados na micorrizao das razes de Pinus sp. e Eucaliptus sp., auxiliando na fixao e crescimento de mudas no ambiente (LIMA et al., 2001). Para a fixao de nitrognio, so utilizadas culturas isoladas de bactrias (usualmente Rhizobium) que consigam formar ndulos de fixao nas razes de leguminosas. As caractersticas do solo onde ocorrer o plantio tambm importante para selecionar uma cepa que seja adequada para aquelas condies de temperatura e pH. Pode ocorrer tambm uma competio entre bactrias do inculo e bactrias naturais do solo, inviabilizando o seu desenvolvimento. Outra caracterstica importante da linhagem a ser usada que as clulas microbianas devem suportar as condies de produo industrial, se multiplicando de forma significativa nos tanques cultivo.

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Sobre os inoculantes a base de fungos, so utilizados microrganismos de ao mutualstica, formando associaes com razes de vegetais superiores. Dependendo do tipo de colnias formadas nas razes, os fungos podem ser classificados ectomicorrizas. A seleo de microrganismos pode ocorrer de espcies naturais, a fim de se encontrar o organismo que propicia uma melhor associao. A produo em grande quantidade na indstria ocorre atravs de cultivos em estado slido ou submerso. O primeiro tipo apresenta problemas quanto ao controle de pH, temperatura e disponibilidade de oxignio e substrato. Essas condies j podem ser melhor ajustadas durante o cultivo submerso (LIMA et al., 2001). como endomicorrizas (quando h penetrao na raiz) ou

6.6- TRATAMENTO AMBIENTAL

Um processo industrial geralmente apresenta a produo de alguns produtos indesejveis, e esses resduos devem ser descartados de uma forma apropriada para no danificar o ambiente. Um modelo de industria ideal seria aquele em que no haveria nenhum resduo e ocorreria uma integrao de todos os processos (o resduo de um processo poderia servir de substrato pra outro). ZANETE, 2007, utilizou esse princpio para modelar uma biorrefinaria integrada, onde, por exemplo, um resduo como bagao de cana poderia ser utilizado tanto na produo de energia quanto no cultivo de microorganismos para a produo de etanol. Com a constante preocupao da populao com relao preservao do meio ambiente, deve-se prestar muita ateno aos resduos industriais a providenciar tratamento adequado para cada tipo. Para compostos biodegradveis pode-se fazer uso da biodegradao, onde microrganismos fazem a decomposio de compostos, desde que eles tenham a maquinaria enzimtica necessria (LIMA et al., 2001). Outra utilizao o fenmeno de absoro de metais txicos do ambiente por microrganismos (por exemplo, algas), pois podem suportar quantidades um pouco mais elevadas. A utilizao de biofiltros no tratamento de gases txicos tambm tem sido bastante estudada (MOOYOUNG & CHISTI, 1994). A diferena do tratamento biolgico de efluentes lquidos, slidos e gasosos com relao aos outros processos discutidos anteriormente que a escala de

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operao geralmente muito maior e os microrganismos so utilizados em culturas mistas, muitas vezes sem esterilizao (MOO-YOUNG & CHISTI, 1994).

6.7- PRODUTOS RECOMBINANTES

Atravs da tecnologia do DNA recombinante foi possvel aumentar a quantidade de produtos resultantes da fermentao realizada por microrganismos. Por essa tcnica consegue-se induzir em um microrganismo a produo de uma protena heterloga que originalmente pertencia a outro organismo. Alguns exemplos bem sucedidos so a produo de insulina humana, de hormnio do crescimento e de interferon pela bactria Escherichia coli (WALKER & GINGOLD, 1997). Um exemplo de processo recombinante est na figura 18, onde os genes de origem externa, como, por exemplo, tecido animal, so inseridos em microrganismos atravs de tcnicas de biologia molecular.

Figura 18- Produo de plasmdio recombinante

Fonte: Adaptado de DORAN, 1995

Os organismos mais utilizados nesse processo so Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, clulas cultivveis de eucariotas superiores, como de inseto e de mamferos. As bactrias da espcie E. coli so amplamente utilizadas devido facilidade de crescimento e produo. Existem alguns fatores importantes durante uma fermentao que utiliza um gene recombinante, como: Modificaes ps-traducionais. Modo de secreo do produto. Minimizao da degradao do produto.

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Proteo da expresso do gene estrangeiro. Controle do incio de sua sntese durante a fermentao. (WALKER & GINGOLD, 1997)

Para conseguir a expresso de genes eucariticos em bactrias, deve-se levar em conta que esses genes possuem seqncias de exons e introns. Portanto deve-se modificar a seqncia de modo a ter somente os cdons que devem ser codificados em aminocidos. Protenas originrias de organismos eucariticos podem no ter sua produo exata em microrganismos tambm devido presena de algumas modificaes ps-traducionais, como glicosilao, o que no feito por muitas bactrias. Outros fatores a serem observados so a freqncia de cdons utilizados pelo organismo (codon usage bias), pois, como o cdigo gentico degenerado (apresentando mais de um cdon codificando o mesmo aminocido), cada organismo utiliza um cdon preferencialmente em relao a outro. Para que o gene de interesse seja inserido na bactria de interesse, necessria a utilizao de vetores genticos. Existe um vetor mais recomendado dependendo do objetivo desejado. Plasmdios so pequenos segmentos de DNA circulares que apresentam replicao autnoma, dentro dos quais podem ser inseridas seqncias gnicas pequenas (at 10kb). Bacterifagos j aceitam

seqncias maiores (de 20 a 40 kb). Existem tambm os cosmdios, fosmdios e cromossomos de levedura artificiais (YAC). A insero de material gentico exgeno por meio de vetores de clonagem muito importante na metagenmica, que a anlise genmica de comunidades microbianas independentes de cultivo. Muitos microrganismos no conseguem se desenvolver bem em meios de cultivo artificiais, mas ao mesmo tempo podem conter seqncias gnicas importantes para o desenvolvimento de alguns processos. Para se fazer uso delas pode-se fazer uma extrao do DNA ambiental, ou seja, coleta-se uma poro do meio ambiente e extrai-se o DNA de todos os microrganismos ali presentes. Em seguida contri-se uma biblioteca genmica de todos os segmentos de DNA obtidos, fazendo uma fragmentao das seqncias, inserindo os pedaos em E. coli atravs de plasmdios eselecinando aquelas bactrias que sofreram transformao. Atravs de um screening seletivo das bactrias recombinantes, possvel achar bactrias que realizam processos metablicos de interesse que so

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realizados de forma mais eficiente ou que antes s podiam ser realizados no meio natural. A figura 19 mostra de forma esquematizada esse processo:

Figura 19- Montagem de uma biblioteca genmica atravs de DNA do ambiente

Fonte: Figura montada pelo autor.

A utilizao de microrganismos bem controlada, e existem regras como a GILSP (Good Industrial Large-Scale Practice) que estipula que o organismo que ir receber a seqncia gnica exgena dever ser no patognico, no deve conter elementos patognicos como vrus, fagos e plasmdios, deve ter uma longa histria de uso seguro na indstria ou ter limitaes ambientais de crescimento (ou seja, ele necessita de uma condio ambiental controlada industrialmente para crescer, caso contrrio ele morrer). No caso de ser um organismo patognico ele deve ser manuseado com muita cautela e deve ser conhecido um tratamento eficiente para a doena caso haja algum escape (VOGEL & TODARO, 1997). O local de manipulao desses microrganismos tambm deve ser observado de acordo com as caractersticas por ele apresentadas. Equipamentos, tcnicas de operao e local adequado para manipulao de determinados microrganismos esto presentes em Guideline for Industrial Application of Recombinant DNA Technology, que foi publicado pelo ministrio de troca internacional e indstria do Japo (VOGEL & TODARO, 1997).

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7- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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8- ANEXO

BIOCHEMICAL ENGINNERING IN BIOTECHNOLOGY (Technical Report)

M. MOO-YOUNG and Y. CHISTI