Abordagem molecular no desenvolvimento de frmacos anti-tumorais

ANDRESSA BERNARDI1 MARIA CAROLINE JACQUES-SILVA2 GUIDO LENZ 3 1. Graduanda do Curso de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), bolsista de Iniciao Cientfica. 2. Farmacutica-bioqumica e doutoranda em Cincias Biolgicas Bioqumica/ UFRGS. 3. Professor Adjunto do Departamento de Biofsica. Departamento de Bioqumica, Rua Ramiro Barcelos, 2600, Anexo, Laboratrio 37, ICBS, UFRGS. 90035-003, Porto Alegre, RS. e-mail: andressabernardi@yahoo.com.br

INTRODUO
As principais caractersticas das clulas neoplsicas que as distinguem das clulas normais so a proliferao descontrolada, indiferenciao e perda da funo, poder de invaso e de gerar metstases. Uma das principais dificuldades no uso da quimioterapia no cncer que o tumor geralmente se encontra bem avanado por ocasio do diagnstico (Rang et al, 2001). Os agentes antineoplsicos atualmente utilizados, em particular os que so citotxicos, afetam, em sua maioria, apenas uma das caractersticas das clulas cancerosas, o processo de diviso celular, sendo, portanto, apenas antiproliferativos. Esses frmacos no exercem nenhum efeito inibitrio especfico sobre o poder invasivo, a perda da diferenciao ou o poder metasttico. Alm disso, como seu efeito principal exercido sobre a diviso celular, eles iro afetar todos os tecidos normais que se dividem rapidamente, produzindo ento, em maior ou menor grau, os conhecidos efeitos colaterais de uma quimioterapia. Ressalta-se ainda que os prprios agentes antineoplsicos podem tambm, em certas circunstncias, serem carcinognicos. Considerando a necessidade de novas abordagens para o tratamento do cncer, estudos bioqumicos dos mecanismos de transduo de sinal celular possibilitaram um melhor entendimento da biologia da clula neoplsica. Dessa forma, novos mecanismos de ao esto sendo explorados no desenvolvimento de novos medicamentos no combate ao cncer. O presente trabalho prope-se a apresentar uma reviso da abordagem molecular no desenvolvimento desses novos frmacos.

ladoras positivas e negativas (Karp & Broder, 1995). As foras positivas envolvem fatores de crescimento, que estimulam a clula a entrar no ciclo, alm de uma srie de ciclinas e de quinases ciclinadependentes (cdks). As ciclinas se ligam s cdks, ativando-as, e essas promovem ativao de substratos que desencadearo a liberao de fatores de transcrio e conseqente ativao de genes e sntese protica. A ao das ciclinas/cdks modulada pelas foras reguladoras negativas, que so protenas que se ligam s cdks e inibem sua ao. Essas protenas so induzidas por vrios genes, como, por exemplo, o gene p53 e o gene do retinoblastoma (Rb). Se houver algum tipo de leso no DNA, esses genes funcionam como inibidores, que interrompem o ciclo celular nos pontos de controle que ele possui, permitindo, ento, o reparo do DNA. Se o reparo falhar, inicia-se o processo de apoptose. Nas clulas cancerosas, pode ocorrer perda do controle do ciclo celular em conseqncia de: Anormalidade na funo dos fatores de crescimento e/ou Funo anormal da ciclina/cdk e/ou Sntese anormal de DNA em decorrncia da atividade de oncogenes e/ou Diminuio anormal das foras reguladoras negativas, devido ocorrncia de mutaes dos genes supressores tumorais.

PRINCIPAIS ALVOS MOLECULARES E MECANISMOS

DE AO DOS NOVOS MEDICAMENTOS

BIOLOGIA DAS CLULAS CANCEROSAS:

ASPECTOS GERAIS

O desenvolvimento do cncer um processo complexo em estgios mltiplos, envolvendo geralmente mais de uma alterao gentica e, tambm, muitos outros fatores que, ocorrendo ou no de forma simultnea, podem resultar numa neoplasia. Importantes processos celulares, como crescimento, diferenciao, motilidade e apoptose (morte celular programada) so regulados por sinais provenientes de outras clulas e da matriz extracelular ou por fatores de crescimento e citocinas (Dirks & Rutka, 1997). As clulas podem se dividir em resposta a fatores de crescimento que atuam sobre RTKs (receptores de superfcie tirosino-quinases), que, por sua vez, deflagram eventos intracelulares que resultam na produo dos transdutores do ciclo celular, que levam sntese de DNA e, conseqentemente, diviso celular. Um defeito em qualquer uma dessas etapas (por ativao de oncogenes ou inativao de genes supressores tumorais) pode resultar em proliferao descontrolada, j que a progresso, atravs do ciclo celular, depende do equilbrio entre vrias foras regu-

Diversas abordagens moleculares esto em fase de investigao. H atualmente 209 novas drogas sendo investigadas, inclusive em Fase de estudo III. A maioria delas, baseadas nos progressos realizados no conhecimento da biologia da clula cancerosa, se refere ao uso de alvos seletivos para atuao dos agentes antitumorais. Subdividem-se em oito grandes grupos, de acordo com o mecanismo de ao proposto. Na seqncia e na tabela I tm-se esses grupos com alguns de seus representantes. ==> Drogas que visam alterao da expresso gnica / Terapia Gnica:

A utilizao de oligonucleotdeos anti-sentido (ONs, antisense oligonucleotides) permite o bloqueio da expresso de um oncogene. Os ONs so pequenos segmentos sintticos de DNA de filamento nico, que so complementares a uma poro do mRNA e que podem ligar-se sua seqncia correspondente no mRNA. A conseqente poro de filamento duplo (um hbrido de mRNA e ON DNA ) impede a traduo do mRNA e, assim, bloqueia a expresso do oncogene particular. ONs, que tm por alvos o gene Bcl-2 (um tipo de gene antiapopttico ), tm sido objetos de estudos clnicos.

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A tecnologia mais recente e promissora, em termos de supresso gnica, o RNAi (RNA interference). RNA dupla fita so processados por enzimas intracelulares, produzindo fragmentos de 21 a 23 pares de base, com 19 bases pareadas. Estes pequenos fragmentos de RNA levam a degradao do RNA mensageiro que possui a seqncia correspondente s 19 bases. Este mecanismo especfico ao nvel de apenas um nucleotdeo. Desta forma, possvel bloquear a expresso de um oncogene que sofreu mutao, sem, contudo, atingir a expresso do proto-oncogene, como foi mostrado para o oncogene Ras (Brummelkamp et al., 2003), abrindo a possibilidade para um tratamento totalmente ausente de efeitos colaterais. importante mencionar, no entanto, que este tipo de tratamento exigiria um conhecimento bastante especfico das alteraes genticas de cada paciente acometido de cncer, mas a simplificao dos mtodos de seqenciamento est abrindo esta possibilidade para um futuro no muito distante. H, tambm, estudos clnicos (Fase III) em cncer de cabea e pescoo, envolvendo a injeo, no tumor, de vetores adenovirais recombinantes contendo o gene p53 humano, bem como estudos clnicos de glioblastomas (tumores cerebrais de elevada malignidade) envolvendo vetores de herpes-vrus para que esses transportem um gene para ativar uma pr-droga. Abordagens promissoras da terapia gnica para o cncer restaurar mecanismos protetores como p53; inativar a expresso de oncogenes; fornecer um gene para clulas malignas, tornando-as sensveis s drogas; fornecer um gene s clulas hospedeiras sadias para proteg-las da quimioterapia; marcar clulas cancerosas com genes para torn-las imunognicas.
Tabela II: Terapia Gnica e Cncer / Fonte: Rang et al, 2001

intracelular, causando alterao no ciclo celular, inibio da apoptose e aumento da proliferao celular. Uma vez identificada a principal mutao responsvel pela enfermidade, as pesquisas levaram ao desenvolvimento da droga mesilato de imatinib (STI 571), que atua diretamente na protena mutada BCR-ABL e previne a fosforilao de substratos envolvidos na regulao do ciclo celular. O imatinib agora considerado padro ouro para o tratamento de paciente com LMC que no possuem um doador compatvel de medula ou que no so candidatos a transplante (Peggs e Mackinnon, 2003). A este grupo pertencem, tambm, os inibidores de Ras (protena de ligao de guanina-nucleotdios com atividade de GTPase) e vias por ela ativada. Esses inibidores bloqueiam a capacidade que tem os genes ras mutantes de se tornarem clulas malignas. Nas clulas normais, a protena Ras, uma vez sintetizada, migra para a membrana celular, qual se fixa por uma espcie de gancho molecular (um grupo farnesil). Este grupo adicionado protena pela enzima farnesiltrasferase. Recentemente, foram produzidos compostos que inibem esta enzima, como o RI 15777. Foi demonstrado, por testes in vitro e in vivo ( Fase Clnica III), que esse composto reverte a transformao maligna em clulas cancerosas que contm o oncogene ras, restaurando os padres normais de crescimento, sem interferir na diviso celular das clulas normais ( Nygren et al, 2003 ). ==> Inibidores da invaso do tumor e metstases:

==>

Inibidores da Transduo de Sinal:

Recentemente, muita ateno tem sido direcionada possibilidade de se impedir que a clula tumoral seja capaz de induzir degradao da matriz extracelular e invadir o estroma, ocasionando metstases. O uso de mecanismos de inibio de disseminao dessas clulas tem sido bem-sucedido. As enzimas chamadas metaloproteinases, que so uma famlia de endopeptidases, esto envolvidas, tanto na invaso, quanto nas metstases dos cnceres, por terem a capacidade de degradar os componentes da matriz extracelular. Agentes que inibem essas enzimas, como, por exemplo, o marimastat, j se encontram em estudos clnicos de Fase III. ==> Inibidores de Angiognese:

Incluem-se, nesta categoria, os inibidores da ligao dos fatores de crescimento ao receptor. Quando fatores de crescimento, como por exemplo EGF (fator de crescimento epidermal), se ligam s protenas de membrana chamadas de Her-2, essas se dimerizam e enviam ao ncleo sinais pr-mitticos. Esse mecanismo ocorre em clulas normais, mas uma diferena das clulas normais para as clulas malignas que, na superfcie das clulas tumorais, a protena est presente em quantidades to grandes, que as molculas, mesmo sem fatores de crescimento, se unem em dmeros, de modo que a mitose ocorre constantemente. O ZD 1839 uma nova molcula em estudo que tem por mecanismo de ao impedir que as clulas formem dmeros. Dessa forma, as clulas tumorais se dividem menos (Tzahar et al, 1998). Est sendo empregada, em casos de cncer de mama metasttico (Fase Clnica III). Baseado nesse mesmo raciocnio, h outros inibidores de RTKs, sendo testados com a finalidade de interferir nos mecanismos de transduo de sinal envolvidos na proliferao celular (Nygren et al, 2003). A leucemia mielide crnica (LMC) uma doena em que a principal caracterstica das clulas possuir uma translocao recproca t(9;22) que gera um novo gene, fruto da fuso de dois genes: BCR-ABL no cromossomo derivado 22q- (cromossomo Philadelphia) e ABL-BCR no cromossomo 9q+. O produto do gene abl uma protena tirosina-quinase, que capaz de se autoativar, quando dimerizada. A protena fusionada BCR-ABL leva a auto-ativao da ABL, que desregula as vias normais de transduo de sinal

A angiognese (crescimento de vasos sanguneos para a irrigao do tumor) necessria para nutrio e conseqente progresso do tumor. H vrios reguladores endgenos (positivos e negativos) que controlam a angiognese, como a angiogenina e o fator de crescimento endotelial vascular. Os inibidores da angiognese atuam nesses reguladores endgenos, a fim de impedir a irrigao do tumor, mas os mecanismos exatos so ainda controversos. Inclui-se, nesta categoria, a talidomida, medicamento usado, no passado, para enjos, durante a gravidez (uso abolido devido a teratognese causada), mas que, por mostrar atividade antiangiognica, tem sido usada em estudos clnicos, nos Estados Unidos e Europa, no tratamento de diferentes tipos de tumores, em combinao com outros agentes (Raje & Anderson, 2002). ==> Agentes Diferenciadores:

Sabe-se que um dos processos que resultam na malignidade das clulas a perda do processo de diferenciao. Estudos com o objetivo de induzir a diferenciao e tornar as clulas normais utilizam anlogos da vitamina D3 e agonistas do receptor do cido retinico, mas as vias pelas quais esses compostos induzem a diferenciao ainda no esto bem descritas. ==> Inibidores Imunognicos: Anticorpos monoclonais (Mabs) so molculas versteis

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com potencial teraputico e aplicaes em vrias enfermidades humanas, incluindo o cncer (Carter et al, 2001). Esto sendo utilizados Mabs para fatores de crescimento, citocinas e outras molculas ou receptores que controlam o crescimento e outras funes da clula tumoral e, tambm, Mabs anti-idiotpicos como vacinas para gerar uma resposta imune. Ressalta-se que algumas vacinas geraram resultados negativos, mas que sua eficincia tem sido observada, principalmente quando administrada como adjuvante, observado em cncer colo-retal em estudo de Fase Clnica III (Nygren et al, 2003). ==> Reversores de resistncia induzida por drogas:

A conjugao de drogas citotxicas a anticorpos (imunoconjugados) uma alternativa muito promissora na terapia do cncer. Outra alternativa o acoplamento de um anticorpo a uma enzima capaz de converter uma droga no-txica em um metablito de elevada toxicidade. Os anticorpos so direcionados a antgenos especficos do tumor, de modo que a droga conduzida e concentra-se, no tumor, no afetando os tecidos normais das proximidades.

CONSIDERAES FINAIS
Embora a terapia atual para o cncer dependa principalmente do uso de cirurgia, irradiao e quimioterapia, a evoluo na compreenso da biologia da transformao maligna e das diferenas no controle da proliferao da clula normal e cancerosa proporcionaram a descoberta de novos alvos possveis para o tratamento do cncer. improvvel que novas terapias venham a substituir totalmente as drogas existentes, uma vez que estas drogas tornaram-se mais eficazes e suas toxicidades, mais tratveis e previsveis, nos ltimos anos. No entanto, uma combinao de drogas existentes, novas abordagens e a obteno de um perfil molecular/ gentico de cada tumor faria com que todo o paciente tivesse um tratamento individualizado e especfico para o seu caso, aumentando a eficcia do tratamento e diminuindo a incidncia de efeitos colaterais.

Desde o surgimento do emprego da quimioterapia para o cncer (1940), foram identificados muitos de caminhos pelos quais as clulas cancerosas escapam do agente qumico. No momento em que as clulas desenvolvem resistncia a uma droga, elas podem tambm desenvolver resistncia cruzada a outras drogas, quimica e mecanicisticamente no relacionadas, em um fenmeno conhecido como resistncia multi-droga (MDR). Muitas formas de MDR resultam da expresso de bombas de fluxo ATP-dependente com ao sobre diferentes substratos (Nygren et al , 2003). Muitos estudos mostram o envolvimento da PgP, uma P-glicoprotena, nessa resistncia. A estratgia a utilizao de drogas que inibem essa protena transportadora, como verapamil e ciclosporina A . ==> Novas drogas citotxicas e indutores de apoptose:

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Muitas drogas citotxicas exercem seu efeito por induo de apoptose, porm muitas clulas adquirem resistncia a essas drogas por modificaes em elementos chaves da sinalizao apopttica. Tabela I: Tabela Geral com alguns representantes de cada grupo dos novos frmacos anti-tumorais.

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