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Gentica de Microrganismos

Mutaes
Definio:

Alteraes na seqncia de pares de bases de DNA que so hereditrias.

Classes de mutaes Microleses

Locus Selvagem Mutaes

A T G C C G T A T G C G T A A T C G C A T T A C G Transies Transverses

Codon Locus Selvagem

1 2 3 4 5 6 A T G C C G T T A G G G T C A T C A... Met Pro Leu Gly Ser Ser ...

Frameshift

Deleo de G A T G C C T T A G G G T C A T C A... Met Pro Stop

Classes de mutaes
Macroleses
LocusSelvagem Delees ATGCCATACCGC TACGGTATGGCG Duplicaes ATGCCATACCGC TACGGTATGGCG Inseres ATGCCATACCGC TACGGTATGGCG Inverses ATGCCATACCGC TACGGTATGGCG Translocaes ATGCCATACCGC TACGGTATGGCG ATACCGC ATAGGCG ATGCCCCATAGC TACGGGGTATCG ATGCCGACCATATACCGC TACGGCTGGTATATGGCG ATGCCATACCATACCGC TACGGTATGGTATGGCG ATGCCGC TACGGCG Mutao

MutaesPolares

x x

Teoria Neutra de Evoluo Molecular (Motoo Kimura):


Mutaes Malficas >>> Mutaes Neutras > Mutaes Benficas

A Evoluo molecular ocorre essencialmente atravs de mutaes neutras (deriva gentica)

A Teoria Neutra da Evoluo a base do cronmetro evolutivo

Smbolos usados para descrever gentipos e mutaes em bactrias Nome do gene (em itlico). Ex: lacZ = Deleo. Ex: phoA; (phoA-proC) :: = Insero. Ex: phoA::Tn10 ts = mutante sensvel a temperatura. Ex: phoA(ts)
Cepa auxotrfica: mutante que tem uma ou mais deficincias nutricionais Cepa prototrfica: cepa selvagem da qual o mutante auxotrfico derivou-se

Mutaes espontneas ou induzidas?

Max Delbruck (1906-1981) Salvador Luria (1912-1991)

Teste de Flutuao

Mdia = m/n
m = mutantes por cultura n = no. de culturas

Varincia = (m-mdia)2

( n-1)

Clculo da frequncia de mutaes: f=m N

m = nmero de mutantes N = nmero total de clulas na populao

Clculo da taxa de mutaes:

a=h N

h =no. de mutaes/ cultura= -ln (no. de culturas sem mutao) (no. total de culturas) N = nmero de divises celulares

Pergunta: Um cientista conduziu um teste de flutuao para determinar se mutaes no gene rpoS so espontneas ou induzidas. De 50 tubos contendo 107 bactrias cada, em 40 foram observados mutantes rpoS. A) Calcule a taxa de mutao em rpoS. B) O que pode concluir a respeito da induo de mutaes em rpoS? h = -ln (10/50) = 1.6 a = h/N = 1.6/ 107 = 1.6 x 10-7 mutaes/gerao

Taxa de mutaes espontneas:

0.0025 mutaes por genoma por gerao

Duplicao diria de E. coli em cada indivduo:

20 bilhes de bactrias/dia

Portanto, 50 milhes de mutaes/dia

Por que ocorrem mutaes?


I) Erros Espontneos

II) Agentes Mutagnicos A) Agentes Fsicos B) Agentes Qumicos

C) Agentes Biolgicos

Mecanismo de Ocorrncia de Mutaes Mutaes Espontneas: 1- Erro na incorporao de nucleotdeos da DNA Pol III 10-4 erros/par de bases/clula/gerao Com edio da prpria DNA polimerase III: 10-6-10-7 erros/par de bases/clula/gerao Com mecanismos de reparo de DNA: 10-9-10-10 erros/par de bases/clula/gerao

Mecanismo de Ocorrncia de Mutaes Induo de mutaes- Agentes Fsicos I- Radiao Ionizante: A) Radioatividade (raios alfa, beta e gama) Ex: Tinta de Rdio

B) Raios X

MecanismodeOcorrnciadeMutaes InduodemutaesAgentesFsicos II- Radiao no-ionizante

MecanismodeOcorrnciadeMutaes InduodemutaesAgentesQumicos Anlogosdebasesnitrogenadas

MecanismodeOcorrnciadeMutaes InduodemutaesAgentesQumicos Modificadoresdebases:Nitrosoguanidina

MecanismodeOcorrnciadeMutaes InduodemutaesAgentesBiolgicos vrus transposons

Reverso de mutaes

ATG CAT CTT CTA Met-His-Leu-Leu ATG CAT TTT CTA Met-His-Phe-Leu

Locus selvagem Mutao

Revertante verdadeiro ATG CAT CTT CTA Met-His-Leu-Leu

Pseudorevertante ATG CAT TTA CTA Met-His-Leu-Leu

Mutaessupressoras

TestedeAmes

Pergunta de Prova

O operon pst formado por 5 genes transcritos na seguinte ordem: pstS-pstC-pstA-pstBphoU. Os genes de pst codificam protenas responsveis pelo transporte de fosfato inorgnico, importantes para permitir o crescimento da bactria em meio limitante em fosfato. Foram isolados dois mutantes denominados 1 e 2. O mutante 1 no produz somente a protena PstC e o mutante 2 alm de no produzir PstC, tambm no capaz de sintetizar as protenas PstA, PstB e PhoU. Qual a provvel natureza de cada uma das mutaes 1 e 2? Explique.

Troca de Informao Gentica entre Bactrias ou Sexo


(1) Transformao (2) Transduo (3) Conjugao

Definio: Transferncia de Informao Gentica atravs de DNA livre

Descobriu em 1928 a transformao em bactrias iniciando a era da gentica molecular

Descobriu em 1944 que a transformao de Streptococcus pneumoniae no-virulento em uma cepa virulenta observada por Griffith foi causada pela transferncia de DNA

Alguns consideram esta a descoberta mais importante da biologia no sculo XX

Poucas bactrias possuem a capacidade de captar DNA livre do meio. Estas so conhecidas como bactrias naturalmente competentes.

Algumas espcies naturalmente competentes: * Streptococcus pneumoniae *Bacillus subtilis *Neisseria gonorrhoeae *Haemophilus spp.

Bactrias podem ser artificialmente induzidas a captar DNA livre atravs de vrias tcnicas: - CaCl2 - PEG-DMSO - Eletroporao
A eficincia de eletroporao 10-100 vezes maior que os demais mtodos e pode ser utilizada para transformar praticamente todos os tipos de microrganismos

Molculas de DNA geralmente (mas no sempre) circulares que contm genes que geralmente (mas no sempre) codificam protenas noessenciais para a sobrevivncia da bactria Os plasmdios possuem uma origem de replicao (replicon) prpria tal que uma nica clula pode comportar de 1 a 700 cpias do mesmo plasmdio

Transformao de Plasmdios
Se o plasmdio transformado possuir uma origem de replicao reconhecida pela DNA polimerase da clula ele ser replicado de forma independente. Caso contrrio, ele poder ser...

OU

Transformao de Plasmdios

Tipos de Plasmdios
Plasmdios R
So plasmdios encontrados em bactrias entricas que conferem resistncia a um amplo espectro de compostos antimicrobianos como antibiticos, metais pesados, formaldedo etc.
oriV- origem de replicao repA- funo de replicao mer- resistncia a mercrio
Plasmdio R100

sul- resistncia a sulfonamida str- resistncia a streptomicina cat- resistncia a cloranfenicol tet- resistncia a tetraciclina oriT- origem de transferncia

Tipos de Plasmdios
Plasmdios de Virulncia Plasmdios que carregam genes codificadores de fatores de virulncia como endotoxinas, enterotoxinas, adesinas, hemolisina, coagulase etc.

Plasmdios produtores de antibiticos e bacteriocinas

Plasmdios artificiais Plasmdios construdos atravs de tcnicas de engenharia gentica

Plasmdios Artificiais

Plasmdios Artificiais

Conjugao

Joshua Lederberg

Edward Tatum

Exemplodeplasmdioconjugativo

oriV- origem de replicao repA- funo de replicao mer- resistncia a mercrio sul- resistncia a sulfonamida str- resistncia a streptomicina cat- resistncia a cloranfenicol tet- resistncia a tetraciclina oriT- origem de transferncia

Conjugao

FATORFclassificao

FormaodeHfr

Transferncia deHfr

Formao de F'

Transferncia deF'

ResumoFatorF
Nome Estado do fator F No h FF+ F Propriedades Receptor de fator F

Fator F livre no citoplasma

Hfr

Transfere eficientemente o fator F para a clula receptora Fator F carrega segmentos de DNA Transfere o fator F e segmentos cromossmico. Ex.: F lac cromossmicos; pode haver (geralmente no) recombinao homloga com regies do cromossomo Fator F integrado no cromossomo Transfere regies cromossomicas com da bactria alta eficincia a partir de um ponto fixo (de acordo com a posio do Hfr)

Sexonoliquidificador... oucomoconstruirummapa cromossomal

OmapacromossomaldeE.coli

EXEMPLO:
Doador: StrS Pro+ (F' lac proA-B) X Receptor: StrR Pro- (F-)

Recombinante: StrR Pro+ (F' lac proA-B)

Seleo: placas com estreptomicina, sem prolina

Fago T2

CiclodeVidadeumFagoTemperado

Transduoatransfernciadematerialgentico deumabactriaoutraviainfecoviral
Descobertaem1952porJoshuaLederbergeNortonZinder

Transfernciade qualquersegmento docromossomode umabactria outraatravsde fagos

Alguns clculos
Fagos P1 infectaram e lisaram uma cultura de E. coli selvagem para o gene B (B+). Trs em cada 1000 fagos empacota acidentalmente 2% de alguma poro do cromossomo de E.coli, ou seja, 100 Kb.

1) Qual a probabilidade de um fago empacotar o gene B+? 3/1000 X 1/50 = 3/50000 2) Sabendo que somente 2% do DNA injetado sofre recombinao, qual a porcentagem real de fagos transdutores (em relao a quantidade inicial de fagos)? 3/50000 X 1/50 = 3/2.500.000

Transferncia de um determinado segmento de genes de uma bactria a outra atravs de fagos

Antibiticos naturais (??)

Isolamento de fago especifico para a bactria Enterocouccus faecalis e sua utilizao na eliminao de bactrias em tbulos dentrios

Clonagem de genes (gerao de bibliotecas genmicas ou de cDNA

Insero de mutaes e mapeamento

Mapeamento gentico
Fentipos das colnias TcR Arg- Rif R Arg- Rif S Arg+ Rif S Arg+ Rif R No. de colnias 16 40 44 0

56 Kb 16 Kb argE rpoB thiA::Tn10

Pergunta de Prova
Foi realizado um experimento de transduo com o fago P1 para determinar a ordem dos genes phoA (que codifica a enzima fosfatase alcalina), lacZ ( que codifica a enzima -galactosidade) e proC (que codifica enzima envolvida na biossntese de prolina). A cepa doadora era phoA+ lacZ- proC+ e a receptora phoA- lacZ+ proC-. A seleo foi feita para transductantes proC+ . As 180 colnias obtidas foram tambm testadas em relao aos gentipos de phoA e lacZ, e o resultado est descrito na tabela abaixo: phoA lacZ + + + + no. de colnias 98 44 29 9

a) Qual a ordem dos genes no cromossomo? b) Sabendo que P1 empacota 100 kb de DNA da bactria doadora, qual a distncia aproximada entre os trs genes?