Sci. agric. vol. 53 n. 1 Piracicaba Jan./Apr.

1996
doi: 10.1590/S0103-90161996000100008

ENRAIZAMENTO DE CRAVO (Dianthus caryophyllus L.) IN VITRO E EX VITROl

G.R.F. CUZZUOL2; L.A. GALLO3; O.J. CROCOMO3
CEUNES/UFES, CEP: 29930 -000, So Mateus, ES. Depto. de Qumica/CEBTEC-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418 -900, Piracicaba, SP.
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RESUMO: Plntulas de cravo (Dianthus caryophyllus) micropropagadas durante vrias geraes pelo perodo de um ano, foram enraizadas in vitro com AIA, ANA e AIB nas concentraes de 0,0; 0,25; 0,5 e 1,0 mg/l, em fatorial do tipo 3 x 4, com todos os tratamentos promovendo a formao de razes, mas no diferindo do controle. Foi confrontado em condio autotrfica, o desempenho entre plntulas enraizadas in vitro na presena e ausncia do regulador AIA 0,5 mg/l e plntulas enraizadas ex vitro, sem nenhuma diferena quanto ao comprimento da parte area. Para a varivel produo de massa de matria seca os melhores resultados foram proporcionados pelas plantas que passaram pela fase de enraizamento in vitro, tendo o sistema radicular efeito sinergstico no crescimento da parte area. Descritores: Dianthus caryophyllus, cravo, micropropagao e enraizamento

ROOTING OF CARNATION (Dianthus caryophyl lus L.) IN VITRO AND EX VITRO ABSTRACT : Plantlets of carnation (Dianthus caryophyllus L.) micropropagated through several generations during one year, were observed with respect to rooting in vitro, in the presence of IAA , NAA and IBA, at the following concentrations: 0,0; 0,25; 0,5 and 1,0 mg/l. All treatments promoted root formation, however no differences were detected in comparison to control. As far as the lenght of the aerial part is concerned no difference was observed between in vitro rooting. in the presence or absence of IAA 0,5 mg/l, and ex vitro rooting. Plantlets which were rooted in vitro conditions showed higher production of fresh matter then those rooted ex vitro. The root system had a synergistic effect on the growth of the aerial part. Key Words: Dianthus caryophyllus, carnation, micropropagation, rooting

INTRODUO
Diversos componentes do meio de cultura so frequentemente alterados visando a melhor promoo do enraizamento, contudo, so os nveis e a qualidade da auxina os fatores, em geral, que tem maior influncia no enraizamento (Hu & Wang, 1983). Baixos nveis de auxina tem sido utilizados na formao de razes de cravo in vitro. Petru & Landa (1974) usaram 2,2 M de ANA (cido naftaleno actico) em meio de Morel enquanto Roest & Bokelmann (1981), Lubomski & Jerzy (1989) e Barancok (1991) obtiveram enraizamento satisfatrio do cravo em meio de MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 5,5 M de NAA, 0,1 mg/l de AIA (cido indolactico) e 5-10 M de AIA, respectivamente. Para Choudhary(1991) melhor enraizamento foi proporcionado por 10 M de AIB (cido indolbutrico) em meio lquido. Ioannov (1990) determinou ANA como sendo a melhor auxina para emisso de razes de cravo na concentrao de 1 mg/l. O enraizamento in vitro sem o uso de regulador desejvel, pois leva a uma reduo dos custos com a eliminao de reguladores nesta fase. Dependendo da espcie, o enraizamento pode ser realizado em condio ex vitro podendo, porm apresentar alta taxa de mortalidade (Preece & Sutter, 1991). Neste caso, esses autores aconselham que o enraizamento deva ser conduzido in vitro mesmo com a elevao dos custos. Do ponto de vista econmico, o enraizamento ex vitro apresenta uma considervel reduo dos custos de mo-de-obra e infra-estrutura, pois uma etapa da micropropagao eliminada: a de enraizamento in vitro. Alm disto, o enraizamento ex vitro pode conferir qualidades adicionais como sistema de enraizamento funcional refletindo no bom desenvolvimento da parte area. Um nmero de plantas micropropagadas no sobrevive com a transferncia para casa de vegetao, devido a baixa umidade e altos nveis de luminosidade. A causa principal da baixa sobrevivncia foi apontado por Brainerd & Fuchigami (1982) e Sutter & Langhans (1982) perda excessiva de gua. Plantas cultivadas in vitro, normalmente apresentam deficincia de cera epicuticular cuja funo limitar as perdas de gua atravs da transpirao (Grout & Aston, 1978; Sutter & Langhans, 1979; 1982). Uma das sugesstes utilizadas consiste na reduo da umidade que pode ser obtida empregando sistemas de vedao que permitam maior aerao. O enraizamento in vitro sem o emprego de reguladores ou diretamente no solo desejvel sob o aspcto econmico e robotizao. H um grande interesse neste sentido, no entanto, poucos trabalhos tem sido conduzidos para este fim, especialmente para as de interesse ornamental, como o cravo. Da, surge o presente trabalho tendo o objetivo de determinar as exigncias qualitativas e quantitativas de fitorreguladores no enraizamento do

cravo in vitro e avaliar, em condio autotrfica, o desempenho de plantas enraizadas in vitro e ex vitro.

MATERIAL E MTODOS
Enraizamento in vitro: O experimento foi instalado na forma de um fatorial do tipo 3 x 4 onde foi testado o efeito dos reguladores AIA, ANA e AIB nas concentraes 0,0; 0,25; 0,5 e 1,0 mg/l. Brotos adventcios medindo aproximadamente 20,0 mm de comprimento de cravo (Dianthus caryophyllus) cultivados in vitro durante um ano, foram transferidos assepticamente para frascos vedados com tampas de algodo, contendo 15,0 ml de meio MS solidificado com 4,5 g/l de "gelrite". O delineamento foi em quatro blocos inteiramente casualizados constitudos de 10 parcelas, cada qual compreendendo 5 explantes, perfazendo um total de 20 repeties por tratamento. As parcelas foram distribudas aleatoriamente dentro de cada bloco. As variveis analisadas foram a produo de matria seca da raiz e da parte area aos 40 dias aps a instalao do experimento. Desenpenho entre plantas enraizadas in vitro x ex vitro: Para o enraizamento ex vitro, os explantes foram envazados diretamente em substrato formado por uma mistura de areia + terra + argila (1:1:1) e mantidos sob sombrite em casa de vegetao: a) plantas de cravo enraizadas in vitro com 0,5 mg/l de AIA; b) plantas enraizadas in vitro sem o uso de regulador; c) plantas sem passarem pela fase de enraizamento in vitro (microestaquia). Estas ltimas foram cultivadas in vitro (MS + 4,5 g/l de "gelrite") em frascos com tampas de algodo durante 30 dias antes da transferncia para a condio ex vitro. O experimento constituiu-se de 20 repeties por tratamento num delineamento inteiramento casualizado, coletando-se 10 amostras aleatoriamente para anlise comparativa, cujas variveis foram o comprimento e a produo de massa de matria seca d raiz e da a parte area. O material foi avaliado aos 70 dias aps a instalao do experimento. Os dados dos experimentos, aps a anlise de varincia, foram submetidos ao teste de Tukey 5% de significncia quando o valor de F foi significativo, utilizando-se o pacote estatstico "SANEST"(Sarris et al., 1992).

RESULTADOS E DISCUSSO
Diversas espcies, principalmente as herbceas, enraizam facilmente in vitro sob baixos nveis de auxina ou, simplesmente, em meio bsico sem reguladores (Anderson, 1984; Hasegawa, 1980). Tais informaes corraboram os resultados obtidos e apresentados na Figura l onde todos os tratamentos promoveram satisfatoriamente a rizognese do cravo in vitro, porm, sem diferena significativa tanto para concentraes quanto para os tipos de reguladores de crescimento, o que permite concluir que o

enraizamento desta espcie pode ser obtido sem a suplementa o do meio bsico com auxina. Este resultado pode representar uma grande vantagem econmica, pois reflete na imediata reduo dos custos com a eliminao do uso de reguladores na fase de enraizamento in vitro. De fato, o enraizamento sem o uso de reguladores uma prtica visada na automao da micropropagao, porm, escassos trabalhos tem sido condusidos neste sentido. Destes, relatado que 45% de enraizamento foi conseguido com Gypsophila paniculata (Kusey et al., 1980) e rosas sem o emprego de reguladores, enquanto em Hostea decorata este valor foi de 100% (Hasegawa, 1980) e em Salpiglossis sinuata, 60% (Lee et al., 1977)

Os processos distintos de crescimento que ocorrem simultaneamente numa planta, esto intimamente relacionados, podendo o desenvolvimento de uma parte implicar no crescimente de outra. Tal comportamento bem distinto durante a rizognese, onde o crescimento acelerado das razes pode retardar o desenvolvimento da parte area. De acordo com Coll et al. (1988), esta relao se deve ao fato de que o crescimento ativo do sistema radicular necessita de substncias orgnicas translocadas da parte area para a base, comprometendo, assim, o desenvolvimento do caule e das folhas. Mas, uma vez estabelecida, a raiz tende a promover o crescimento da parte area. Para o cravo, embora fisiologicamente, constate-se um efeito sinergstico entre a produo de raiz e parte area para as substncias AIA e AIB (Figuras 1 e 2), a correlao entre essas variveis no foi significativa para os nveis das auxinas. No foi observada diferena significativa na produo de matria seca da parte area em resposta aos tratamentos aplicados (Figura 2), podendo-se inferir que nem as doses nem o tipo de regulador de enraizamento tiveram efeitos contudentes, no padro morfogentico da parte area.

Dois fatores podem ter contribuido ao bom enraizamento do cravo in vitro sem o emprego de regulador, aparentemente devido a produo endgena de auxina pela planta. Segundo Coll et al. (1988), as partes areas so fontes de intensa produo de auxina que, ao ser translocada para a base, estimularia a rizognese. Um outro fator a ser considerado, o tamanho das partes areas. Brotos pequenos em geral no enraizam bem necessitando, portanto, de uma fase intermediria adicional de alongamento. Deste modo, baseado no excelente enraizamento obtido neste trabalho sem o uso de regulador (100%), o tamanho dos explantes utilizados neste experimento (ca. 20,0mm) revelaram competncia na formao de raz. Uma possvel causa da inexistncia de variao na produo de raizes do cravo in vitro em relao aos nveis quantitativos e qualitativos dos reguladores, pode ser atribudo, entre outras, a no distino das fases de induo, iniciao e alongamento de razes in vitro, neste trabalho. Enquanto a induo e iniciao da rizognese depende de auxina, o alongamento das razes inibido pela sua presena (Grattapaglia & Machado, 1990). Para tanto, tem sido sugerido o enraizamento in vitro em 2 etapas: a de induo e iniciao, e uma outra de alongao, o que acarretaria numa considervel elevao dos custos. Uma alternativa apresentada por esses autores consiste em induzir o enraizamento in vitro e o posterior alongamento em substrato de transplantio. Esta prtica, alm de gerar economia, encurtanto o perodo de enraizamento in vitro, pode levar ao desenvolvimento de um sistema radicular mais eficiente. Um outro sistema de enraizamento aplicado com xito em programas de micropropagao em muitas espcies herbceas, consiste em manipular as partes areas como em microestaquia, o enraizamento se processando em condio autotrfica. Este procedimento foi testado satisfatoriamente neste trabalho ao se confrontar o desempenho das plantas que foram enraizadas in vitro (com e sem o uso de reguladores) e ex vitro (diretamente no substrato). No houve diferena significativa quanto ao comprimento da parte area em relao s formas de enraizamento (Figura 3), mas a produo de matria de matria seca foi maior em plantas que passaram pela fase de enraizameto in vitro (Figura

4). Notou-se, tambm, efeito sinergstico da raiz na produo da parte area.

Ao contrrio do ensaio "enraizamento in vitro", este experimento apresentou correlao significativa entre produo de massa de matria seca de raiz e da parte area, com as melhores taxas de crescimento recaindo para as formas de enraizamento in vitro devido, provavelmente, ao sistema radicular j existente na instalao do experimento. Embora no enraizamento ex vitro, a raiz tambm teve efeito sinergstico no crescimento da parte area, este foi menos acentuado em face as necessidades energticas da rizognese ex vitro que deve ter sido satisfeito pelas atividades fotossintticas da parte area. Por outro lado, levando em considerao a inexistncia de variao para o comprimento da parte area s formas de enraizamento in vitro e ex itro e a reduo do tempo com a eliminao de uma etapa da micropropagao, a de enraizamento in vitro, conclui-se ento que

plantas micropropagadas de cravo poderiam ser enraizadas e aclimatadas diretamente no solo. O enraizamento ex vitro, pode substancialmente reduzir os custos da micropropagao, uma vez que o processo de enraizamento in vitro tem sido estimado ser responsvel por aproximadamente 35 a 75% do custo total da micropropagao (Debergh & Maene, 1981). A eliminao da etapa de enraizamento in vitro , tambm, altamente desejvel sob o aspecto de qualidade do sistema radicular, pois a regenerao de razes diretamente no substrato tende a produzir um sistema radicular mais completo e funcional, com maior nmero de razes secundrias (Debergh & Read, 1991). Outras razes que asseguram o enraizamento em condi o autotrfica que o enraizamento in vitro oferece algumas desvantagens: a) sistema radicular pode no ser funcional; b) maior probabilidade de contrair doenas durante o transplantio; e c) limitado sistema vascular de conexo entre o caule e a raiz (Grout & Aston, 1977, Debergh & Read, 1991 e Grattapaglia & Machado, 1991) refletindo na sobrevivncia e desenvolvimento das plantas durante a aclimatao. De fato, em alguns casos como em rosas, melhores resultados no transplantio se deu com o enraizamento no controle e baixas concentraes de AIA (Hasegawa, 1980). Observou-se uma tima sobrevivncia das plantas aclimatadas (84%). Uma das possveis causas pode ser atribuda condio de baixa umidade durante o cultivo in vitro oferecida pela vedao do tipo tampas de algodo (Grout & Aston, 1977). Provavelmente essa condio tenha estimulado a sntese de cera epicuticular e permitido maior atividade fotossinttica pela disponibilidade de CO do ar. Em geral, plantas crescidas in vitro apresentam limitada taxa de fotossntese que pode ser atribuda, entre outros fatores, inadequada troca gasosa dos frascos (Fujiwara et al., 1987 e Kozais et al., 1987a). De Proft et al. (1985) constataram uma diminuio no nvel de clorofila e aumento de CO2 com vedao hermtica. Levando em considerao as baixas perdas durante a aclimatao (16%) e a constatao de que plantas enraizadas ex vitro foram equivalentes, ao menos quanto ao comprimento da parte area, quelas que passaram pela fase de enraizamento in vitro, ento o enraizamento e aclimatao podem ser conduzidos, simultaneamente, em condio autotrfica.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AITKEN-CHRISTIE, J. Automation. In: DEBERGH, P.C.; ZIMMERMANN. Micropropagation: technology and application. Amsterdan: Kluwer Academic Publi., 1991. p.363 -388. [ Links ] ANDERSON, W.C. A revised tissue culture medium for shoot multiplication of Rhododendron. Journal Americam Society Horticultare Science, v.109, p.343 -347, 1984. [ Links ] BARANKOK, P. Tissue cultures of select species of the genus Dianthus L. and their utilization in the protection of Slovak

phytogenofound. Biologia Bratislava, v.46, n.9, p.745 -756, 1991. [ Links ] BRAINERD, K.E.; FUCHIGAMI, L.H. Stomatal functioning of in vitro and greenhouse apple leaves in darkness, manitol, ABA, and CO2. Journal of Experimental Botany , v.33, p.338-392, 1982. [ Links ] CHOWDHARY, M.L. Vegetal propagation of carnation in vitro through multiple shoot development. Indian Journal of Horticulture, v.48, n.2, p.177 -181, 1991. [ Links ] COL, J.B.; RODRIGO, G.N.; GARCA, B.S.; TOMES, R S. Fisiologia Vegetal. 6 ed. Madri: Pirmide, 1988. cap.8: Morfogeneses: p.569570. [ Links ] DE PROFT, M.P.; MAENE, L.J.; DEBERGH, P.C. Carbon dioxide and ethylene evolution in the culture atmosphere of Magnola cultured in vitro. Physiology Plantarum , v.65, p.375-379, 1985. [ Links ] DEBERGH, P.C.; MAENE, L.J. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture. Scientia Horticulturae , v.14, p.335-345, 1981. [ Links ] DEBERGH, P.C.; READ, P.E. Micropropagation. In: DEBERGH, P.C.; ZIMMERMAN, R.H., ed. Micropropagation: technology and application. Amsterdan: Kluwer Academic, 1991. p.1-13 [ Links ] FUJIWARA, K.; KOZAI, T.; WATANABE, I. Measurement of carbon dioxide gas concentration in stoppered vessels containing tissue cultured plantlets and estimates of net photosynthetic rates of the plantlets. Journal of Agricultural Meteorology , v.43, p.21-30, 1987. [ Links ] GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropro-pagao. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. Tcnicas e aplicaes da cultura de tecidos de plantas . Braslia: ABCTP/EMBRAPA-CNPH, 1990. p.99-169. [ Links ] GROUT, B.W.W.; ASTON, M.J. Transplanting of cauliflower plants regenerated from meristem culture, I. Water loss and water transfer related to changes in leaf wax and to xylem regeneration. Horticulturae Research, v.17, p.1-7, 1977. [ Links ] HASEGAWA, P.M. Factors affecting shoot and root initiation from cultured rose shoot tips. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.105, p.216 -220, 1980. [ Links ] HU, C.Y.; WANG, P.J. Meristem, shoot tip and bud culture. In: EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; AMMIRATO, P.V.; YAMADA, Y. Handbook of plant ce ll culture. 1 v. Techniques for propagation and breeding. New York: Macmillan Publishing Company, 1983. p.177-227 [ Links ]

IOANNOV, M. Production of carnation plants by shoot tip culture in vitro. Technical Bulle tin Cypres Agricultural Research Institute, v.117, p.8, 1990. [ Links ] KOZAI, T.; IWANAMI, Y.; FUJIWARA, K. Effects of CO 2 enrichment of the plantlet growth during the multiplication stage. Plant Tissue Culture Letters, v.4, p.22-26, 1987a. [ Links ] KOZAI, T. HAYASHII, M.; HIROSAWA, Y.; KODAMA, T. Y.; WATANABE, I. Environmental control for acclimatization of in vitro cultured plantlets (1) Development of the accllimatization unit for accelerating the plantlet growth and the test cultivation. Journal of Agronomic Metereology, v.42, p.349 -358, 1987b. [ Links ] KUZEY, W.E.; ALLEN HAMMER, J.; WEILER, T.C. In vitro propagation of Typsophila paniculata L. "Bristol Fairy". HortScience, v.15, n.5, p.600 -601, 1980. [ Links ] LEE, C.W.; SKIRVIN, R.M.; SOLTERO,A.I.; JANICK, J. Tissue culture of Salpiglossis sinuata L. from leaf discs. HortiScience, v.12, n.16, p.547-549, 1977. [ Links ] MURASHIGE T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant, v.15, p.473-497, 1962. [ Links ] LUBOMSKI, M.; JERZY, Z. Organogenesis in isolated carnation plant callus tissue cultivated in vitro. Biologia Plantarum , v.16, p.450453, 1974. [ Links ] PETRU, E.; LANDA, Z. Organogenesis in isolated carnation plant callus tissue cultivated in vitro. Biologia Plantarum , v.16, p.450453, 1974. [ Links ] PREECE, J.E.; SUTTER, E.G. Aclimatization of micropropagated plants to the greenhouse and field. In: DEBERGH, P.C.; ZIMMERMAN, R.H. Micropropagation: technology and application. Amsterdan: Kluwer Academic Publishing, Cap.5, p.71-93, 1991. [ Links ] ROEST, S.; BOKELMANN, G.S. Vegetative propagation of carnation in vitro through multiple shoot development. Scientia Horticulturae, v.14, p.357 -366, 1981. [ Links ] SARRIS, G.A.; OLIVEIRA, J.C.V.; ALVES, M.C. Sanest, (Didtica, 6), Piracicaba, 1992. 77p. [ Links ] SUTTER, E.G.; LANGHANS, R.W. Epicuticular wax formation on carnation plantlets regenerated from shoot tip culture. Journal of the American Society for Horticultural Science , v.104, n.4, p.493-496, 1979. [ Links ] SUTTER, E.G.; LANGHANS, R.W. Formation of epicuticular wax and its effect on water loss in cabbage plants regenerated from shoottilp culture. Canadian Journal of Botany , v.60, p.2896 -2902, 1982. [ Links ]

Recebido para publicao em 16.05.95 Aceito para publicao em 30.12.95