Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos

Sesin n 2 Presentacin del Manual, Mtodos de Trabajo e Introduccin del Curso M. Querci

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Cmo detectar OGM Ventajas y limitaciones intrnsecas de los enfoques del ADN y de las protenas Consideraciones generales y presentacin del Manual Bibliografa

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Cmo detectar OGM

Como se ha visto anteriormente, las plantas transgnicas se caracterizan por la insercin de un nuevo gen (o de un nuevo conjunto de genes) en sus genomas. El nuevo gen o genes se traducen y la nueva protena se expresa. Esto proporciona a la planta una caracterstica nueva, como la resistencia a determinados insectos o la tolerancia a ciertos herbicidas. La base de todas las tcnicas de deteccin de OGM consiste en explotar la diferencia entre la variedad no modificada y la planta transgnica. Esto puede hacerse detectando el nuevo ADN transgnico que se ha insertado, o la nueva protena expresada, o (si la protena acta de enzima) utilizando el anlisis qumico para detectar el producto de la reaccin enzimtica. Hay dos planteamientos cientficos que se utilizan generalmente en la actualidad para detectar modificaciones genticas en plantas como la soja, el maz, el algodn y otras. Uno es el ELISA (ensayo de inmunoabsorcin enzimtica), con el que se estudia la presencia de protenas especficas explotando la especificidad de la unin entre un antgeno expresado y un anticuerpo diana; el otro es la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), basada en la deteccin de secuencias nuevas de ADN insertadas en el genoma de la planta. Estos mtodos muestran la ausencia o presencia del OGM en la muestra, pero a veces tambin pueden dar una indicacin cuantitativa (porcentaje) sobre la muestra estudiada. El primer mtodo validado a nivel comunitario es uno de cribado que aplica la PCR y es capaz de detectar la mayora de los OGM cuya comercializacin est autorizada actualmente (Lipp et al., 1999). Este mtodo, elaborado por Pietsch et al. (1997), se basa en la deteccin de las secuencias de control que flanquean al gen introducido, y que son el promotor 35S y el terminador nos. La validacin fue coordinada por la antigua Unidad de productos alimentarios y bienes de consumo del Instituto de la Salud y la Proteccin de los Consumidores, del Centro Comn de Investigacin, y se hizo en colaboracin con el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia del CCI, encargado de la produccin de los apropiados materiales de referencia certificados. Como se seala ms arriba, tambin hay actividades de investigacin para el desarrollo de mtodos relativos a las protenas. Se ha validado un mtodo muy especfico para la deteccin de soja Roundup Ready utilizando ELISA (Lipp et al., 2000) y se han elaborado otros (http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).

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Ventajas y limitaciones intrnsecas de los enfoques del ADN y de las protenas

El enfoque del ADN Cada vez se utilizan ms los mtodos analticos basados en la tcnica de la PCR para la deteccin de secuencias de ADN asociadas con OGM. La PCR permite la amplificacin selectiva de segmentos especficos de ADN presentes con baja frecuencia en una mezcla compleja con otras secuencias de ADN. En la PCR, los pequeos fragmentos de ADN complementario se llaman cebadores y se utilizan por pares. Estos cebadores se disean para hibridarse con sitios de reconocimiento de la secuencia complementaria en hebras opuestas del gen de inters. A travs de una serie de ciclos trmicos diferenciales repetitivos, una enzima ADN polimerasa ayuda a la replicacin y a la amplificacin exponencial de la secuencia situada entre el par de cebadores. Finalmente, estos fragmentos amplificados se someten a electroforesis en gel normal para poder detectar su presencia en funcin de la determinacin de su tamao. Se han desarrollado muchos mtodos basados en esta PCR que pueden detectar y cuantificar los OGM presentes en plantas agrcolas utilizadas como alimentos y piensos. Por otra parte, la determinacin de la identidad gentica permite la segregacin y la trazabilidad (preservacin de la identidad) a lo largo de la cadena de distribucin de las plantas GM. Un requisito previo fundamental de la deteccin de OGM es el conocimiento del tipo de modificacin gentica, incluida la conformacin molecular del gen introducido y los elementos reguladores (promotores y terminadores) que lo flanqueen. Para el anlisis es necesario disponer de una cantidad mnima de material de muestra con ADN intacto, incluido el gen diana. La PCR es una tcnica de laboratorio cuya realizacin exige personal formado y material especializado. A continuacin se indican algunas de las caractersticas clave del diagnstico por PCR: - Puede ser extremadamente sensible, capaz de detectar la presencia de unos pocos ejemplares (e incluso de un solo ejemplar) de un gen o secuencia diana de inters dentro de todo el material gentico de un organismo (genoma). Como resultado de esta elevada sensibilidad, pueden obtenerse falsos positivos con niveles muy bajos de contaminacin accidental. Por tanto, ha de extremarse la atencin para evitar la contaminacin cruzada.

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- Exige poco tiempo de elaboracin de los reactivos comparando con los ensayos inmunolgicos (sntesis de cebador frente a produccin de anticuerpos). - Casi todos los reactivos necesarios estn disponibles en el comercio y pueden obtenerse fcilmente de varias fuentes. Sin embargo, hace falta una autorizacin para utilizar algunos de ellos en actividades de diagnstico comerciales. - El anlisis de las muestras lleva un da aproximadamente. - La PCR puede discriminar entre diferentes tipos de modificacin gentica (tambin denominados productos transgnicos) si se efecta adecuadamente. Los mtodos de diagnstico para identificar productos transgnicos especficos necesitan ms tiempo de elaboracin y actividades de validacin. El enfoque de las protenas El mtodo de ensayo de protenas utiliza anticuerpos especficos de la protena de inters. La tcnica ELISA detecta o mide la cantidad de protena de inters en una muestra que puede contener otras muchas protenas diferentes. Utiliza un anticuerpo para ligar la protena especfica, un segundo anticuerpo para amplificar la deteccin (fase optativa) y un conjugado de anticuerpo con una enzima, cuyo producto genera una reaccin coloreada, que es fcil de observar y cuantificar comparando con una curva patrn de la protena de inters. Para la ejecucin adecuada del ensayo hace falta tambin personal formado y material especializado. Entre las caractersticas fundamentales de los ensayos con ELISA estn las siguientes: - Menor sensibilidad que la PCR, por lo que es ms difcil que aparezcan falsos positivos debidos a pequeos niveles de contaminacin. - Elevados costes iniciales para el desarrollo del ensayo y la obtencin de anticuerpos y patrones de protenas. - Reducidos costes por muestra, una vez elaborados los reactivos. - No puede discriminar entre diferentes modos y modelos de expresin de diferentes productos transgnicos que expresan caractersticas protenicas similares. - Los mtodos de protenas exigen un notable tiempo de preparacin de los reactivos y del mtodo. - Los mtodos de ensayo de protenas son prcticos y eficaces cuando se produce una protena detectable. Sin embargo, es posible que los productos modificados genticamente se formen solo durante ciertas fases del desarrollo o en determinadas partes de los vegetales, por lo que resultara poco probable que tales productos fueran detectados sin problemas por la tcnica ELISA. Por otra parte, las

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transformaciones industriales desnaturalizan fcilmente las protenas, lo que plantea dificultades para el uso de mtodos ELISA con fracciones de alimentos transformados. Teniendo todo esto en cuenta, ha de quedar claro que el ELISA y la PCR deben considerarse mutuamente complementarios y no se excluyen entre s.

Cuadro 2. Comparacin resumida de los mtodos ELISA y PCR

Mtodo ELISA

Objeto Protenas

Duracin 2 - 8 horas

PCR

ADN

1 3 das

Facilidad de utilizacin Moderada; exige conocimiento de las prcticas de laboratorio; los ensayos son especficos de especie y de variedad. Escasa; requiere formacin y material especializados.

Resultados Confirma una modificacin gentica especfica y permite la cuantificacin.

Muy sensible; tiende a dar falsos positivos; confirma la presencia de ADN GM y permite la cuantificacin.

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Consideraciones generales y presentacin del Manual

La validacin del mtodo es crtica tanto para los laboratorios como para las autoridades de control. Lo ideal es que un nmero limitado de laboratorios capacitados verifique las caractersticas de cada mtodo en cuanto a su capacidad de dar resultados reproducibles, sensibles y especficos. El Centro Comn de Investigacin de la Comisin Europea fue el primero en validar los mtodos ELISA y PCR para materias primas constituidas por soja Roundup Ready y un mtodo PCR para maz Maximizer (Bt-176), as como un mtodo PCR tanto para soja Roundup Ready como para maz Maximizer (Bt-176) en fracciones de alimentos transformados (Lipp et al., 1999, 2000 y 2001). Despus se han desarrollado y validado algunos otros mtodos de anlisis tanto cuali como cuantitativo. Para obtener mas informacin sobre los mtodos validados de deteccin y cuantificacin de OGM en la direccin: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm La preparacin de las muestras, tanto si se aplican mtodos de ADN como de protenas, es crtica para la deteccin y la cuantificacin. Es importante saber las limitaciones de cada procedimiento en funcin del aspecto que interese (p. ej., anlisis cuali o cuantitativo). Tanto el tamao de la muestra como los procedimientos de muestreo influyen muchsimo en las conclusiones que puedan extraerse de estos mtodos de ensayo. Los dos tipos de mtodos dependen fundamentalmente de la disponibilidad de materiales de referencia certificados que sean adecuados. Las muestras utilizadas en el curso son materiales de referencia certificados producidos en el IRMM del CCI (Trapmann et al., 2002 y 2001). Las caractersticas y los certificados correspondientes se presentan en la sesin n 3. de la muestra. La figura 1 resume las distintas fases efectuadas durante el curso. Es fundamental optimizar la extraccin del ADN para garantizar la presencia y calidad del ADN extrado y amplificable por PCR. Este aspecto es particularmente importante, ya que la mayora de los productos alimentarios comercializados a base de soja o maz estn muy transformados. Es bien sabido que el ADN puede degradarse considerablemente durante la transformacin de los alimentos, sobre todo por tratamiento trmico en presencia de agua. Por tanto, a medida que se transforman ms los alimentos, puede disminuir el nmero de fragmentos de ADN que siguen siendo suficientemente largos y conteniendo intacta la secuencia de inters para permitir la deteccin de la presencia de OGM en alimentos transformados. Adems,
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Otra fase crtica, que debe

mencionarse aunque no se va a efectuar durante el curso, es la homogeneizacin

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un mtodo verdaderamente adecuado de extraccin del ADN debe conseguir la eliminacin de las sustancias inhibidoras que pueda haber en la muestra. Este tema se tratar en la sesin n 4. Se han elaborado diversos mtodos de extraccin de ADN y son muchas las empresas comerciales que producen kits especializados listos para usarse. Durante el curso se hablar sobre las caractersticas y la validez de los diferentes protocolos disponibles. Sin embargo, para evitar la implicacin directa de empresas comerciales, se ha decidido efectuar la extraccin del ADN con el denominado mtodo CTAB, protocolo validado y verstil que ha demostrado su idoneidad para varias matrices diferentes. Tras la extraccin del ADN, las muestras (as como los productos de la PCR) se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa (sesin n 5). En la sesin n 6 se presentan los principios, ventajas y desventajas de la reaccin en cadena de la polimerasa. Como ya se ha indicado, la utilizacin eficaz de las tcnicas modernas para la deteccin de OGM depende de la disponibilidad de informacin exacta. La deteccin de OGM exige el conocimiento al menos parcial de la secuencia del gen diana y del tipo de modificacin gentica. En la sesin n 7 se presentan las caractersticas especficas de las lneas transgnicas de maz MON810, maz Bt-176 y soja Roundup Ready. Se han elaborado distintos planteamientos de PCR para la deteccin de los OGM autorizados. La especificidad de la PCR depende de la seleccin exacta de los cebadores. Los cebadores de la PCR pueden dirigirse a diferentes elementos utilizados en el proceso de transformacin. Pueden obtenerse sistemas de deteccin de PCR de banda ancha, denominados generalmente mtodos de cribado, diseando cebadores especficos de las secuencias ms comunes utilizadas en la transformacin. Se trata generalmente de las secuencias reguladoras (promotor y terminador). Los vegetales modificados genticamente pueden dividirse tambin en categoras segn el gen estructural introducido. Otra forma ms de dirigir la especificidad de la reaccin es elegir unos cebadores especficos de las secuencias de ADN localizadas en distintos elementos genticos (p. ej., promotor-gen estructural, gen estructural-terminador). Finalmente, siempre que se disponga de informacin especfica y completa sobre la secuencia, a fin de obtener mtodos realmente especficos de un determinado vegetal modificado genticamente, pueden elaborarse sistemas con especificidad de lnea (especficos de una transformacin) seleccionando una combinacin nica de secuencias, presente tan solo en esa lnea transformada concreta. Esto se consigue generalmente diseando cebadores con hibridacin en la regin del ADN en la que se incluye el

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empalme del sitio de integracin. El empalme entre el ADN insertado (ADN-T) y el ADN hospedador ofrece una secuencia nucleotdica nica que constituye una diana ideal para un ensayo muy especfico por PCR. Los mtodos realizados durante el curso se resumen en la figura 1, y se describen con detalle en la sesin n 8. La parte experimental de los mtodos y protocolos se encuentra en la sesin n 9. Como se indica anteriormente, la necesidad de cuantificar el OGM presente en una muestra hizo que se elaboraran muchos protocolos basados en la PCR, los cuales permiten no solo una respuesta cualitativa (presencia / ausencia), sino tambin una indicacin, ms o menos precisa (segn el mtodo elegido) de la cantidad relativa del OGM presente en una muestra determinada. Los dos planteamientos de ADN ms comunes son la PCR competitiva y la PCR en tiempo real (sesin n 10). La PCR en tiempo real se efecta utilizando una instrumentacin especfica y compleja, que por ahora solo puede adquirirse en unas pocas empresas comerciales. En la sesin n 11 se indican los protocolos que se van a seguir durante el curso. Finalmente, la sesin n 12 contiene una introduccin general al planteamiento serolgico de la deteccin de organismos genticamente modificados. En concreto se explicar la tcnica ELISA y se proporcionar el protocolo para efectuar un ensayo ELISA especfico de Roundup Ready.

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Homogeneizacin de la muestra

No se efectuar durante el curso

Extraccin del ADN Comprobacin de la presencia de ADN vegetal por PCR

Materias primas y transformadas

+
ADN vegetal presente

PCR-lectina para soja y PCR-zena para maz

Sin ADN vegetal detectable

PCR de cribado

Deteccin de elementos reguladores (promotor 35S y terminador nos)

+
Vegetal GM

Vegetal no GM

Deteccin de OGM especficos por PCR anidada

Deteccin de OGM mediante ELISA

Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra

Cuantificacin del OGM mediante PCR en tiempo real

Figura 1. Diagrama de flujo de los mtodos utilizados durante el curso.

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Bibliografa
Lipp, M., Anklam, E. y Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC International 83, 919927. Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504. Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. y Anklam, E. (1999). IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923928. Pietsch, K., Waiblinger, H.-U., Brodmann, P. y Wurz, A. (1997). Screening-Verfahren zur Identifizierung gentechnisch vernderter plfanzlicher Lebensmittel. Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 3538. Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E., Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R., Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. y Anklam, E. (2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different mass fractions of Roundup Ready soya. Certified Reference Materials IRMM410S. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF410_report.pdf) (ltimo acceso enero de 2010) Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H., Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification of reference materials of dry mixed maize powder with different mass fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF413_report.pdf). (ltimo acceso enero de 2010)

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