METILAO DA HISTONA H3 EM EUCROMATINA DE CROMOSSOMOS DE PLANTAS DEPENDE DO CONTEDO DE DNA NUCLEAR BSICO RESUMO A forte metilao da lisina 4 (K4)

e a baixa metilao da lisina 9 (K9) tm sido propostas como modificaes de histona H3, tpicas da atividade transcricional de eucromatina e o oposto para a heterocromatina inativa. Analisamos a correlao entre a distribuio global de histona H3, metilada em lisina 4 ou lisina 9, e as regies eucromticos ou heterocromticos microscopitamente detectveis em relao ao tamanho do genoma de 24 espcies de plantas. Dois diferentes padres de distribuio de metilao (K9) H3 (Met (K9) H3) foram encontrados e dependem do tamanho do genoma. Para a maioria das espcies com genomas pequenos (1C <500 Mbp), incluindo Arabidopsis thaliana, a metilao forte (K9) H3 foi restrita a heterocromatina constitutiva. Espcies com genomas maiores mostraram uma distribuio uniforme do Met (K9) H3. Contrariamente a isto, e independentemente do tamanho do genoma, foi encontrado que a metilao (K4) H3 (Met (K4) H3) enriquece a eucromatina de todas as espcies. Cromossomos B transcricionalmente menos ativos mostraram os mesmos padres com base em A cromossomos. Ns, assim, propomos que os genomas grandes, com altas quantidades de seqncias repetitivas dispersas (principalmente Retroelementos) tm que silenciar essas seqncias e, portanto, mostrar modificaes epigenticas, tais como metilao de DNA e (K9) H3 tambm dentro das regies eucromticos. Palavras-chave: eucromatina, heterocromatina, tamanho do genoma, a metilao da histona H3, silenciando.

Introduo O tamanho do genoma de espcies de plantas pode ser diferente em vrias ordens de magnitude. Poliploidizao independente de alargamento do tamanho do genoma principalmente devido a um aumento da seqncias repetitivas (Sanmiguel et al., 1996). O aumento do genoma exige um mecanismo epigentico para heterocromatinizao de seqncias repetitivas para assegurar a estabilidade do genoma atravs da inativao de elementos mveis (Richards e Elgin, 2002). A (K9) H3 (Met (K9) H3) metilada serve como um stio de ligao para o recrutamento da protena heterocromatina HP1/Swi6 durante a montagem da heterocromatina (Bannister et al, 2001;. Lachner et al, 2001;. Nakayama et al, 2001. ). Em contraste a isso, a metilao (K4) H3 tem sido associada com cromatina transcricionalmente ativa que especfica para eucromatina em vrias espcies de no-plantas (Litt et al, 2001;. Noma et al, 2001;. Rben e Lin, 2002; Strahl et al., 1999). Aqui ns mostramos que as investigaes citolgicas podem ampliar nossa viso sobre a organizao em grande escala e a re-modelagem epigentica da cromatina e fornecer uma hiptese testvel para a relao entre o tamanho do genoma e modificao das histonas em eucromatina e heterocromatina constitutiva. Analisamos a distribuio das isoformas da histona H3, metilada em ambos os K4 ou K9, entre regies cromossmicas heterocromticos e eucromticos detectveis microscopicamente de um musgo, 10 monocotiledneas e 13 espcies de plantas dicotiledneas de tamanho do genoma diferente. Alm disso, as espcies que possuem cromossomos B foram analisadas para comparar os nveis de metilao da histona H3 em cromossomos transcricionalmente ativa versus transcricionalmente pobres.

Resultados O padro de distribuio cromossmica de metilado (K9) H3 influenciado pelo tamanho do genoma nuclear Os anticorpos contra histonas H3 metilado em lisina 4 ou lisina 9 reconhecem uma protena do tipo H3, com massa molecular de 15 kDa em Western blots de cevada e extratos de tabaco protena (Figura 1). Os anticorpos so susceptveis a reconhecer o mesmo peptdeo em plantas porque a seqncia de aminocidos da histona H3 de muitas espcies de plantas so idnticas seqncia de peptdeo sinttico utilizado para a imunizao. Primeiro, determinamos a distribuio de anticorpos especficos para metilado (K4) H3 (Met (K4) H3) ou Met (K9) H3 em clulas mitticas de Arabidopsis thaliana e Vicia faba. Arabidopsis thaliana tem um genoma muito pequeno (cerca de 170 Mbp) e apenas cerca de 15% do genoma nuclear consiste de seqncias repetitivas (Leutwiler et al., 1984), principalmente localizados na heterocromatina pericentromrica e regies de organizao do nuclolo (Bauwens et al. , 1991; Maluszynska e Heslop-Harrison, 1991). Em contraste, V. faba possui um genoma relativamente grande (cerca de 12 810 Mbp) e contm pelo menos 85% seqncias repetitivas (Flavell et al., 1974), que esto presentes em nas regies heterocromticas bem como nas regies eucromticos (Fuchs et al. , 1998). Em A. thaliana, o bandeamento Giensa positivo (Ambros e Schweizer, 1976) correspondente de modo vivo a 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coradas de heterocromatina mostraram forte ligao Met (K9) H3 de imunofluorescncia especfica durante a interfase e diviso nuclear (Figura 2). Poucos sinais foram vistos na eucromatina, menos intensamente DAPI corada (Figura 2). Em contraste, imunosinais para H3 metilado em K4 foram enriquecidas em eucromatina, enquanto nuclolos e cromocentros heterocromaticos permaneceram sem colorao. Portanto, a metilao extensiva de K9 e, reciprocamente, a metilao rara de K4 da histona H3 parecem ser caractersticas especficas de heterocromatina em A. thaliana. Em V. faba, todos os cromossomos revelaram uma distribuio mais ou menos uniforme de Met (K9) H3. Apenas ocasionalmente eram proeminentes regies heterocromticas em ncleos interfsicos encontradas por serem mais intensamente marcada (Figura 3a). Metilado (K4) H3 no era detectvel na heterocromatina constitutiva durante a interfase ou em

cromossomos metafsicos (Figura 3b, c). Assim, Met (K4) H3 est localizado dentro da eucromatina citologicamente definida enquanto Met (K9) H3 est concentrada dentro de heterocromatina citologicamente definido apenas em A. thaliana. Esta diferena levantou a questo de saber se a distribuio de Met (K9) H3 depende do tamanho do genoma bsico. Assim, analisamos a distribuio de Met (K9) e H3 Met (K4) H3 para 22 espcies de plantas adicionais, incluindo monocotiledneas, dicotiledneas e um musgo, com tamanhos de genoma que variam de 170 a 44 500 Mbp (Tabela 1). Como em A. thaliana, os sinais para Met (K9) H3 ocorreram quase que exclusivamente dentro da heterocromatina microscopicamente detectvel de espcies com um contedo de DNA de cerca de 500 Mbp ou menos. Esses sinais se correlacionam com o bandeamento Giensa positivo de regies heterocromticas at agora descrito. O contraste dispersos e a rotulagem quase uniforme da cromatina total, como foi observado em V. faba, foi encontrado para o arroz (cerca de 500 Mbp) e todas as espcies com um tamanho de genoma claramente acima de 500 Mbp (Tabela 1). Nuclolos mostrou uma rotulagem mdia com H3 (K9) anti-Met na maioria dos casos. Esse resultado sugere que o tamanho do genoma um fator que significativamente influencia a distribuio global de Met (K9) H3. No entanto, o contedo de DNA nuclear pode no ser o nico determinante da distribuio cromossmica de Met (K9) H3 porque as espcies com um tamanho de genoma perto de 500 Mbp apresentaram distribuio ou em cluster (Ricinus communis (Figura 4c), Cardaminopsis arenosa) ou uniforme de Met (K9) H3 (Oryza sativa (Figura 4d), Brachypodium sylvaticum). A colorao DAPI de C. arenosa e ncleos de R. communis revelou pronunciados cromocentros heterocromticos, enquanto que em O. sativa (Figura 4d) e sylvaticum B., a heterocromatina parecia ser mais dispersas. Assim, em um tamanho de genoma de aproximadamente 500 Mbp 1C-1, a distribuio de Met (K9) H3 aparentemente depende da distribuio genmica (cluster contra dispersa) de seqncias repetitivas. Apesar de monocotiledneas com genomas menores do que o do arroz no estarem disponveis, propomos que a dependncia do tamanho do genoma para a distribuio de Met H3 (K9) semelhante para todas as plantas, porque a maioria dos genomas de monocotiledneas e dicotiledneas mostraram o mesmo padro de Met (K9) H3.

A metilao eucromatina especfico de (K4) H3 independente do tamanho do genoma Independentemente do tamanho do genoma, a imuno-marcao com anticorpos contra Met (K4) H3 resultou em exclusiva rotulagem de regies eucromticos da interfase e de ncleos mitticos. Isso se correlaciona com as regies negativas do bandeamento Giensa, conforme descrito. Do arroz (Figura 5a), milho (Figura 5b), cevada (Figura 5c), aveia (Figura 5d), Ornithogalum longibracteatum (Figura 5e), Trillium camschatcense (Figura 5f), centeio (Figura 6c, d) e capillaris Crepis ( Figura 6a), Met (K4) H3 ocupa preferencialmente as regies eucromticos nas posies distais (Figura 5a d, f) e fora os cromocentros DAPI-brilhantes (Figura 5e), respectivamente. Alm disso, em ncleos de cevada e centeio, duas espcies mostram uma tpica orientao-RABL em interfase (Dong e Jiang, 1998), a Met (K4) H3 cromatina ocupa os plos opostos de centrmeros (Figura 5c) em torno do qual heterocromatina agrupada, nestas espcies. Nuclolos permaneceram sem rtulo. Isto concorda com as observaes de Briggs et al. (2001) sobre leveduras mostrando que a metilao de (K4) H3 necessria para silenciamento de rDNA. A distribuio eucromatina especficas de metilado (K4) H3 similar entre os cromossomos A e B O estado de metilao de lisina 4 e 9 de histona H3 em cromossomos supranumerrios B e base A cromossomos de C. capillaris, Brachycome dichromosomatica e Secale cereale foram determinados. Os cromossomos B destas espcies so morfologicamente distinguveis aps colorao DAPI (Figura 6). Uma comparao entre a intensidade de imunofluorescncia de cromossomos A e B indicaram que ambos os tipos de cromossomos mostram padres similares de metilao (K9) H3 (dados no mostrados). Um grau comparvel de metilao foi encontrado para (K4) H3 de A cromossomos transcricionalmente ativos e os cromossomos B transcricionalmente menos ativos de capillaris C. (Figura 6a) e S. cereale (Figura 6c, d). As regies pericentromricas do cromossomo B metacntricos, bem como outras regies heterocromticas do cromossomo A de C. capillaris (Maluszynska, 1990), mostraram um menor grau de (K4) H3 metilao (Figura 6a). O mesmo verdade para os cromossomos A e B de centeio (Figura 6d). Apenas cromossomos micro B de B. dichromosomatica, que so

totalmente heterocromticos e compostos principalmente de repeties em tandem (Houben et al., 1997, 2001), estavam livres de sinais (Figura 6b). Isto sugere que eucromatina e heterocromatina de cromossomos B esto sujeitas a metilao da histona H3 nas lisines 4 e 9 de forma semelhante como o conjunto padro de cromossomos A. Discusso Para explicar a discrepncia entre heterocromatina citologicamente definida e a distribuio uniforme do Met (K9) H3 ao longo dos cromossomos de genomas grandes, deve-se considerar que a quantidade de seqncias repetitivas dispersas no seu interior aumenta citologicamente nas regies eucromticas de acordo com o tamanho do genoma. A eucromatina citologicamente detectvel dentro dos genomas grandes intercalada com diferentes famlias de elementos mveis (em conjunto cerca de 70 85% do genoma nuclear) (Kumar e Bennetzen, 1999) que, embora silenciados por heterochromatinizao, heterocromatina. Sua no so detectveis com genes microscopicamente potencialmente como inter-expresso ativos

presumivelmente responsvel por uma organizao da cromatina que difere daquela da heterocromatina constitutiva. Enquanto citosina-metilada, dispersando seqncias repetitivas pode estar associado a Met (K9) H3 dentro da eucromatina de genomas de grande porte, tais seqncias e as alteraes correspondentes so principalmente confinadas heterocromatina constitutiva de genomas pequenos como o de A. thaliana (Mittelsten Scheid et al, 2002;. Soppe et al, 2002). (K9) H3 metilada, dentro da eucromatina poderia, teoricamente, associar-se (quantidades suficientes de) a protenas que estabelecem heterocromatina. No entanto, a metilao (K4)H3 eucromadtina especfica e a manuteno de altos nveis de acetilao das histonas na cromatina potencialmente ativa aps a replicao (Houben et al, 1996;.. Jasencakova et al, 2000, 2001) poderia impedir este processo dentro da eucromatina de grandes genomas de plantas. Portanto, esta formao de heterocromatina incompleta dentro dos genomas grandes resulta em uma estrutura menos condensada do que a de heterocromatina constitutiva, mas mais densa do que a eucromatina de genomas pequenos (ver modelo, a Figura 7). De fato, foi relatado que para espcies de plantas com baixo contedo de DNA nuclear a quantidade de DNA por unidade de volume nuclear menor do que para plantas com alto contedo de DNA (Barlow, 1977; Raina e Bisht, 1988). Resta ver se Met (K9) H3 nas plantas serve como um stio de ligao para os recm identificados

LHP1 de A. thaliana (Gaudin et al., 2001), o primeiro homlogo de protena heterocromatina 1 de Drosophila em vegetais. A fim de testar se a metilao eucromatina especfica de (K4) H3 correlacionase com cromatina transcricionalmente competente, diferentes tipos de cromossomos B foram includos neste estudo. Cromossomos B so geralmente assumidos como sendo geneticamente inativos porque no so conhecidos genes especficos, com grandes efeitos fenotpicos necessrios para o desenvolvimento normal (Camacho et al, 2000;. Jones, 1995). O padro global semelhante de metilao (K4)H3 entre os cromossomos A e B de trs espcies diferentes levantou a questo se a metilao de (K4) H3 um recurso confivel de diagnstico de eucromatina transcricionalmente potente nas plantas, tanto mais que a rotulagem das regies eucromticos especficas Met (K4) H3 em A cromossomos no reflete o nmero real de genes que independente do tamanho do genoma. Alm disso, a ausncia de Met (K4) H3 parece ser mais significativa na definio da heterocromatina constitutiva do que a presena de Met (K9) H3 que, nos genomas de grande porte, tambm ocorre em eucromatina e pode at ficar reduzida ao nvel de eucromatina dentro dos testes DAPI-positivos da heterocromatina de mutantes defeituosos em metilases de histonas especficas (K9)H3 (Jasencakova et al, 2003;. Peters et al, 2001;.. Schotta et al, 2002). Procedimentos Experimentais Material Vegetal As 24 espcies de plantas analisadas esto listadas na Tabela 1. Isolamento de protenas e anlise de Western blot Aproximadamente 200 mg de tecido foliar de cevada e de tabaco foram pulverizado em um almofariz e pilo usando nitrognio lquido e tratados com 800 ml tampo de lise gelada (20 mM Hepes (pH 7,9), 400 mM de sacarose, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 0,02% NaN3, 1,5 mM PMSF, 1 mM DTT). Depois de um tratamento a curto ultra-som, 800 ml 0,4 M H2SO4 foi adicionado e as amostras foram incubadas em gelo por 1 h. Protenas extradas foram centrifugadas a 1400 g por 10 min. Protenas foram precipitadas com 250 ml cada de metanol e clorofrmio,

incubando no gelo durante 10 min. Aps centrifugao a 1400 por 10 min, a interface foi recuperada. A amostra foi lavada com 1 ml de acetona gelada 80%, incubadas em gelo por 5 min e centrifugados a 1400 g por 10 min. Todas as etapas de centrifugao foram realizados em 48C. A protena pellet foi seca em temperatura ambiente por 15 min e ressuspensa em tampo de carregamento. Protenas foram analisadas por gel de poliacrilamida SDS 15% e visualizados por colorao Coomassie Brilliant Blue ou transferidos para membranas de nitrocelulose. Membranas contendo as protenas foram utilizadas para imunodeteco de Met (K4) H3 ou Met (K9) H3 com anticorpos contra histonas H3, dimetilada em cada lisina 4 ou 9 (Upstate Biotechnology, EUA) e conjugadas com peroxidase e anticorpos de cabra antirabbit (Sigma), usando super sinal de deteco Pico West (Pierce). A especificidade dos anticorpos contra a Met (K4) e H3 Met (K9) H3 foi demonstrada pelo fornecedor e para as plantas por Gendrel et al. (2002). Preparao do cromossomo e imunocolorao in situ Folhetos do musgo Pellia epiphylla e meristemas de raiz das outras plantas estudadas foram fixados por 30 min em recm-preparada de 4% (w / v) soluo de formaldedo contendo tampo fosfato salino (PBS, pH 7,3), lavados por 45 min em PBS e digerida em 378C por 25 min em uma mistura de pectinase 2,5%, 2,5% celulase Onozuka R-10 e 2,5% pectolyase Y-23 (w / v) dissolvido em PBS. Meristemas foram ento lavadas por 15 min em PBS e esmagado entre uma lmina de vidro e lamnula em PBS. Aps o congelamento em nitrognio lquido, as lamelas foram removidos e as lminas foram transferidos imediatamente em PBS. Para evitar a ligao no-especi fica ao anticorpo, as lminas foram incubadas por 30 min em 8% BSA (w / v), 0,1% Triton X-100 em PBS a temperatura ambiente antes de duas lavagens em PBS por 5 min cada, e incubadas com o anticorpo primrio em uma cmara humidificada. Os anticorpos primrios foram diludos 1: 300 em PBS, BSA 1%. Aps 12 horas de incubao a 48C e lavagem por 15 min em PBS, as lminas foram incubadas em rodamina-conjugados antirabbit IgG (Dianova) diludo 1: 100 em PBS, 1% BSA por 1 hora a 378C. Aps as lavagens finais em PBS, as preparaes foram montadas em Antifade contendo DAPI como contracolorao. Sinais de fluorescncia foram observados usando um microscpio de epifluorescncia. As imagens gravadas com uma cmera CCD refrigerado foram pseudo-coloridos e fundidas com o programa Adobe Photoshop 6,0.

Determinao do teor de DNA genmico O contedo de DNA genmico (1C) foi determinado por citometria de fluxo, como descrito por Barow e Meister (2002) sobre ncleos de propidio iodidestained. Allium cepa e V. faba serviram como plantas de referncia para espcies com grandes genomas e Glycine max e nabo forrageiro para espcies com genomas pequenos.