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ACTIVIDAD Y CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR UNA NUEVO MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN PLANTAS Microorganismos capaces

de utilizar los tejidos vegetales para el crecimiento en los suelos fueron aislados y sus caldos de cultivo vegetales fueron rociadas individualmente directamente sobre las hojas para poner a prueba su capacidad de controlar Plaga Phytophthora de pimiento causada por Phytophthora capsici. Cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5, una especie no descrita obtenida en este estudio, muestra varias caractersticas deseables de control de enfermedades en la naturaleza, incluyendo alta potencia, larga duracin y la capacidad de controlar tambin la mancha negra de la hoja de col causada por Alternaria brassicicolca. El extracto fue fungicida para P. capsici, pero fungisttico de A. brassicicola. Se mantuvo estable a alta temperatura y pH alto. Sin embargo, despus de la exposicin a pH 2 durante 24 h, el extracto ya no era inhibidor de P. capsici aunque segua siendo fuerte inhibidor de A. brassicicola. Despus del tratamiento con cationes o resinas de intercambio de aniones, el extracto perdido su efecto inhibitorio frente a P. capsici, pero no A. brassicicola. Los resultados sugieren que el extracto contena dos diferentes tipos de metabolitos inhibitorios, uno frente a P. capsici con cargas positivas y negativas en su molcula y otro contra A. brassicicola sin cargas en su molcula. Los metabolitos inhibitorios son solubles en etanol o metanol, pero no en agua, ter o cloroformo. Fueron dializables en la membrana tubular con un peso molecular lmite de 10.000, 1.000 o 500, pero no al 100, indicando que los inhibidores tienen un peso molecular entre 500 y 100. Los resultados tambin mostraron que ambos inhibidores son no proteicos. INTRODUCCION Los fungicidas son ms comnmente utilizados para el control de enfermedades de las plantas causadas por hongos en el campo y en invernadero. Frutas y vegetales son regularmente rociados con fungicidas para satisfacer las demandas del consumidor de productos perfectos. Los fungicidas son tambin comnmente aplicados a los cultivos de granos para aumentar el rendimiento mediante la reduccin de las enfermedades foliares. Sin embargo, el desarrollo de mtodos alternativos de control de enfermedades es necesario debido a la alta preocupacin acerca de los efectos adversos de los plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente. El control biolgico de enfermedades de las plantas con microorganismos es una prometedora alternativa al control qumico. Varios productos comerciales de bio-control de los microorganismos se han desarrollado para el control de enfermedades de plantas causadas por hongos. Sin embargo, el nmero es muy pequeo en comparacin con fungicidas. Un proyecto, por lo tanto, se inicio para probar microorganismos del suelo directamente en hojas de planta de la pimiento con capacidad para controlar el tizn Phytophthora causada por Phytophthora capsici, ya que es una enfermedad devastadora en todo el mundo. Durante las pruebas de deteccin, cultivo lquido de una nueva especie de Streptomyces muestra una fuerte capacidad para controlar el tizn de Phytophthora pimienta. Posteriormente, tambin mostr ser eficaz para el control de de la mancha negra de la hoja de col causada por Alternaria brassicicola, un patgeno importante de aceite de crucferos y las cosechas de hortalizas. Nuestros objetivos fueron: (i) buscar microorganismos del suelo para el control del tizn Phytophthora directamente en plantas de pimiento, (ii) probar el rendimiento de control de enfermedades en las plantas huspedes con metabolitos secundarios producidos por el organismo seleccionado, y (iii) caracterizar a los metabolitos secundarios producidos por los microorganismos seleccionados para el control de enfermedades de las plantas.

MATERIALES Y METODOS El aislamiento de los microorganismos del suelo Las muestras de suelo fueron tomadas a una profundidad de 0-10 cm., tamizada y humedecido con un 65% capacidad de retener agua. El medio selectivo para el aislamiento de hongos consista en 10% extracto del suelo, 0.02% de urea, un 0.1% Tergitol NP-7 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y el 1,5% de agar. Tergitol NP-7 fue para la restriccin del tamao de la colonia de hongos. Despus del autoclave, el medio fue suplementado con 50 ppm de chloramphencol y 50 ppm de sulfato de estreptomicina para la inhibicin de las bacterias y los actinomicetos. El extracto de suelo fue preparado con 100 g suelo tamizado, 0.2 g de CaCO 3 y 1000 ml de agua destilada durante 20 minutos, filtrado el sobrenadante a travs de tres capas de gasa y centrifugado el filtrado a 1500 rpm x g por 5 min. para clarificar el extracto. El medio selectivo para aislamiento de los actinomicetos consisti en 0,02% la urea y el 1.5% de agar. Despus del autoclave, el medio fue ajustado a pH 10,5 con KOH 1N para suprimir las bacterias, y modificado con 50 ppm de nistatina para inhibir hongos. El medio selectivo para el aislamiento de hongos consista en 10% extracto del suelo, 0.02% de urea y 1,5% de agar. Despus del autoclave, el medio fue suplementado con 50 ppm pentacloronitrobenzeno para inhibir actinomicetos y 50 ppm de nistatina para inhibir los hongos. Suspensin de suelo se prepar mezclando 1.3 g de suelo con 100 ml agua destilada estril en una cmara de Omni mezclador a 5000 rpm durante 30 s. Para determinar la dilucin necesaria para obtener la suspensin del suelo esencialmente libre de cada grupo de microorganismos, las suspensiones se diluyeron a 10-4, 10-5 y 10-6 de hongos, 10-5, 10-6 y 10-7 de actinomicetos, y 10-6, 10-7 y 10-8 para las bacterias. Un mililitro de la suspensin de suelo diluida se mezcl con 20 ml de un medio selectivo lquido a 45 C en una placa de Petri. Cinco placas fueron usadas para cada tratamiento. Para mejoramiento del suelo, tomate (Lycopersicon esculentum), espinaca (Spinacia oleracea), batata (Ipomoea batatas), Ipomea (Ipomoea aquatica) y verdolaga (Portulaca oleracea) fueron comprados en el mercado local, y picado en trozos pequeos. Cerca de 500 g de suelo se mezcl con el 4% de cada verdura picada en una botella de 1000 ml, y se incubo a 24 C por lo menos dos semanas antes de su uso. Para aislar los microorganismos capaces de utilizar nutrientes modificados para la multiplicacin, la suspensin de suelo mejorado se diluy a la concentracin pre-determinada para cada grupo de microorganismos como se describi anteriormente y se colocaron en el medio selectivo. Microorganismos con diferente morfologa de las colonias se transfieren individualmente a 10% V-8 agar (10% jugo V-8, 0.02% de CaCO3 y un 2% agar) placas. Cultivo de microorganismos aislados en caldo de vegetales Caldo de vetales fue preparado por trituracin de 4 g de cada una de las verduras picadas y 1% de la melaza en 100 ml de agua en un Ovni mezclador a 4000 rpm durante 3 min, y distribuidos 50 ml de caldo en frascos de 250 -ml. Despus del autoclave, cada frasco fue inoculado con dos asas de la bacteria, o un trozo (de 4 x 5 x 3 mm) de los actinomicetos o el hongo de cultivo de agar. Matraces inoculados se incubaron en un agitador durante dos semanas. Despus de la incubacin, los cultivos fueron centrifugados en un mezclador Omni a 4000 rpm durante 1 minuto antes de ser utilizado para poner a prueba su capacidad para reducir la incidencia de la enfermedad. Preparacin de los inculos Las conidias de Alternaria brassicicola (Schw.) Wiltshire (aislado Aba-31) fueron producidos por el crecimiento del hongo en 10% de agar V-8 (10% V-8 jugo, el 0.02% de CaCO 3 y un 2% agar) a 24 C bajo la luz de 4-6 d. Una suspensin de conidias fue preparada colocando dos trozos cultivo (de 5 x 5 x 3 mm) en 5 ml de agua destilada estril en un tubo de ensayo, y agitando el tubo de

ensayo durante 30 s con un mezclador Vortex. La concentracin de conidias se ajust a 3 conidias / l con un Pipetman microlitro pippet (West Coast Cientfico, Oakland, CA). Phytophthora capsici Leonian (aislado Pc 1-1) fue cultivada en 20% de agar V-8 (20% jugo clarificado de V-8, el 0.02% de CaCO3 y un 2% de agar) en 24 C. El jugo de V-8 se clarifico por centrifugacin a 1500 rpm x g por 5 min. Cinco trozos de cultivo (de 10 x 10 x 3 mm) obtenidos a partir de 3 das de edad, los trozos se colocaron en 7 ml solucin salina (0.24% Ca(NO 3)2, 0.05% KNO3, el 0.1% MgSO4 y 0.05% FeEDTA) en una placa de Petri de 6 - cm. Despus de la incubacin a 24 C bajo la luz durante 24 horas, placa fue trasladada a 4 C durante 20 minutos para inducir la liberacin de zoosporas de esporangios. La suspensin de zoosporas fue pipeteada en un tubo de ensayo y se ajusto a 4 zoosporas / l como se describe anteriormente. Ensayo de cultivos lquidos para control de enfermedades Semillas de pimiento (Capsicum annuun L. cv. California Wonder) y la col (Brassica chinensis L. cv. Ching-verde) se cultivadon en macetas de 8 cm que contiene una mezcla de turba y vermiculita (9:1, v / v). Dos hojas de una planta de 4 semanas de edad fueron rociadas una vez fugaz con el cultivo de un microorganismo de prueba todos los das durante 3 das antes de la inoculacin en el da cuarto. El mtodo de inoculacin descrito por Ko et al. se utiliz en este estudio. Cada hoja de pimiento se inocul con cinco gotas de 2 ml de suspensin de zoosporas de P. capsici a lo largo del borde de la hoja, y unos 10 ml gota de agar fundido que consiste en 1% de agar y 1% de jugo V-8 en 60 C fue agregado a cada gota de inculo para fijar el inculo en el objetivo del sitio. Hojas de col se inocularon de manera similar con conidios de A. brassicicola. Hojas de pimiento y col rociadas con un medio lquido fueron inoculadas con zoosporas de P. capsici y conidios de A. brassicicola, respectivamente, utilizando el mismo mtodo, y utilizados como controles. Las plantas inoculadas fueron colocadas en cmaras hmedas y se mantuvo en el invernadero. El nmero de lesiones que se desarrollan en los sitios inoculados se registr tres das despus de la inoculacin. Dos hojas fueron utilizadas para cada tratamiento, y todos los experimentos se realizaron al menos dos veces. Caracterizacin molecular del organismo TKA-5 cepa se cultiva en 10% de agar V-8 (10% jugo V-8, el 0.02% CaCO3 y un 2% agar) durante 6 das a 24 C. Las esporas y el micelio se rasparon de la superficie de la colonia con un asa de transferencia y para inocular 10 ml de 10% de caldo V-8 en un frasco de 125 ml. Despus de incubacin a 24 C por 6 d, el cultivo se centrifug a 8000 rpm x g durante 10 minutos. El pellet se utilizo para extraer el ADN utilizando el Sistema de extraccin genmica de ADN (Viogene, Taiwan). Amplificacin por PCR de el 16S rDNA y la reaccin de secuenciacin ciclo posterior se llev a cabo utilizando un 16S ADNr MicroSeq Gene Kit (Applied Biosystems, EE.UU.). Los productos fueron analizados con una gentica PRISM 310 analizador (Applied Biosystems). Valores de similitud de homologa bsquedas en la base de datos GenBank se obtuvieron utilizando la BLASTN 02/02/18. Extraccin de los metabolitos de la supresin de patgenos Cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 fue liofilizado. Uno gramo de polvo seco, que se obtiene a partir de aproximadamente 50 ml del cultivo, se extrajo con 25 ml de agua, 95% de etanol, metanol, acetona, ter o cloroformo en un matraz de 250 ml por agitacin en un agitador durante 24 h. La mezcla se centrifuga a 1500 rpm x g por 5 min a obtener extracto clarificado. Para el bioensayo y caracterizacin de los metabolitos de la supresin de patgenos, 10 ml de extracto se evaporaron a 2 ml seguido por la adicin de 2 ml de agua y la evaporacin de 2 ml otra vez. Para poner a prueba la capacidad de los diferentes solventes para extraer las sustancias inhibidoras, 10 veces la dilucin de los extractos se uso. Extracto de etanol se utiliz para estudiar la posibilidad de supresin de la enfermedad, la estabilidad a altas temperaturas y el modo de

inhibicin de las sustancias inhibitorias 2 veces la dilucin de los extractos se uso, para estimar el peso molecular de los inhibidores 5 veces la dilucin de los extractos se uso, y para determinar la efectos del pH, resinas de intercambio inico y carbn activado en el actividad inhibitoria 10 la dilucin de los extractos se uso. Las pruebas de germinacin Para probar el efecto del extracto del cultivo en la germinacin de las esporas, 10 ml de suspensin de conidias (2 x 104 esporas / ml) de A. brassicicola o suspensin de zoosporas (3 x 104 esporas / ml) de P. capsici se mezcl con 10 l de extracto en una cavidad de una cubeta de ocho cavidades estril. Para obtener un alto porcentaje de germinacin de P. capsici, 0.1% de glucosa se aadi a la suspensin de zoosporas antes de mezclarlo con el extracto. Cavidades con las esporas se mantuvieron hmedas, colocando cada una en una en varilla en L de vidrio en una placa Petri de 9 cm que contiene 10 ml agua destilada estril. La germinacin se registr despus de la incubacin a 24 C durante 5 h, y 100 esporas fueron contadas en cada una de las tres repeticiones. Todos los experimentos se realizaron en dos ocasiones. Caracterizacin de los inhibidores Para estudiar los efectos de diferentes tratamientos sobre la propiedad de inhibicin del extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5, 10 g de cada uno de Diaion resinas de intercambio catinico SK1B (equivalente a Amberlite 1R-120), Diaion SA 12A resinas de intercambio aninico (equivalente a Amberlite 1RA-420) (Tai-Young Chemical Co., Kaohsiung, Taiwn), y carbn activado (Sigma-Aldrich) se lavaron con 100 ml de agua destilada tres veces por agitacin durante un perodo de 6 h para eliminar posibles sustancias inhibidoras. Diez mililitros extracto fueron sacudidos con un g de resinas de intercambio catinico, aniones intercambio inico o carbn activado en un matraz de 125 ml en 200 golpes / min durante 24 horas y se filtra a travs de un papel de filtro Whatman no. 1. Los filtrados fueron utilizados para las pruebas de germinacin. Para determinar si los inhibidores eran protenas, 10 ml de extracto se evapora hasta sequedad. Un miligramo del residuo fue procesado a travs de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), siguiendo el protocolo de Sambrook y Russell. Para estimar el peso molecular de la sustancia inhibitoria, 5 ml del extracto fueron colocados en una membrana tubular porosa molecular con un peso molecular de corte de 100, 500, 1.000 o 10.000 (Espectro Medical Industries Inc., Los Angeles, CA), se dializan en 24 C contra 1000 ml de agua destilada cambiado tres veces en un perodo de 24 h, y se utiliza para las pruebas de germinacin. Para determinar si el efecto de los inhibidores es fungisttico o fungicidas, zoosporas de P. capsici o conidias de A. brassicicola en 1 ml del extracto (10 5 esporas / ml) en un tubo centrfugo de 1,5 ml fueron incubados a 24 C. Despus de 4, 8 o 12 h, los inhibidores fueron retirados por centrifugacin de la suspensin de esporas a 1500 rpm x g por 5 min y se reemplaz sobrenadante con la misma cantidad de agua destilada estril. Conidias en 0.1 ml de la suspensin se extendi luego sobre una placa de agar agua al 1,5%. La germinacin se registr despus de incubacin a 24 C durante 24 h. Tres repeticiones se utilizaron para cada tratamiento y todos los experimentos se realizaron dos veces. RESULTADOS Efecto de cultivos lquidos de los microorganismos aislados en incidencia de la enfermedad En este estudio, 27 hongos, 11 bacterias y 8 actinomicetos que fueron capaces de utilizar los tejidos vegetales mixtos para la multiplicacin en los suelos recolectados en dos lugares diferentes fueron aislados. Cuando se roco en las hojas de pimiento, cultivos lquidos de 14 de hongos, 5 bacterias y 6 actinomicetos fueron capaces de reducir la incidencia de enfermedades de

Phytophthora plaga causada por P. capsici de 100% en el control a menos del 50%. Estos cultivos lquidos tambin se redujo la lesin tamao de 30 mm de dimetro en el control a 0-6 mm. Entre estos efectivos, los cultivos de 3 hongos, 2 bacterias y 3 actinomicetos mostraron capacidad constante para reducir la incidencia de la enfermedad. Los cultivos de estos microorganismos fueron capaces de reducir la enfermedad incidencia de 100% en el control a 00-40%, y disminuir el dimetro de la lesin de 30 mm en el control a 0-12 mm (Tabla 1). Entre estos, el cultivo de la cepa de Streptomyces TKA-5 fue capaz de evitar el desarrollo de la enfermedad por completo en repeticin de las pruebas. Esta cepa fue, por lo tanto, seleccionada para el estudio adicional.
Tabla1. Efecto de ocho cultivos lquidos de los microorganismos del suelo del primer aislamiento y su incidencia de la enfermedad del tizn de pimiento Phytophthora causada por Phytophthora capsic

Dos hojas, una vez fueron rociadas con un cultivo lquido al da durante 3 das antes de la inoculacin en el 4 da. Cada hoja se inocul con cinco gotas de 2 ml de la suspensin de zoosporas de P. capsici lo largo del borde de la hoja y 10 ml de agar fundido se aadi a cada gota de inculo para fijar el inculo en el sitio de destino. La incidencia de la enfermedad y el tamao de la lesin se registraron despus de 3 das.

La enfermedad de rendimiento de control de cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 Para probar el control potencial de la enfermedad, el cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 se diluy 2 -, 5 -, 10 -, 50 - y 100 veces antes de ser fumigado en las hojas de pimiento. Los resultados mostraron que incluso en 50 veces la dilucin, el cultivo fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad del tizn Phytophthora del 100% en el control a 60%, y disminuir el dimetro de la lesin de 30 mm en el control a 18 mm. Para determinar el efecto de la frecuencia de spray sobre la enfermedad la efectividad del control, las hojas de pimiento fueron rociados una vez al da con cultivo lquido para tiempos de 1, 2 o 3 antes de la inoculacin en el cuarto da. La incidencia de la enfermedad disminuy con el aumento del nmero de spray (Tabla 2). Aun cuando la hojas de pimiento fueron rociados slo una vez, la incidencia de la enfermedad se redujo de 100% en el control a 40% y el dimetro de la lesin se redujo de 30 mm en el control de hasta 12 mm.

Tabla 2. Efecto de la frecuencia de aspersin de cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 en la incidencia de la enfermedad del tizn Phytophthora de pimiento causada por Phytophthora capsici

Dos hojas, una vez fueron rociados con el cultivo lquido al da durante tiempos de 1, 2 o 3 dias antes de la inoculacin en el da cuarto. Cada hoja se inocul con cinco gotas de 2 ml de zoosporas suspensin de P. capsici en el borde de la hoja y 10 ml de agar fundido se adiciono a cada gota de inculo para fijar el inculo en el sitio de destino. La incidencia de la enfermedad y el tamao de la lesin se registraron despus de 3 das.

Durabilidad de la actividad de supresin de la enfermedad de cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 se determin mediante la inoculacin de las hojas de pimiento 1, 7, 14, 21 o 28 das despus de la ltima rociada de cultivo lquido. Los resultados mostraron que incluso despus de 28 das en las hojas, las sustancias supresoras de la enfermedad en el cultivo lquido son capaces de reducir la incidencia de la enfermedad del tizn Phytophthora del 100% en el control a 10%, y la disminucin de la lesin dimetro de 30 mm en el control a 3 mm (Tabla 3). Cuando rosearon las hojas de col, el cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 tambin fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad de La mancha negro causado por A. brassicicola de 100% en el control a 5% y disminuir el dimetro de la lesin de 30 mm a 12 mm.
Tabla 3. Eficacia de cultivo lquido de Streptomyces cepa TKA-5 rociado en las hojas a diferentes perodos de tiempo en la reduccin de la Incidencia de la enfermedad del tizn Phytophthora del pimiento causada por Phytophthora capsici

Dos hojas, una vez fueron rociadas con el cultivo lquido al da durante 3 das antes de la inoculacin 1, 7, 14, 21 o 28 das despus de la ltima aspersin. Cada hoja se inocul con cinco gotas de 2 ml de zoosporas suspensin de P. capsici en el borde de la hoja y 10 ml de lquido agar se aadieron a cada gota de inculo para fijar el inculo en el sitio de destino. La incidencia de la enfermedad y el tamao de la lesin se registraron despus de 3 das.

Caracterizacin de bio-control de organismo En comparacin con las secuencias disponibles en GenBank, la secuencia parcial 16 S ADNr (476 nucletidos) de la cepa de Streptomyces TKA-5 (No GenBank. EU340346) mostraron la mayor similitud (98%) de Streptomyces fragilis. El organismo tambin fue enviado a la identificacin Servicio, DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania,

para su identificacin. El informe de identificacin indica que el 16 S ADNr secuencia de la cepa TKA-5 mostraron la mayor similitud (98,3%) a S. fragilis. Sobre la base de su experiencia, para la asignacin de un Streptomyces desconocido a una especie conocida, la similitud debe estar por encima del 99,4%. Los estudios comparativos de los patrones de Riboprint no mostraron una alta correlacin entre la cepa TKA-5 y otros miembros del gnero Streptomyces. El informe concluy que todos los mtodos utilizados no permite identificar la cepa TKA-5 con una de las especies descritas en del gnero Streptomyces. Descripcin TKA-5 como una nueva especie de Streptomyces se llevar a cabo en el futuro. Un cultivo de esta cepa fue depositado en la Coleccin Cultura y Centro de Investigacin, Industria Alimentaria Instituto de Investigacin y Desarrollo, Hsinchu, Taiwn, con el nmero de acceso del Centro Regional 16884. Aislamiento de los metabolitos de la enfermedad de la represin secundaria Para el estudio de la naturaleza de los metabolitos supresores de la enfermedad, la sustancias inhibidoras fueron aislados por liofilizacin del cultivo lquido de la cepa de Streptomyces TKA-5 y extrayendo el polvo seco con etanol. El extracto fue reexaminado para asegurar que las sustancias inhibitorias estaban todava presentes despus de que el proceso de aislamiento. Los resultados mostraron que el extracto del polvo todava era capaz de controlar enfermedades de las plantas. Rociar las hojas de pimiento y col con el extracto redujo la incidencia de las enfermedades de Phytophthora tizn y mancha foliar negro de 100% en el control al 20% y 15%, respectivamente. Prueba de germinacin de las esporas se utiliz en el estudio posterior, ya que es ms fcil y ms rpido que la prueba de la incidencia de enfermedades. Liofilizado seco en polvo de cepa TKA-5 el cultivo se extrajo con diferentes disolventes orgnicos. Despus de la evaporacin de solventes, los extractos probaron su capacidad para apoyar a la germinacin de esporas de P. capsici y A. brassicicola. Extracto en etanol o metanol inhibi completamente la germinacin de P. capsici zoosporas y A. brassicicola conidios. Sin embargo, su germinacin no fue inhibida o ligeramente inhibida por los extractos de agua, acetona, ter o cloroformo (Tabla 4).
Tabla 4. Eficacia de solventes para extraer las sustancias inhibidoras de Cultivo liofilizado de Streptomyces cepa TKA-5 para suprimir la germinacin de zoosporas de Phytophthora capsici y Conidias de Alternaria brassicicola.

Caracterizacin de los metabolitos secundarios supresores de la enfermedad La exposicin de zoosporas de P. capsici en el extracto de 4, 8 o 12 horas, destruy por completo su capacidad de germinar incluso en agar agua, lo que indica la naturaleza fungicida de los metabolitos supresores de la enfermedad (Tabla 5). Sin embargo, la exposicin de conidios de A.

brassicicola al extracto por los mismos perodos de tiempo no afect a su capacidad de germinar, lo que indica la naturaleza fungisttica de los metabolitos supresores de la enfermedad contra este hongo. Las esporas de ambos patgenos todava no germinaron despus de que el extracto se calent a 100 C, o en autoclave durante 20 minutos (datos no mostrados).
Tabla 5. Capacidad de zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola para germinar despus de la exposicin al extracto de cultivo Streptomyces cepa TKA-5 durante diversos perodos de tiempo.

Cuando el pH del extracto se ajust a partir de la original de 4 a 5 con KOH 1N, germinacin de las esporas de los agentes patgenos todava inhibi por completo o casi completo (Tabla 6). Cuando el pH del extracto se ajust a 6, la germinacin de P. capsici zoosporas y brassicicola A. aument al 16% y 57%, respectivamente. A pH 8.7, la germinacin de esporas en el extracto se increment del original del 0% al 55-66% y 57-68% para P. capsici y A. brassicicola, respectivamente. Ajustar el pH de nuevo a la original de 4, con HCl 1N slo aumento parcialmente el efecto del inhibidor.
Tabla 6. La germinacin de zoosporas Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 ajustados al valor de pH.

Valor entre parntesis es la tasa de germinacin en el extracto despus de reajuste del valor de pH de 4.

La exposicin del extracto a pH 2 durante 24 h destruy el efecto inhibidor frente a P. capsici, pero no afect a su efecto inhibidor contra A. brassicicola (Tabla 7). La exposicin del extracto a pH 12 durante 24 horas no afect a su efecto inhibidor frente a cualquier organismo.

Tabla 7. La germinacin de zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 ajustando el valor de pH de 2 a 12 durante 24 horas antes de ser ajustado al original pH de 4.

El extracto se convirti en no-inhibidores o slo ligeramente inhibitoria para la germinacin de zoosporas de P. capsici despus del tratamiento con cationes intercambio inico, resinas de intercambio aninico o carbn activado (Tabla 8). Sin embargo, el efecto inhibidor del extracto contra germinacin de los conidios de A. brassicicola fue eliminada slo despus de tratamiento con carbn activado, pero no con intercambio de cationes Las resinas o resinas de intercambio de aniones. No se observaron bandas positivas despus de SDS-PAGE del extracto de inhibidor que indica que la Los inhibidores no son protenas.
Tabla 8. Efectos de diferentes tratamientos en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 en su actividad inhibidora contra la germinacin de las zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola.

El pH se ajust a 4,0 antes de las pruebas de germinacin de esporas.

El extracto en la tubera de dilisis con peso molecular de 10.000, 1.000 o 500 fue o no inhibitorio o redujo su efecto inhibitorio seguido del tratamiento con dilisis (Tabla 9). Sin embargo, el extracto fue todava fuertemente inhibitorio de germinacin de las esporas de los agentes patgenos despus del tratamiento en la tubera de dialisis con un peso molecular de corte de 100.

Tabla 9. La germinacin de zoosporas Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 despus del tratamiento de microdialisis con un peso molecular limite.

DISCUSIN En este estudio, los microorganismos capaces de utilizar verduras tejidos para el desarrollo en el suelo fueron aislados y su caldo de verduras cultivos fueron rociadas individualmente directamente sobre las hojas para poner a prueba sus capacidad para controlar el tizn Phytophthora del pimiento. Resultados demostr que este enfoque es muy eficaz en la obtencin de microorganismos con la capacidad para controlar la enfermedad. Entre los 46 microorganismos aislado de dos suelos, un 50% de ellos fueron capaces de para reducir la incidencia de la enfermedad del 100% en el control al menos del 50%. El mtodo es directo y eficaz y debe ser aplicable a aislamiento de microorganismos para el control de otros enfermedades de las plantas. Cultivo lquido de tensin TKA-5, una nueva especie de Streptomyces, obtenidos en este estudio se muestra el control de varias enfermedades deseable caractersticas de la naturaleza. La cultura segua siendo eficaz en el control Phytophthora plaga del pimiento despus de ser diluido 50 veces, y fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad ms del 50% cuando se roca una sola vez a las hojas. Por otra parte, despus de ser aplicado, los metabolitos enfermedad supresin secundaria de la cultura se mantuvo activo en las hojas durante 28 das, el el ms largo perodo de prueba. Tambin fue eficaz para el control de negro mancha de la hoja de col cuchara. Estos resultados sugieren que la enfermedad suppressionmetabolites producido por Streptomyces cepa TKA-5 es adecuadas para el desarrollo en un producto comercial para el control de de enfermedades de las plantas. Los resultados del estudio fromthis sugieren que el extracto cultivo de Streptomyces strainTKA-5 probablemente contena dos tipos diferentes de enfermedad supresin secundaria metabolitos, uno frente a P. capsici y la otros en contra de A. brassicicola. El primero es un organismo parecido a un hongo estrechamente relacionada con las algas marrones [21], mientras que el segundo es un hongo verdadero. El extracto de la cultura se fungicida a P. capsici, pero fungisttica a A. brassicicola.Afterexposure topH2 durante 24 h, el extractwasnolonger inhibitoria de P. capsici, pero se mantuvo fuerte inhibidor de A. brassicicola. Adems, las pruebas de resina de intercambio inico sugieren que en el extracto, el inhibidor de la sustancia P. capsici tiene efectos positivos y cargas negativas en itsmolecule, mientras que no se cobre presente en el molcula de la sustancia inhibitoria de A. brassicicola. Siguiente dilisis, el extracto de la corte de dilisis withmolecularweight tubera de 10.000, 1.000, o sea 500was no inhibidora o con la reduccin de efecto inhibitorio. Sin embargo, el extracto fue todava fuertemente inhibitoria de germinacin de las esporas de los agentes patgenos, lo que indica que ambas Los inhibidores

de peso molecular entre 500 y 100, SDS-PAGE de la sustancia inhibidora sugiere que no son protenas.

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