1 Informe de trabajo de Laboratorio Reduccin de la turbidez causada por la concentracin de NaCl y la molaridad de buffer en el ensayo turbidimtrico por Di-Ferrante

1. Antecedentes El mtodo turbidimtrico descrito en este informe se basa en la formacin de complejos relativamente insolubles entre una solucin con cido hialurnico (mucopolisacrido cido) y el BCTA (bromuro cetil trimetil amonio). Como sabemos el reactivo BCTA detiene la reaccin enzimtica y produce la turbiedad, al mismo tiempo. Se ha encontrado que la cantidad de la turbidez que se desarroll cuando el BCTA (bromuro de cetil trimetil amonio) se agrega a una solucin con acido hialurnico proporcional a la cantidad de cido hialurnico en el sistema. En las pruebas como por ejemplo en la determinacin actividad de la hialuronidasa puede darse resultados alterados ya que se podra estar observando una falsa reduccin de la turbidez luego de agregar el BCTA, por ende en este trabajo evaluaremos principalmente a NaCl a diferentes concentraciones as como las variaciones en la molaridad del buffer. 2. Materiales y Mtodos 2.1. Materiales Acido Hialurnico a una concentracin de 0.5 mg/ml. Buffer Acetato de Amonio a 0.05 M, pH 5.0 BCTA (Bromuro cetil trimetil amonio) al 2.5% con NaOH al 2%. Espectrofotmetro UV/luz visible Shimadzu.

2.2. Mtodos 2.2.1. Determinacin de la actividad enzimtica La actividad Hialuronidasa se determin por el mtodo turbidimtrico de DiFerrante, (1956). Para esta prueba se utilizara 0.2mL de Acido hialuronico a una concentracin de 0.5mg/mL diluido en buffer acetato de amonio pH 5.0 0.05M con NaCl 0.15M; 0.2mL de buffer de reaccin. Agregando 0.1mL de muestra con veneno a 1mg/mL e inmediatamente incubando a 37C en bao mara por 15 minutos. La reaccin se detendr con 2mL de BCTA (Bromuro Cetil Trimetil Amonio) al 2.5% en NaOH 2%, midindose la absorbancia a 400nm con un volumen final de cada tubo de ensayo de 2.5mL. 2.2.2. Ensayo para la determinacin del efecto de la concentracin de NaCl en la turbidez. El ensayo se determin por el mtodo turbidimtrico de Di-Ferrante, (1956). Para esta prueba se modific: En lugar de muestra y buffer de reaccin se agrego 0.3 ml buffer acetato de amonio pH 5.0 a 0.05M con molaridades de NaCl 0.15, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 y 1.5 M para posteriormente evaluar el efecto del NaCl.

2.2.3. Ensayo para la determinacin del efecto de la molaridad del Buffer de reaccin en la turbidez. El ensayo se determin por el mtodo turbidimtrico de Di-Ferrante, (1956). Para esta prueba se modific: despus de agregar el acido hialuronico se agrego 0.1 ml de buffer de reaccin acetato de amonio 0.05 M pH 5.0 y, en lugar de muestra se agrego 0.2 ml buffer acetato de amonio pH 5 a 0.05M con la siguientes molaridades: 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 y 1.5 M para posteriormente evaluar el efecto del la molaridad del buffer en la cual estara contenida la enzima 3. Resultados El aumento de la concentracin de sales (NaCl) afecta la turbidez reducindola (ver grafica 1.) Fig. 1 Variacin de la turbidez respecto a la molaridad de NaCl. En el eje y, el porcentaje de turbidez (%), en el eje x tenemos la molaridad de las concentraciones de NaCl (desde 0.3 M a 1.5 M). Observndose que a partir de la concentracin a 0.5 M se obtiene ms del 10 % de la reduccin de la actividad. A partir del 0.5 M de NaCl la reduccin de la turbidez es superior al 10% llegando al mximo de 43% a una molaridad del 1.5 M de NaCl. Fig.2: Reduccin de la turbidez por cambio en la molaridad del buffer. En el eje y est el porcentaje de turbidez (%), y en el eje x tenemos la molaridad del buffer (desde 0.2 M a 1.5 M). Observndose que a partir de 1.0 M ya no disminuye la turbidez. 4. Discusin En estos resultados encontrados llegamos a tener un indicio que la molaridad y la concentracin NaCl afectaron y redujeron el grado de turbidez cuando se le adicion BCTA, pero todava debemos analizar otros factores que puedan estar involucrados en esta reduccin de la turbidez como dar mayor tiempo de incubacin y por ultimo observar si hay variaciones en el pH.