BAM: Enumeracin de Escherichia coli y bacterias coliformes

Septiembre 2002

Manual de anlisis bacteriolgicos Captulo 4 La enumeracin de Escherichia coli y bacterias coliformes

Autores: Peter Feng , Stephen D. Weagant, Michael A. Grant

Contenido del captulo

y y y y y y y

Mtodo convencional para la determinacin de coliformes y E. coli LST-MUG mtodo de deteccin de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados exclusivo de los moluscos bivalvos Agua embotellada El examen de carne de mariscos y moluscos Anlisis de E. coli en los zumos de ctricos Otros mtodos para la enumeracin de coliformes y E. coli Referencias
Escherichia coli , originalmente conocida como bacteria Escherichia comuna, fue identificado en 1885 por el pediatra alemn, Theodor Escherich ( 14 , 29 ). E. coli se encuentra ampliamente distribuido en el intestino de los seres humanos y animales de sangre caliente y es el principal anaerobio facultativo en el intestino y parte de la flora intestinal esencial que mantiene la fisiologa del husped sano ( 9 , 29 ).E. coli es un miembro de la familia Enterobacteriaceae ( 15 ), que incluye muchos gneros, incluyendo patgenos conocidos, tales como Salmonella , Shigella y Yersinia . Aunque la mayora de las cepas de E.coli no son considerados como patgenos, que pueden ser patgenos oportunistas que causan infecciones en huspedes inmunocomprometidos. Tambin hay cepas patgenas de E. coli que cuando se ingiere, causa enfermedades gastrointestinales en los seres humanos sanos (vase el Cap. 4A). En 1892, Shardinger propuso el uso de E. coli como indicador de contaminacin fecal. Esto se bas en la premisa de que E. coli es abundante en las heces humanas y animales y que no se encuentra en otros nichos. Adems, dado que E. coli pueden ser detectadas fcilmente por su capacidad de fermentar la glucosa (ms tarde cambiado a la lactosa), que era ms fcil de aislar que los conocidos patgenos gastrointestinales. Por lo tanto, la presencia de E. coli en los alimentos o el agua lleg a ser aceptada como un indica dor de contaminacin fecal reciente y la posible presencia de patgenos franca. Aunque el concepto del uso de E. coli como un indicador indirecto de riesgo para la salud era buena, era muy complicado en la prctica, debido a la presencia de otras bacterias entricas comoCitrobacter , Klebsiella y Enterobacter que tambin pueden fermentar la lactosa y son similares a E. colien las caractersticas fenotpicas, de manera que no se distinguen fcilmente. Como resultado, el trmino "coliformes" fue acuado para describir este grupo de bacterias entricas. Coliformes no es una clasificacin taxonmica, sino ms bien una definicin de trabajo se utiliza para describir un grupo de bacterias Gram -negativas, anaerobios facultativos en forma de barra de las bacterias que fermentan la lactosa para producir cido y gas dentro de las 48 horas a 35 C. En 1914, el Servicio de Salud Pblica de EE.UU. aprob el recuento de coliformes como un estndar ms conveniente de importancia sanitaria. A pesar de coliformes eran fciles de detectar, su asociacin con la contaminacin fecal es cuestionable debido a que algunas bacterias coliformes se encuentran naturalmente en las muestras del medio ambiente ( 6 ). Esto llev a la introduccin de la coliformes fecales como indicador de contaminacin. Coliformes fecales, que defini por primera vez sobre la base de las obras de Eijkman (12 ) es un subconjunto de coliformes totales, que crece y fermenta la lactosa a temperatura de incubacin elevado, por lo tanto, tambin conocida como coliformes fecales. Fecal coliforme anlisis se realizan a 45,5 C para el anlisis de alimentos, a excepcin de los anlisis de agua, los mariscos y los crustceos de agua de la cosecha, que utilizan 44,5 C ( 1 , 3 , 30 ). El grupo coliforme fecal est compuesta principalmente por E. coli entricas, pero algunos otros como Klebsiella tambin pueden fermentar la lactosa a estas temperaturas y por lo tanto, ser considerada como coliformes fecales. La inclusin de Klebsiella spp en la definicin de trabajo de coliformes fecales disminuy la correlacin de este grupo con la contaminacin fecal. Como resultado,

los E. coli ha resurgido como un indicador, en parte facilitado por la introduccin de nuevos mtodos que pueden identificar rpidamente E. coli. En la actualidad, todos los tres grupos se utilizan como indicadores, pero en diferentes aplicaciones.Deteccin de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria del agua o como un indicador general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de alimentos. Coliformes fecales siendo el indicador estndar de eleccin para las aguas de recoleccin de mariscos y moluscos, y E. coli se utiliza para indicar la contaminacin fecal reciente o procesamiento insalubres. Casi todos los mtodos utilizados para detectar E. coli , coliformes totales o coliformes fecales son los mtodos de enumeracin que se basan en la fermentacin de la lactosa ( 4 ). Del Nmero Ms Probable (NMP) es una estadstica, de varios pasos de ensayo que consiste en las fases de presuncin, confirmada y completada. En el ensayo de diluciones seriadas de una muestra se inoculan en los medios de comunicacin caldo. Los analistas anotar el nmero de gas positivo (fermentacin de la lactosa) tubos, de la cual las otras 2 fases del ensayo se realiz a continuacin, utiliza las combinaciones de resultados positivos para consultar a un cuadros estadsticos (Anexo 2), para estimar el nmero de microorganismos presentes . Normalmente, slo los primeros dos fases se llevan a cabo en coliformes fecales y anlisis de coliformes, mientras que las 3 fases se realizan por E. coli . La prueba de MPN de 3 tubos se utiliza para probar la mayora de los alimentos. El MPN de 5 tubos se utiliza para el agua, los mariscos y las pruebas de cosecha de moluscos de agua y tambin hay un mtodo NMP -10 tubo que se utiliza para probar el agua embotellada o muestras que no se espera que estn muy contaminadas (3 ). Tambin hay un mtodo de recubrimiento medio slido para los coliformes que utiliza Agar Violeta Rojo Bilis, que contiene indicadores de pH neutro de color rojo, por lo que los resultados de la lactosa fermentacin en la formacin de colonias de color rosa. Tambin hay pruebas de filtracin de membrana para coliformes y coliformes fecales, que la formacin de aldehdos medida debido a la fermentacin de la lactosa. Este captulo tambin incluye las variaciones de las pruebas anteriores que utilizan sustratos fluorognicos para detectar E. coli ( 18 ), pruebas especiales para el anlisis de los mariscos, una breve consideracin de las pruebas de agua embotellada y un mtodo para probar grandes cantidades de zumos de ctricos de la presencia de E. coli , junto con la regla de jugo de HACCP.

I. Mtodo convencional de coliformes, coliformes fecales y E. coli

A. Equipos y materiales 1. Cubiertos bao de agua, con sistema de circulacin para mantener la temperatura de 45,5 0,2 C. Nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos. 2. Inmersin de tipo termmetro, 1-55 C, a unos 55 cm de largo, con 0,1 C subdivisiones, certificada por el Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST), o equivalente 3. Incubadora, 35 1,0 C 4. Equilibrio con la capacidad de > 2 kg y sensibilidad de 0,1 g 5. Licuadora y batidora frasco ( ver Captulo 1) 6. Estril pipetas graduadas, 1.0 y 10.0 mL 7. Utensilios estriles para la manipulacin de la muestra ( ver Captulo 1) 8. Botellas de dilucin de vidrio de borosilicato, con tapn de rosca de polietileno equipadas con cubiertas de Tefln. Preparados comercialmente botellas de dilucin con tampn fosfato estril Butterfield tambin se puede utilizar. 9. Quebec contador de colonias, o equivalente, con lente de aum ento 10. La luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W. 11. pH metro B. Los medios de comunicacin y Reactivos Verde brillante bilis lactosa (BGLB) de caldo, 2% ( M25 ) Lauril triptosa (LST) de caldo ( M76 ) CE caldo ( M49 ) Eosina-azul de metileno de Levine (L-EMB) agar ( M80 ) Triptona (triptfano) de caldo ( M164 ) MR-VP caldo ( M104 ) Koser caldo de citrato ( M72 ) Placa de agar recuento (PCA) (mtodos estndar) ( M124 ) Tampn fosfato Butterfield agua ( R11 ) o diluyente equivalente (a excepcin de los mariscos) Reactivo de Kovacs ( R38 ) Voges-Proskauer (VP) reactivos ( R89 ) Reactivos de tincin de Gram ( R32 )

Indicador rojo de metilo ( R44 ) Agar bilis rojo violeta (Vrba) ( M174 ) VRBA-MUG agar ( M175 ) EC-MUG medio ( M50 ) Lauril triptosa MUG (LST-MUG) de caldo ( M77 ) Diluyente de peptona al 0,1% ( R56 ) C. MPN - prueba presuntiva de coliformes, coliformes fecales y E. coli Pesar 50 g de alimentos en el estril de alta velocidad vaso de la licuadora. (Vase el captulo 1 y los actuales programas de cumplimiento de la FDA para obtener instrucciones sobre la composicin y tamao de la muestra) Las muestras congeladas pueden ser suavizadas mediante el almacenamiento de < 18 horas a 2-5 C, pero no se descongelen. Aadir 450 ml de tampn fosfato Butterfield de agua y se mezcla durante 2 min. Si <50 g de la muestra estn disponibles, pese porcin que equivale a la mitad de la muestra y aadir un volumen suficiente de diluyente estril para realizar una dilucin 1:10. El volumen total en el vaso de la licuadora debe cubrir completamente las hojas. Preparar diluciones decimales con diluyente estril de fosfato de Butterfield. Nmero de diluciones que estar preparado depende de la densidad de coliformes anticipado. Temblar a todas las suspensiones de 25 veces en el arco de 30 cm o Agitar la mezcla durante 7 s. No utilizar pipetas para ofrecer <10% de su volumen total. La transferencia de porciones de 1 ml a 3 tubos LST para cada dilucin de al menos 3 diluciones consecutivas. Mantenga la pipeta en un ngulo de modo que su borde inferior se apoya contra el tubo. Vamos pipeta de drenaje 2.3 s.No ms de 15 minutos deben transcurrir del tiempo se mezcla la muestra hasta que todas las diluciones son inoculadas en medios adecuados. NOTA: El uso de 5 tubos MPN para el anlisis de las aguas de recoleccin de mariscos y crustceos. Incubar los tubos LST a 35 C. Examinar los tubos y las reacciones de registro a 24 2 h de gas, es decir, el desplazamiento de medio en el vial de fermentacin o efervescencia cuando los tubos se agita suavemente. Volver a incubar los tubos de gas-negativos durante 24 h, y examinar y registrar las reacciones de nuevo a las 48 2 h. Realizar la prueba confirmada en todos los supuestamente positivas (gas) tubos. D. MPN - la prueba de coliformes confirmados De cada tubo LST gas, la transferencia de un asa de suspensin a un tubo de caldo BGLB, evitando la pelcula si est presente. Incubar los tubos BGLB a 35 C y examinar la produccin de gas a 48 2 h. Calcular el nmero ms probable (NMP) (ver Anexo 2) de coliformes basado en la proporcin de confirmarse gas tubos LST de tres diluciones consecutivas. E. MPN - prueba confirmada de coliformes fecales y E. coli De cada tubo de gas LST la prueba presuntiva, la transferencia de un asa de cada suspensin a un tubo de caldo EC (un palo estril aplicador de madera tambin puede ser utilizado para estas transferencias). Incubar los tubos de la CE de 24 2 horas a 45,5 C y examinar la produccin de gas. Si es negativo, reincubate y examinar de nuevo a las 48 2 h. Usar los resultados de esta prueba para el clculo de las heces fecales MPN. Para continuar con la E. coli anlisis, proceder a la seccin F infra. La CE caldo mtodo NMP se puede utilizar para agua de mar y mariscos, ya que se ajusta a los procedimientos recomendados ( 1 ). (Atencin: ver nota siguiente). NOTA: Fecal anlisis de coliformes se realizan a 45,5 0,2 C para todos los alimentos, a excepcin de las pruebas de agua y en los moluscos y crustceos de la cosecha de anlisis de agua, que utiliza una temperatura de incubacin de 44,5 0,2 C. F. MPN - ensayo se realiza para E. coli . Para realizar el ensayo se realiza para E. coli , agitar suavemente cada tubo de gas CE y raya para el aislamiento, un asa para un L-EMB placa de agar y se incuban durante 18-24 horas a 35 C. Examinar las placas para sospechar E. coli colonias, es decir, oscura centrada y plana, con o sin brillo metlico. De transferencia de hasta cinco colonias sospechosas de cada placa L-EMB a sesgos PCA se incuba durante 18-24 horas a 35 C y utilizar para su anlisis posterior. NOTA: La identificacin de cualquier una de las cinco colonias como E. coli es suficiente para considerar que el tubo de la CE como positivo, por lo que no todos los 5 aislados posible que tenga que hacerse la prueba. Realizar la tincin de Gram. Todas las culturas aparecen como Gram-negativas, bacilos cortos deben ser probados para las reacciones IMViC abajo y tambin re-inoculadas de nuevo en LST para confirmar la produccin de gas.

La produccin de indol . Inocular tubos de caldo triptona e incubar 24 2 horas a 35 C. Prueba de indol mediante la adicin de 0,2-0,3 ml de reactivo de Kovacs. Aparicin de distinto color rojo en la capa superior es positivo. Voges-Proskauer (VP)-compuestos reactivos . Inocular tubos de caldo MR-VP e incubar 48 2 horas a 35 C. Transferir 1 ml a 13 mm x tubo de 100. Aadir 0,6 ml solucin -naftol y 0,2 ml de KOH 40% y agitar. Aadir unos cristales de creatina. Agitar y dejar reposar 2 h. Prueba es positiva si eosina color rosado se desarrolla. Rojo de metilo-compuestos reactivos . Despus de la prueba VP, incuba MR-VP tubo adicional de 48 2 horas a 35 C. Aadir 5 gotas de solucin de rojo de metilo a cada tubo. Caracterstico color rojo es positivo. El amarillo es la reaccin negativa. Citrato . Ligeramente inocular tubos de caldo de citrato de Koser; evitar la turbidez detectable.Incubar durante 96 horas a 35 C. El desarrollo de la turbidez es distinta reaccin positiva. De gas de la lactosa . Inocular un tubo de LST e incubar 48 2 horas a 35 C. La produccin de gas (desplazamiento del medio de vial interior) o la efervescencia despus de una ligera agitacin es una reaccin positiva. Interpretacin: Todas las culturas que (a) fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 horas a 35 C, (b) aparecen como bacilos Gram -negativos nonsporeforming y (c) dar a los patrones de IMViC + + - (biotipo 1) o - + - (biotipo 2) se considera que E. coli . Calcular MPN (ver Anexo 2) de E. coli basados en la proporcin de la CE los tubos en tres diluciones sucesivas que contienen E. coli . NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba IMViC, use API20E o el ensayo automatizado VITEK bioqumicas para identificar el organismo como E. coli . Use el crecimiento de la PCA se inclina y llevar a cabo estos ensayos como se describe por el fabricante. G. Mtodo de medio slido - Coliformes Preparar Agar Bilis Rojo Violeta (Vrba) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enfriar a 48 C antes de su uso. Preparar, homogeneizar y diluir la muestra forma decimal como se describe en la seccin I. C por encima de lo que las colonias aisladas se obtiene cuando se siembran. Transferencia de dos alcuotas de 1 ml de cada dilucin a placas de Petri, y el uso de cualquiera de los siguientes dos mtodos verter placas, dependiendo de si las clulas daadas o estresadas se sospecha la presencia de ( 1 ). Vierta 10 mL VRBA templada a 48 C en placas, placas de remolino para mezclar, y dejar que se solidifique. Para prevenir el crecimiento de la superficie y la difusin de las colonias, superposicin con 5 ml VRBA, y dejar que se solidifique. Si la reanimacin es necesario, vierta una capa basal de 80-10 ml de agar de soja trptico templada a 48 C. Placas de remolino para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 0,5 h. Luego de superposicin con 8-10 ml de fundido, se enfra y deja solidificar VRBA. Invertir las placas e incubar solidificado 18-24 horas a 35 C. Incubar los productos lcteos a 32 C ( 2 ). Examinar las placas bajo lupa y con iluminacin. Contador de colonias de color rojo prpura que son de 0,5 mm o ms de dimetro y rode ado por la zona de los cidos biliares precipitado. Las placas deben tener colonias 25-250. Para confirmar que las colonias son los coliformes, escoger por lo menos 10 colonias y traslado a cada uno un tubo de caldo BGLB.Incubar los tubos a 35 C. Examine a las 24 y 48 h para la produccin de gas. NOTA: Si el gas-positivos tubo BGLB muestra una pelcula, lleve a cabo la tincin de Gram para garantizar que la produccin de gas no se debe a bacterias Gram -positivas, fermentan la lactosa bacilos. Determinar el nmero de coliformes por gramo multiplicando el nmero de colonias sospechosas por ciento confirmado en BGLB por el factor de dilucin. Por otra parte, E. coli colonias se pueden distinguir entre las colonias de coliformes en VRBA mediante la adicin de 100 mg de 4-metil- -umbeliferil-D-glucurnido (MUG) por ml en la superposicin VRBA. Despus de la incubacin, observar la fluorescencia azulada alrededor de las colonias bajo la luz de onda larga UV. (Ver LST-MUG la seccin II de la teora y la aplicacin.) H. La filtracin de membrana (MF) Mtodo - coliformes: vase la seccin III. El agua embotellada. NOTA: homogeneizados de alimentos fcilmente obstruir los filtros, por lo tanto, MF son los ms adecuados para el anlisis de muestras de agua, sin embargo MF puede ser , utilizado en el anlisis de los alimentos lquidos que no contengan altos niveles de material particulado.

II. LST-MUG mtodo de deteccin de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados exclusivo de los moluscos bivalvos
El ensayo LST-MUG est basada en la actividad enzimtica de la -glucuronidasa (GUD), que penetra en el substrato de 4 metilumbeliferil -D-glucurnido (MUG), para liberar 4metilumbeliferona (MU).Cuando se expone a onda larga (365 nm) la luz ultravioleta, MU presenta una fluorescencia azulada que se ve fcilmente en el medio o alrededor de las colonias. Ms del 95% de los E. coli produce GUD, incluyendo anaerogenic (no productoras de gas) de las cepas. Una excepcin es enterohemorrgica E.coli (EHEC) del serotipo O157: H7, que es constante SUG negativos ( 11 , 17 ). La falta de fenotipo SUG en O157: H7 se utiliza a menudo para diferenciar este serotipo de otras E. coli , aunque SUG variantes positivas de O157: H7 no existen ( 24 , 26 ). La produccin del SUG, por otros miembros de la familia Enterobacteriaceae es raro, a excepcin de algunos Shigella (44 -58%) y Salmonella (20-29%) ( 18 , 27 ). Sin embargo, la deteccin accidental de estos patgenos por SUG basado en los anlisis no se considera un inconveniente desde el punto de vista de salud pblica. Expresin de la actividad SUG se ve afectado por la represin catablica ( 8 ) para que, en ocasiones, algunos E. coli son SUG-negativas, a pesar de que llevan el uid de un gen ( Gus A) que codifica para la enzima ( 19 ). En la mayora de los anlisis sin embargo, alrededor del 96% de los E. coli cepas analizadas son SUG-positivos sin la necesidad de que la induccin de enzimas ( 27 ). MUG pueden ser incorporados en casi cualquier medio para su uso en la deteccin de E. coli . Sin embargo, algunos medios de comunicacin, como organismo electoral, que contienen compuestos fluorescentes, no son adecuados, ya que la mscara de la fluorescencia de MU. Cuando MUG se incorpora en medio de LST, coliformes pueden ser enumerados en la base de la produccin de gas de la lactosa y E. coli son presuntamente identificados por fluorescencia en el medio bajo la luz de onda larga UV, por lo que es capaz de proporcionar una identificacin presuntiva de E. coli dentro de las 24 h ( 18 , 28 ). El mtodo LST-MUG se describe a continuacin ha sido adoptado como Accin Final Oficial de la AOAC para la prueba de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados, con exclusin de los mariscos ( 28 ). Para obtener ms informacin en la taza del ensayo de contacto, el Dr. Peter Feng FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740, 301-436-1650. PRECAUCIN: Para observar la fluorescencia, examinar inoculados MUG LST-tubos en onda larga (365 nm) la luz ultravioleta en la oscuridad. Un nio de 6 vatios de mano de la lmpara UV es adecuada y segura. Cuando se utiliza una fuente de UV ms potente, como una lmpara de 15 vatios fluorescente, usar gafas protectoras o gafas protectoras. Asimismo, antes de su uso en ensayos de MUG, examinar todos los tubos de vidrio para la fluorescencia de automviles. xido de cerio, que a veces se aade al vidrio como medida de control de calidad, presenta fluorescencia bajo la luz ultravioleta e interferir con la prueba de MUG ( 25 ). El uso de cepas de control positivo y negativo para la reaccin MUG es esencial. 1. Equipo y material: ver la seccin IA anterior y, adems, los tubos son nuevos y desechables de vidrio de borosilicato (100 x 16 mm) . nuevos y desechables de vidrio borosilicato viales Durham (50 x 9 mm) para la recoleccin de gas de la lmpara UV de onda larga, de 6 vatios o equivalente 2. Medios y reactivos: ver la seccin IB 3. Presunta LST-MUG prueba para E. coli. Preparar las muestras de alimentos y realizar la prueba presuntiva MPN como se describe en la seccin IC anterior, excepto el uso MUG LST-tubos en lugar de LST. Asegrese de inocular un tubo de LST-MUG con un conocido SUG-positivas E. coli aislar control positivo (ATCC 25922). Adems, vacunar a otro tubo con una cultura de Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) como control negativo, para facilitar la diferenciacin de los tubos de muestra que muestran un crecimiento de slo aquellos que muestran el crecimiento y la fluorescencia. Incubar los tubos de 24 a 48 2 horas a 35 C. Examine cada tubo para el crecimiento (turbidez, gas) y luego examinar los tubos en la oscuridad bajo la lmpara UV de onda larga (365 nm). Una fluorescencia azulada es un resultado positivo presuntivo de E. coli . Los estudios realizados por Moberg et al. ( 28 ) muestran que un 24 h lectura de la fluorescencia es un indicador preciso de la E. coli y se pueden identificar 83-95% de la E. coli positivas tubos. Despus de 48 h de incubacin, 96 a 100% de los E. coli -positivos los tubos pueden ser identificados ( 28 ).Realizar una prueba confirmada en todos los tubos positivos presuntivos por rayar un asa de la suspensin de cada tubo fluorescente en L -EMB agar e incubar 24 2 horas a 35 C. Seguir los protocolos descritos en I. F, por encima, para la prueba completada por E. coli . Calcular NMP de E. colibasada en la combinacin de tubos fluorescentes confirm en tres diluciones sucesivas.

III. Examen de Agua Embotellada

Consumo de agua embotellada est aumentando rpidamente en todo el mundo. Slo en los EE.UU., ms de 3,6 millones de galones de agua embotellada consumida en 1998 (Asociacin Internacional de Agua Embotellada, Alexandria, VA). A diferencia del agua potable, que est regulada por la EPA de los EE.UU., el agua embotellada es la calificacin legal de alimentos en los EE.UU. y regulados por la FDA (Federal Register 1995 21 CFR Parte 103 y otros bebidas: agua embotellada, la regla final 60 (.... 218) 57.076 a 57.130). La FDA define el agua embotellada como "el agua que se destina para el consumo humano y que est sellado en botellas u otros recipientes, sin ingredientes aadidos, excepto que pueden contener agentes antimicrobianos seguro y adecuado" y, dentro de los lmites, un poco de fluoruro aadido. El agua embotellada puede ser utilizado como una bebida por s solo o como ingrediente en otras bebidas. Estas normas no se aplican a los refrescos o bebidas similares. Adems de "agua embotellada" o "agua potable", en la FDA 21 CFR Part 103 tambin define varios tipos de agua embotellada que cumplan con ciertos criterios. Estas identidades son "agua de pozo artesiano o artesanal", "agua subterrnea", el agua mineral "," agua purificada o desmineralizada "," agua embotellada espumoso "," agua d manantial e "y" agua de pozo ". Adems" agua estril "se define como el agua que cumpla con los requisitos establecidos en la "prueba de esterilidad" en la Farmacopea de los Estados Unidos. Organismos coliformes no son necesariamente los agentes patgenos y rara vez se encuentran en el agua embotellada, sin embargo, sirven como un indicador de contaminacin o insalubridad posible.Las encuestas han demostrado que los coliformes son indicadores tiles de la calidad del agua embotellada, pero algunos pases ta mbin monitorear las poblaciones microbianas adicionales como indicadores de calidad de las botellas de agua ( 10 , 33 ). Bajo el actual estndar de calidad del agua embotellada, la FDA ha establecido un requisito de la calidad microbiolgica que se basa en los niveles de deteccin de coliformes. Estos niveles se pueden obtener por filtracin en membrana (MF) o por el anlisis MPN de 10 tubos de 10 ml diez unidades de anlisis. Para obtener informacin sobre los mtodos de contacto con el agua embotel ada Dr. Peter Feng , FDA, CFSAN, l College Park, MD, 20740, 301-436-1650. 1. Equipos y Materiales. a. Incubadora a 35 0,5 C. b. Unidades de filtracin por membranas (la base del filtro y el embudo): vidrio, plstico o acero inoxidable, envuelto en papel de aluminio o de papel y esterilizado. c. Cmara de esterilizacin ultravioleta para esterilizar la base del filtro y el embudo (opcional). d. Un filtro mltiple o termo para mantener embudos de filtracin. e. Fuente de vaco (la lnea de vaco, bomba de vaco elctrica o aspirador de agua). f. Los filtros de membrana, estril, blanco, cuadriculado dimetro, 47 mm, tamao del poro 0.45 micras (o su equivalente, segn lo especificado por el fabricante) para el recuento de bacterias. g. Placas de Petri, estril, de plstico, 50 x 12 mm, con tapas bien ajustadas. h. Pinzas diseadas para la transferencia de las membranas sin sufrir daos. 2. Los medios de cultivo. a. Lauril sulfato triptosa (LST) de caldo ( M-76 ). b. Verde brillante lactosa bilis caldo (BGLB) ( M-25 ). c. M-Endo LES medio o Agar Endo (para la formulacin vase el mtodo estndar para el Examen de Agua y Aguas Residuales, 1998, 20 ed, p. 9 -58 ( 3 ). 3. Diez tubos MPN coliformes prueba -. Procedimientos presuntivos y confirmados por examen de rutina de agua embotellada, toma 100 ml de muestra e inocular 10 tubos r de 2X LST (10 ml de medio) con 10 ml de muestra sin diluir cada uno. Incubar los tubos a 35 C.Examinar los tubos a 24 2 h para el crecimiento y la formacin de gas como se evidencia por el desplazamiento del medio en el vial de fermentacin o efervescencia cuando los tubos se agita suavemente. Si es negativo a las 24 h, los tubos de reincubate durante 24 h, y examinar de nuevo para el gas. Realizar una prueba confirmada en todos los supuestamente positivas (gas) tubos de la siguiente manera: agitar suavemente cada tubo LST positivo y, con un 3,0 a 3,5 mm asa estril, la transferencia de uno o ms loopfuls de suspensin a un tubo de caldo BGLB.Estril palos aplicador de madera tambin puede ser utilizado para la transferencia mediante la insercin de al menos 2,5 cm en el caldo de cultivo. Incubar los tubos BGLB durante 48 2 horas a 35 C. Examine para la produccin de gas y de registro. Calcular MPN con 10 tubos MPN tabla (9221.III), p. 9-52, los mtodos estndar para el Anlisis de Aguas y Aguas Residuales ( 3 ). 4. Mtodo de filtro de membrana para coliformes. Filtro de 100 ml de muestra y trasladar el filtro de M-Endo LES medio o Agar Endo e incubar a 35 C durante 22-24 h. Contar las colonias que son de color rosa a rojo oscuro

IV. El examen de carne de mariscos y moluscos

con un brillo de la superficie verde metlico. El brillo puede variar de precisar para completar la cobertura de la colonia. . El uso de un bajo consumo de energa, la diseccin de tipo microscopio para examinar los filtros se recomienda la confirmacin - Si hay de 5 a 10 colonias en el filtro de brillo, confirmar todos mediante la inoculacin de crecimiento de cada colonia brillo en los tubos de LST y se incuba a 35 C para 48 h. Si el nmero de colonias de brillo superior a 10, al azar seleccionar y confirmar las 10 colonias que son representativos de todas las colonias de brillo. Cualquier tubos de gas deben ser positivas LST sub culto a BGLB y se incuba a 35 C durante 48 horas. La produccin de gas en BGLB en las 48 horas es una prueba de coliformes confirmados. Informe de resultados como el nmero de colonias de coliformes por 100 ml. NOTA : El mtodo estndar de 1998, 20 ed, p. 9-60 ( 3 ), permite la inoculacin simultnea de LST y BGLB durante la verificacin. Sin embargo, es algo BGLB inhibitoria lo que el mtodo descrito anteriormente, donde las muestras se sub cultivadas a partir de LST en BGLB es considerado como un ensayo de verificacin ms sensibles y por lo tanto, recomend.

El procedimiento oficial de la FDA para el anlisis bacteriolgico de la nacional y de importacin de moluscos bivalvos es la forma correcta y completa se describe en la APHA procedimientos recomendados por el examen del agua de mar y mariscos , 4 ed. 1970 ( 1 ). Los mtodos, incluyendo el convencional de 5 tubos MPN para coliformes, coliformes fecales y el recuento total en placa estndar para las bacterias (ver captulo 3 ), se describen a continuacin para el examen de acciones cscara, frescos, carnes si concha, n dulce sin concha mariscos congelados y mariscos congelados en su concha. Estos procedimientos no se aplican a la exploracin de los crustceos (cangrejos, langostas y camarones) o carnes procesadas, tales como mariscos empanizados, productos de c oncha, pre-cocinados, procesados y el calor. Adems, muchos mtodos que se utilizan para las pruebas de agua del medio ambiente o para las aguas de la cosecha de mariscos no se cubren aqu. Anlisis ambientales del agua se realiza por la EPA de los EE.UU. ( 3 ) y la calidad de las aguas de la cosecha de mariscos son principalmente las responsabilidades de las autoridades de cada Estado de control de mariscos ( 20 ). 1. Preparacin de la muestra Utilizando 10-12 mariscos, obtener 200 g de licor de mariscos y carnes. Mezcla 2 min, con 200 ml tampn fosfato estril dilucin con agua, o el 0,5% de peptona para obtener una dilucin 1:2 de la muestra. El anlisis de la muestra de suelo debe comenzar dentro de dos minutos despus de mezclar. Hacer diluciones seriadas en el 0,5% de agua de peptona estril o estril tamponada con fosfato agua de dilucin. 2. MPN - Prueba presuntivos y confirmados por coliformes Use caldo de lactosa (M74) o lauril triptosa Caldo (M76), a la fuerza solo en volmenes de 10 ml.Inocular la siguiente manera: a. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml del homogenado mezclado (equivalente a 1 g de marisco). b. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de una dilucin de 1:10 de homogeneizado (0,1 g de mariscos). c. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de la dilucin 1:100 del homogeneizado (0,01 g de mariscos). d. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de la dilucin 1:1000 de homogeneizado (0,001 g de mariscos). Diluciones que puedan ser necesarias para evitar resultados indeterminados. Incubar los tubos a 35 C y siga las instrucciones en la Seccin 1.C y realizar una prueba confirmada como en 1.D anteriormente en "Mtodo convencional de coliformes, coliformes fecales y E. coli ". Calcular MPN como se describe en la seccin 1.D anterior, excepto que el anlisis de los mariscos se especifica que la densidad de coliformes se expresa como NMP por 100 g de muestra en lugar de por g. 3. MPN - Prueba presuntivos y confirmados de coliformes fecales en los mariscos Realizar la prueba presuntiva como se describe en la seccin 2. Para confirmar los tubos positivos, la transferencia de un asa de los tubos de gas LST positivo de la CE caldo y se incuba en un bao de agua cubierta circular de 44,5 0,2 C durante 24 2 horas. La produccin de gas en la CE es un resultado positivo confirmado de coliformes fecales. Calcular el MPN para los coliformes fecales como se describe ms arriba para coliformes. 4. MPN - EC-MUG Mtodo para la determinacin de E. coli en carne de mariscos El ensayo MUG de -glucuronidasa (GUD) se ha descrito anteriormente para la deteccin de E.coli en los alimentos refrigerados y congelados tambin se puede utilizar para las

V. Anlisis de E. coli en los zumos de ctricos

pruebas de E.coli en carne de mariscos, pero con ligeras modificaciones. Esto se debe al hecho de que los alimentos, como carnes mariscos contienen actividad SUG natural ( 32 ). Como resultado, las ostras homogeneizado inoculado directamente en los tubos LST-MUG en la fase presuntiva de la prueba de MPN puede provocar falsas reacciones positivas de fluorescencia. Por lo tanto, en el anlisis de E. coli en carne de mariscos, el reactivo MUG se aade al medio de la CE y utilizado en la fase de confirmacin de la prueba. Los tubos de EC-MUG, se incubaron a 44,5 C, se puede utilizar en la fase de confirmacin de una prueba de MPN convencionales de 5 tubos para determinar niveles de coliformes fecales en carne de mariscos, a continuacin, mediante el examen de los tubos de fluorescencia en UV de onda larga, una E. coli MPN tambin se pueden obtener fcilmente ( 32 ). Vea la seccin 1.A y 1.B por encima de los materiales y reactivos necesarios. Usar comercialmente preparados deshidratados CE-MUG, o preparar el medio mediante la adicin de MUG a caldo EC (0,05 g / L) (M50). Varias fuentes de compuestos son adecuados MUG: Marcor Development Corp., Hackensack, NJ; Biosynth Internacional, Skokie, IL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO y Qumica Hach, Loveland, Colorado Dispense 5 ml en nuevas vidrio de borosilicato desechables tubos (100 x 16 mm) que contiene, nuevos desechables de vidrio borosilicato Durham viales (50 x 9 mm) para la recoleccin de gas. Esterilizar CE-MUG tubos de caldo de cultivo a 121 C durante 15 min; almacenar hasta 1 semana a temperatura ambiente o hasta un mes en refrigeracin. Realice la prueba de 5 tubos MPN presuntivos y confirmados de coliformes fecales en los mariscos como se describe en la Seccin 3, excepto el uso de AE-MUG tubos en lugar de la CE para el test de confirmacin. Determinacin de la fluorescencia en el EC-MUG caldo requiere el uso de 3 tubos de control, uno inoculado con E. coli como control positivo, con una K. pneumoniaecomo control negativo, y un tubo sin inocular como EC-MUG control de lotes medianos. Se inoculan los controles positivos y negativos en el momento de la prueba confirmada es que se realiza y se incuban los tubos a 44,5 C 0,2 C durante 24 h. Leer la fluorescencia como se describe ms arriba en ensayo LST-MUG. Tenga en cuenta que algunos (<10%) E. coli son anaerogenic (gas-negativo), pero debe ser MUGpositivos. Incluir todos los tubos de fluorescencia positiva en el E. coli clculos MPN. Determinar E. coli MPN de las tablas usando una combinacin de fluorescencia de tubos positivos en cada dilucin.

Anlisis de E. coli se ha implementado para identificar los jugos potencialmente contaminados o para verificar la eficacia del sistema de HACCP en el procesamiento de los jugos no pasteurizados (21 CFR Parte 120, vol. 66, N 13, 19 de enero de 2001). El mtodo estndar utilizado para las pruebas de E.coli es el MPN sin embargo, no parece adecuada para las pruebas de jugo debido a la acidez (pH 3,6 a 4,3) de los jugos, los cuales pueden interferir con el examen, adems de que slo se permite para las pruebas de 3,33 ml de muestra. A diferencia de la mayora de los E. coli mtodos, que son los ensayos de la enumeracin, el mtodo que sigue es un simple presencia / ausencia de pruebas que pueden examinar a 10 ml de volumen de los zumos ( 34 , 35 ). Este ensayo, designado como modificado ColiComplete (CC) Mtodo, es una modificacin del mtodo de la AOAC oficial 992.30, que utiliza para la deteccin de MUG E. coli (vase la seccin sobre la LST-MUG Mtodo para ms detalles). 1. Equipos y materiales o Cubiertos bao de agua, con sistema de circulacin para mantener la temperatura de 44,5 0,2 C. El nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos. o Incubadora, 35 0,5 C o La luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W. 2. Medios y reactivos: Universal Preenrichment caldo (UPEB) (M188) o se pueden comprar de Difco Laboratories, Detroit, MI CE medio ( M49 ) ColiComplete (CC) discos - Biocontrol, Bellevue, WA 3. Preparacin de la muestra, el enriquecimiento y el anlisis Realizar anlisis por duplicado. Aspticamente, inocular 10 mL porcin de jugo en 90 ml de la UPEB y se incuba a 35 C durante 24 h. Despus del enriquecimiento, la mezcla y la transferencia de 1 ml de cada caldo de enriquecimiento UPEB en 9 ml de caldo de CE contiene un disco de CC. Incubar CE / CC tubos de caldo de cultivo a 44,5 C en un bao de agua circulante durante 24 h. Incluye un tubo inoculado con una taza (+) E. coli cepa de control positivo y otro con K. pneumoniae como control negativo. Examinar los tubos en la

VI. Otros mtodos para la enumeracin de coliformes y E. coli

oscuridad y bajo la luz ultravioleta de onda larga. La presencia de fluorescencia azul en cualquiera de los tubos es indicativo de que E. coli est presente en la muestra. Nota: Los discos de CC tambin contienen X-gal, que cuando se divide por -galactosidasa dar color azul o en el disco. Esta reaccin es anloga a la medicin de cido / produccin de gas de la fermentacin de la lactosa por lo tanto, la presencia de color azul es indicativo de coliformes.

Con fines de informacin y referencia que hay una tabla en el Apndice I, que contiene una lista parcial de los ensayos disponibles en el mercado, muchos de los cuales utiliza reactivos fluorognico como MUG u otros sustratos cromognicos para la deteccin e identificacin presuntiva de coliformes yE. coli en los alimentos. Muchas de estas pruebas, como el Petrifilm rehidratable pelcula seca, la membrana de filtro de membrana hidrofbica / MUG (HGMF / MUG) mtodo ( 13 ), ColiComplete disco (16 ), etc, han sido evaluadas por los estudios en colaboracin y adoptado como oficial de primera o accin final de la AOAC. Tambin hay muchas modificaciones de los ensayos de filtracin por membranas que se han desarrollado para la prueba de coliformes, coliformes fecales y E. coli y algunas de ellas pueden ser tiles para pruebas de alimentos como la leche y las bebidas, pero se utilizan sobre todo para el agua, las aguas del medio ambiente, y la cosecha de mariscos aguas anlisis ( 5 , 7 , 20 , 22 , 23 , 31 ).

Referencias
1. 2. 3. 4. 5. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1970. Procedimientos recomendados para el examen del agua de mar y mariscos, 4 ed. APHA, Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1992. En: Marshall, RT (ed). Mtodos Standard para el Examen de Productos Lcteos, 16 ed. APHA. Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1998. Mtodos Standard para el Examen de Agua y Aguas Residuales 20a ed. APHA, Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1992. Compendio de Mtodos para el examen microbiolgico de los alimentos, 3 ed. APHA, Washington, DC. Brenner, KP, CC Rankin, Sivaganesan M., y Scarpino PV. 1996. La comparacin de los porcentajes de recuperacin de Escherichia coli y coliformes totales de agua potable por el mtodo de agar MI y la proteccin Ambiental de los EE.UU. aprobado por la Agencia mtodo de filtro de membrana.Appl. Environ. Microbiol. 62 :203-208. Caplenas, NR y Kanarek MS. 1984. Termotolerantes no fecal fuente de Klebsiella pneumoniae :. validez de la prueba de coliformes fecales en las aguas de recreo soy. Salud Pblica J.. 74 :1273-1275 Ciebin, BW, MH Brodsky, R. Eddington, Horsnell G., A. Choney, Palmateer G., A. Ley, Joshi R. y G. Shears. 1995. Evaluacin comparativa de modificar m-FC y los medios de comunicacin m-TEC para el recuento de filtro de membrana de Escherichia coli en el agua. Appl. Environ. Microbiol. 61:3940-3942. Chang, GW, J. Brill, y Lum R.. 1989. Proporcin de beta-glucuronidasa negativa Escherichia coli en muestras fecales humanas. Appl. Environ. Microbiol. 55 :335-339. Conway, PL 1995. Ecologa microbiana del intestino grueso humano. En: GR Gibson y GT Macfarlane, eds. p.1-24. Las bacterias del colon humano: el papel de la nutricin, la fisiologa y la patologa. CRC Press, Boca Raton, FL. Dege, NJ 1998. Categoras de agua embotellada. Captulo 3, En: DAG Senior y PR Ashurst (ed).Tecnologa del agua embotellada. CRC Press, Boca Raton, Florida. Doyle, MP y JL Schoeni. 1987. Aislamiento de Escherichia coli O157: H7 a partir de carnes al por menor y aves de corral. Appl. Environ. Microbiol. 53 :2394-2396. Eijkman, C. 1904. Mueren garungsprobe bei 46 als hilfsmittel bei der trinkwasseruntersuchung.Zentr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. I. Orig. 37 : 742. Entis, P. 1989. Membrana hidrofbica cuadrcula de filtro / MUG mtodo para coliformes totales yEscherichia coli enumeracin de los alimentos: estudio en colaboracin. J. Assoc. Off. Anal. Chem.72 :936-950. Escherich, T. 1885. Mueren darmbakterien des neugeborenen und sauglings. Fortshr. Med. 3 :5-15-522, 547-554. Ewing, WH 1986. Identificacin de Edwards y Ewing de Enterobacteriaceae , 4 ed. Elsevier, Nueva York. Feldsine, PT, MT Falbo-Nelson, y Hustead DL. 1994. ColiComplete sustrato de apoyo mtodo de disco para la deteccin confirmada de coliformes totales y Escherichia coli en todos los alimentos:. estudio comparativo J. Assoc. Off. Anal.Chem. 77 :58-63. . Feng, P. 1995 Escherichia coli serotipo O157: H7:. vehculos nuevos de infeccin y de las variantes fenotpicas aparicin emergentes enfermedades infecciosas. 1 :16-21.

6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

18. Feng, PCS y Hartman PA. 1982. Ensayos fluorognicos para la confirmacin inmediata de laEscherichia coli . Appl. Environ. Microbiol. 43 :1320-1329. 19. Feng, P., R. Lum, y G. Chang. 1991. Identificacin de uid A secuencias de genes en beta-Dglucuronidasa (-) Escherichia coli . Appl. Environ. Microbiol. 57 :320-323. 20. FDA. 1998. Pescado y productos pesqueros Peligros y Control de Gua. 2 ed. Oficina de Mariscos, CFSAN, FDA de los EE.UU., Servicio de Salud Pblica, Departamento de Salud y Servicios Humanos, Washington DC. 21. Frampton, EW y restaino L.. 1993. Los mtodos para E. coli identificacin en muestras de alimentos, agua y clnicas basadas en la deteccin de betaglucuronidasa. J. Appl. Bacteriol. 74:223-233. 22. Geissler, K., M. Manafi, I. Amors, JL y Alonso. 2000. La determinacin cuantitativa de coliformes totales y Escherichia coli en las aguas marinas con los medios cromognicos y fluorognicos. J.Appl. Microbiol. 88 :280-285. 23. Grant, MA 1997. Una nueva membrana medio de filtracin para la deteccin simultnea y enumeracin de Escherichia coli y coliformes totales. Appl. Environ. Microbiol. 63 :35264530. 24. Gunzer, F., H. Bohm, H. Russmann, Bitzan M., Aleksic S. y H. Karch. 1992. Deteccin molecular de la fermentacin de sorbitol Escherichia coli O157 en pacientes con sndrome urmico hemoltico. J.Clin. Microbiol. 30 :1807-10. 25. Hartman, PA 1989. El MUG (glucuronidasa) prueba de Escherichia coli en los alimentos y el agua, pp 290-308. En: Mtodos rpidos y automatizacin en microbiologa e inmunologa. A. Balows, Tilton RC, y Turano A. (eds). Brixia Academic Press, Brescia, Italia. 26. Hayes, PS, K. Blom, Feng P., J. Lewis, Strockbine NA, y Swaminathan B.. 1995. Aislamiento y caracterizacin de una cepa de -D-glucuronidasa productora de Escherichia coli O157: H7. en los Estados Unidos J. Clin. Microbiol. 33 :3347-3348. 27. Manafi, M. 1996. Sustratos enzimticos cromognicos y fluorognicos en medios de cultivo y pruebas de identificacin. Int. J. Food Microbiol. 31 :45-58. 28. Moberg, LJ, MK Wagner, y Kellen LA. 1988. Ensayo fluorognico para la deteccin rpida deEscherichia coli en los alimentos refrigerados y congelados. estudio en colaboracin J. Assoc. Off.Anal. Chem. 71 :589-602. 29. Neill, MA, Tarr PI, Taylor DN, y Trofa AF. 1994. Escherichia coli . En Manual de Enfermedades de Transmisin Alimentaria, YH Hui, Gorham JR, Murell KD, y DO Cliver, eds. Marcel Decker, Inc. de Nueva York. pp 169-213. 30. Neufeld, N. 1984. Procedimientos para el examen bacteriolgico del agua de mar y mariscos. En: Greenberg, EA y DA Hunt (eds). 1984. Procedimientos de laboratorio para el examen del agua de mar y mariscos, 5 ed. Asociacin Americana de Salud Pblica. Washington, DC. 31. Rippey, SR, WN Adams, y Watkins WD. 1987. La enumeracin de los coliformes fecales y E. coli en las aguas marinas andestuarine: una alternativa a la APHA-MPN enfoque. J. Agua Pollut. Control de la Reserva Federal. 59 :795-798. 32. Rippey, SR, LA Chandler, y Watkins WD. 1987. Mtodo fluoromtrico para la enumeracin deEscherichia coli en los moluscos. J. Prot alimentos. 50 :685-690, 710. 33. Warburton, DW 2000. Metodologa para la deteccin de agua embotellada por la presencia de los indicadores y las bacterias patgenas. Alimentos y Microbiologa. 17 :3-12. 34. Weagant, SD y P. Feng. 2001. Evaluacin comparativa de un mtodo rpido para la deteccin deEscherichia coli en el jugo de naranja artificial contaminada. FDA Boletn de Informacin de Laboratorio # 4239, 17:1-6. 35. Weagant, SD y P. Feng. 2002. Anlisis comparativo de una modificacin rpida de Presencia-Ausencia de prueba y el mtodo estndar para detectar MPN Escherichia coli en jugo de naranja.Alimentos y Microbiologa. 19 :111-115. Fuente hipertexto: Manual de anlisis bacteriolgicos, 8 Edicin, Revisin A, 1998. Captulo 4.

BAM: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria

September 2002

Bacteriological Analytical Manual Chapter 4 Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria
Authors: Peter Feng, Stephen D. Weagant, Michael A. Grant

Chapter Contents
y y y y y y y

Conventional Method for Determining Coliforms and E. coli LST-MUG Method for Detecting E. coli in Chilled or Frozen Foods Exclusive of Bivalve Molluscan Shellfish Bottled Water Examination of Shellfish and Shellfish Meats Analysis for E. coli in citrus juices Other Methods for Enumerating Coliforms and E. coli References

Escherichia coli, originally known as Bacterium coli commune, was identified in 1885 by the German pediatrician, Theodor Escherich (14, 29). E. coli is widely distributed in the intestine of humans and warm-blooded animals and is the predominant facultative anaerobe in the bowel and part of the essential intestinal flora that maintains the physiology of the healthy host (9, 29). E. coli is a member of the family Enterobacteriaceae (15), which includes many genera, including known pathogens such as Salmonella, Shigella, and Yersinia. Although most strains of E. coli are not regarded as pathogens, they can be opportunistic pathogens that cause infections in immunocompromised hosts. There are also pathogenic strains of E. coli that when ingested, causes gastrointestinal illness in healthy humans (see Chap. 4A). In 1892, Shardinger proposed the use of E. coli as an indicator of fecal contamination. This was based on the premise that E. coli is abundant in human and animal feces and not usually found in other niches. Furthermore, since E. coli could be easily detected by its ability to ferment glucose (later changed to lactose), it was easier to isolate than known gastrointestinal pathogens. Hence, the presence of E. coli in food or water

became accepted as indicative of recent fecal contamination and the possible presence of frank pathogens. Although the concept of using E. coli as an indirect indicator of health risk was sound, it was complicated in practice, due to the presence of other enteric bacteria like Citrobacter, Klebsiella and Enterobacter that can also ferment lactose and are similar to E. coli in phenotypic characteristics, so that they are not easily distinguished. As a result, the term "coliform" was coined to describe this group of enteric bacteria. Coliform is not a taxonomic classification but rather a working definition used to describe a group of Gram-negative, facultative anaerobic rod-shaped bacteria that ferments lactose to produce acid and gas within 48 h at 35C. In 1914, the U.S. Public Health Service adopted the enumeration of coliforms as a more convenient standard of sanitary significance. Although coliforms were easy to detect, their association with fecal contamination was questionable because some coliforms are found naturally in environmental samples (6). This led to the introduction of the fecal coliforms as an indicator of contamination. Fecal coliform, first defined based on the works of Eijkman (12) is a subset of total coliforms that grows and ferments lactose at elevated incubation temperature, hence also referred to as thermotolerant coliforms. Fecal coliform analyses are done at 45.5C for food testing, except for water, shellfish and shellfish harvest water analyses, which use 44.5C (1, 3, 30). The fecal coliform group consists mostly of E. coli but some other enterics such as Klebsiella can also ferment lactose at these temperatures and therefore, be considered as fecal coliforms. The inclusion of Klebsiella spp in the working definition of fecal coliforms diminished the correlation of this group with fecal contamination. As a result, E. coli has reemerged as an indicator, partly facilitated by the introduction of newer methods that can rapidly identify E. coli. Currently, all 3 groups are used as indicators but in different applications. Detection of coliforms is used as an indicator of sanitary quality of water or as a general indicator of sanitary condition in the food-processing environment. Fecal coliforms remain the standard indicator of choice for shellfish and shellfish harvest waters; and E. coli is used to indicate recent fecal contamination or unsanitary processing. Almost all the methods used to detect E. coli, total coliforms or fecal coliforms are enumeration methods that are based on lactose fermentation (4). The Most Probable Number (MPN) method is a statistical, multi-step assay consisting of presumptive, confirmed and completed phases. In the assay, serial dilutions of a sample are inoculated into broth media. Analysts score the number of gas positive (fermentation of lactose) tubes, from which the other 2 phases of the assay are performed and then uses the combinations of positive results to consult a statistical tables (Appendix 2), to estimate the number of organisms present. Typically only the first 2 phases are performed in coliform and fecal coliform analysis, while all 3 phases are done for E. coli. The 3-tube MPN test is used for testing most foods. The 5-tube MPN is used for water, shellfish and shellfish harvest water testing and there is also a 10-tube MPN method that is used to test bottled water or samples that are not expected to be highly contaminated (3). There is also a solid medium plating method for coliforms that uses Violet Red Bile Agar, which contains neutral red pH indicator, so that lactose fermentation results in formation of pink colonies. There are also membrane filtration tests for coliform and fecal coliform that measure aldehyde formation due to fermentation of lactose. This chapter also includes variations of above tests that use fluorogenic substrates to detect E. coli (18), special tests for shellfish analysis, a brief consideration of bottled water

testing and a method for testing large volumes of citrus juices for presence of E. coli in conjunction with the Juice HACCP rule. I. Conventional Method for coliforms, fecal coliforms and E. coli A. Equipment and materials 1. Covered water bath, with circulating system to maintain temperature of 45.5 0.2C. Water level should be above the medium in immersed tubes. 2. Immersion-type thermometer, 1-55C, about 55 cm long, with 0.1C subdivisions, certified by National Institute of Standards and Technology (NIST), or equivalent 3. Incubator, 35 1.0C 4. Balance with capacity of >2 kg and sensitivity of 0.1 g 5. Blender and blender jar (see Chapter 1) 6. Sterile graduated pipets, 1.0 and 10.0 mL 7. Sterile utensils for sample handling (see Chapter 1) 8. Dilution bottles made of borosilicate glass, with polyethylene screw caps equipped with Teflon liners. Commercially prepared dilution bottles containing sterile Butterfield's phosphate buffer can also be used. 9. Quebec colony counter, or equivalent, with magnifying lens 10. Longwave UV light [~365 nm], not to exceed 6 W. 11. pH meter B. Media1 and Reagents2 Brilliant green lactose bile (BGLB) broth, 2% (M253) Lauryl tryptose (LST) broth (M764) EC broth (M495 ) Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar (M806) Tryptone (tryptophane) broth (M1647 ) MR-VP broth (M1048) Koser's citrate broth (M729) Plate count agar (PCA) (standard methods) (M124 10) Butterfield's phosphate-buffered water (R1111) or equivalent diluent (except for shellfish) Kovacs' reagent (R3812) Voges-Proskauer (VP) reagents (R8913) Gram stain reagents (R3214)

Methyl red indicator (R4415) Violet red bile agar (VRBA) (M17416) VRBA-MUG agar (M17517) EC-MUG medium (M5018) Lauryl tryptose MUG (LST-MUG) broth (M7719) Peptone Diluent, 0.1% (R5620) C. MPN - Presumptive test for coliforms, fecal coliforms and E. coli Weigh 50 g food into sterile high-speed blender jar. (see Chapter 1 and current FDA compliance programs for instructions on sample size and compositing) Frozen samples can be softened by storing it for <18 h at 2-5C, but do not thaw. Add 450 mL of Butterfield's phosphate-buffered water and blend for 2 min. If <50 g of sample are available, weigh portion that is equivalent to half of the sample and add sufficient volume of sterile diluent to make a 1:10 dilution. The total volume in the blender jar should completely cover the blades. Prepare decimal dilutions with sterile Butterfield's phosphate diluent. Number of dilutions to be prepared depends on anticipated coliform density. Shake all suspensions 25 times in 30 cm arc or vortex mix for 7 s. Do not use pipets to deliver <10% of their total volume. Transfer 1 mL portions to 3 LST tubes for each dilution for at least 3 consecutive dilutions. Hold pipet at angle so that its lower edge rests against the tube. Let pipet drain 2-3 s. Not more than 15 min should elapse from time the sample is blended until all dilutions are inoculated in appropriate media. NOTE: Use 5-tube MPN for analysis of shellfish and shellfish harvest waters. Incubate LST tubes at 35C. Examine tubes and record reactions at 24 2 h for gas, i.e., displacement of medium in fermentation vial or effervescence when tubes are gently agitated. Re-incubate gas-negative tubes for an additional 24 h and examine and record reactions again at 48 2 h. Perform confirmed test on all presumptive positive (gas) tubes. D. MPN - Confirmed test for coliforms From each gassing LST tube, transfer a loopful of suspension to a tube of BGLB broth, avoiding pellicle if present. Incubate BGLB tubes at 35C and examine for gas production at 48 2 h. Calculate most probable number (MPN) (see Appendix 2) of coliforms based on proportion of confirmed gassing LST tubes for 3 consecutive dilutions. E. MPN - Confirmed test for fecal coliforms and E. coli

From each gassing LST tube from the Presumptive test, transfer a loopful of each suspension to a tube of EC broth (a sterile wooden applicator stick may also be used for these transfers). Incubate EC tubes 24 2 h at 45.5 C and examine for gas production. If negative, reincubate and examine again at 48 2 h. Use results of this test to calculate fecal coliform MPN. To continue with E. coli analysis, proceed to Section F below. The EC broth MPN method may be used for seawater and shellfish since it conforms to recommended procedures (1). (Caution: see Note below). NOTE: Fecal coliform analyses are done at 45.5 0.2C for all foods, except for water testing and in shellfish and shellfish harvest water analysis, which uses an incubation temperature of 44.5 0.2C. F. MPN - Completed test for E. coli. To perform the Completed test for E. coli, gently agitate each gassing EC tube and streak for isolation, a loopful to a L-EMB agar plate and incubate for 18-24 h at 35C. Examine plates for suspicious E. coli colonies, i.e., dark centered and flat, with or without metallic sheen. Transfer up to 5 suspicious colonies from each L-EMB plate to PCA slants incubate for 18-24 h at 35C and use for further testing. NOTE: Identification of any 1 of the 5 colonies as E. coli is sufficient to regard that EC tube as positive; hence, not all 5 isolates may need to be tested. Perform Gram stain. All cultures appearing as Gram-negative, short rods should be tested for the IMViC reactions below and also re-inoculated back into LST to confirm gas production. Indole production. Inoculate tube of tryptone broth and incubate 24 2 h at 35C. Test for indole by adding 0.2-0.3 mL of Kovacs' reagent. Appearance of distinct red color in upper layer is positive test. Voges-Proskauer (VP)-reactive compounds. Inoculate tube of MR-VP broth and incubate 48 2 h at 35C. Transfer 1 mL to 13 x 100 mm tube. Add 0.6 mL naphthol solution and 0.2 mL 40% KOH, and shake. Add a few crystals of creatine. Shake and let stand 2 h. Test is positive if eosin pink color develops. Methyl red-reactive compounds. After VP test, incubate MR-VP tube additional 48 2 h at 35C. Add 5 drops of methyl red solution to each tube. Distinct red color is positive test. Yellow is negative reaction. Citrate. Lightly inoculate tube of Koser's citrate broth; avoid detectable turbidity. Incubate for 96 h at 35C. Development of distinct turbidity is positive reaction. Gas from lactose. Inoculate a tube of LST and incubate 48 2 h at 35C. Gas production (displacement of medium from inner vial) or effervescence after gentle agitation is positive reaction.

Interpretation: All cultures that (a) ferment lactose with gas production within 48 h at 35C, (b) appear as Gram-negative nonsporeforming rods and (c) give IMViC patterns of ++-- (biotype 1) or -+-- (biotype 2) are considered to be E. coli. Calculate MPN (see Appendix 2) of E. coli based on proportion of EC tubes in 3 successive dilutions that contain E. coli. NOTE: Alternatively, instead of performing the IMViC test, use API20E or the automated VITEK biochemical assay to identify the organism as E. coli. Use growth from the PCA slants and perform these assays as described by the manufacturer. G. Solid medium method - Coliforms Prepare violet red bile agar (VRBA) according to manufacturer's instructions. Cool to 48C before use. Prepare, homogenize, and decimally dilute sample as described in section I. C above so that isolated colonies will be obtained when plated. Transfer two 1 mL aliquots of each dilution to petri dishes, and use either of the following two pour plating methods, depending on whether injured or stressed cells are suspected to be present (1). Pour 10 mL VRBA tempered to 48C into plates, swirl plates to mix, and let solidify. To prevent surface growth and spreading of colonies, overlay with 5 mL VRBA, and let solidify. If resuscitation is necessary, pour a basal layer of 810 mL of tryptic soy agar tempered to 48C. Swirl plates to mix, and incubate at room temperature for 2 0.5 h. Then overlay with 8-10 mL of melted, cooled VRBA and let solidify. Invert solidified plates and incubate 18-24 h at 35C. Incubate dairy products at 32C (2). Examine plates under magnifying lens and with illumination. Count purple-red colonies that are 0.5 mm or larger in diameter and surrounded by zone of precipitated bile acids. Plates should have 25-250 colonies. To confirm that the colonies are coliforms, pick at least 10 representative colonies and transfer each to a tube of BGLB broth. Incubate tubes at 35C. Examine at 24 and 48 h for gas production. NOTE: If gas-positive BGLB tube shows a pellicle, perform Gram stain to ensure that gas production was not due to Gram-positive, lactose-fermenting bacilli. Determine the number of coliforms per gram by multiplying the number of suspect colonies by percent confirmed in BGLB by dilution factor. Alternatively, E. coli colonies can be distinguished among the coliform colonies on VRBA by adding 100 g of 4-methyl-umbelliferyl- -D-glucuronide (MUG) per mL in the VRBA overlay. After incubation, observe for bluish fluorescence around colonies under longwave UV light. (see LST-MUG section II for theory and applicability.) H. Membrane Filtration (MF) Method - coliforms: see Section III. Bottled Water.

NOTE: Food homogenates will easily clog filters, hence MF are most suitable for analysis of water samples; however, MF may be used in the analysis of liquid foods that do not contain high levels of particulate matter. II. LST-MUG Method for Detecting E. coli in Chilled or Frozen Foods Exclusive of Bivalve Molluscan Shellfish The LST-MUG assay is based on the enzymatic activity of -glucuronidase (GUD), which cleaves the substrate 4-methylumbelliferyl -D-glucuronide (MUG), to release 4methylumbelliferone (MU). When exposed to longwave (365 nm) UV light, MU exhibits a bluish fluorescence that is easily visualized in the medium or around the colonies. Over 95% of E. coli produces GUD, including anaerogenic (non-gasproducing) strains. One exception is enterohemorrhagic E. coli (EHEC) of serotype O157:H7, which is consistently GUD negative (11, 17). The lack of GUD phenotype in O157:H7 is often used to differentiate this serotype from other E. coli, although GUD positive variants of O157:H7 do exist (24, 26). The production of GUD by other members of the family Enterobacteriaceae is rare, except for some shigellae (44 -58%) and salmonellae (20-29%) (18, 27). However, the inadvertent detection of these pathogens by GUD-based assays is not considered a drawback from a public health perspective. Expression of GUD activity is affected by catabolite repression (8) so on occasion, some E. coli are GUD-negative, even though they carry the uidA gene (gusA) that encodes for the enzyme (19). In most analyses however, about 96% of E. coli isolates tested are GUD-positive without the need for enzyme induction (27). MUG can be incorporated into almost any medium for use in detecting E. coli. But some media such as EMB, which contain fluorescent components, are not suitable, as they will mask the fluorescence of MU. When MUG is incorporated into LST medium, coliforms can be enumerated on the basis of gas production from lactose and E. coli are presumptively identified by fluorescence in the medium under longwave UV light, thus it is capable of providing a presumptive identification of E. coli within 24 h (18, 28). The LST-MUG method described below has been adopted as Official Final Action by the AOAC for testing for E. coli in chilled or frozen foods, exclusive of shellfish (28). For information on MUG assay contact, Dr. Peter Feng FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740; 301-436-1650. CAUTION: To observe for fluorescence, examine inoculated LST-MUG tubes under longwave (365 nm) UV light in the dark. A 6-watt hand-held UV lamp is adequate and safe. When using a more powerful UV source, such as a 15-watt fluorescent lamp, wear protective glasses or goggles. Also, prior to use in MUG assays, examine all glass tubes for auto fluorescence. Cerium oxide, which is sometimes added to glass as a quality control measure, will fluoresce under UV light and interfere with the MUG test (25). The use of positive and negative control strains for MUG reaction is essential. 1. Equipment and material: see section I.A above and in addition, New, disposable borosilicate glass tubes (100 x 16 mm) New, disposable borosilicate glass Durham vials (50 x 9 mm) for gas collection. Longwave UV lamp, 6-watt or equivalent 2. Media and reagents: see section I.B above 3. Presumptive LST-MUG test for E. coli.

Prepare food samples and perform the MPN Presumptive test as described in section I.C. above, except use LST-MUG tubes instead of LST. Be sure to inoculate one tube of LST-MUG with a known GUD-positive E. coli isolate as positive control (ATCC 25922). In addition, inoculate another tube with a culture of Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) as negative control, to facilitate differentiation of sample tubes that show only growth from those showing both growth and fluorescence. Incubate tubes for 24 to 48 2 h at 35C. Examine each tube for growth (turbidity, gas) then examine tubes in the dark under longwave UV lamp (365 nm). A bl uish fluorescence is a positive presumptive test for E. coli. Studies by Moberg et al. (28) show that a 24 h fluorescence reading is an accurate predictor of E. coli and can identify 83-95% of the E. coli-positive tubes. After 48 h of incubation, 96-100% of E. coli-positive tubes can be identified (28). Perform a confirmed test on all presumptive positive tubes by streaking a loopful of suspension from each fluorescing tube to L-EMB agar and incubate 24 2 h at 35C. Follow protocols outlined in I. F, above, for Completed test for E. coli. Calculate MPN of E. coli based on combination of confirmed fluorescing tubes in 3 successive dilutions. III. Examination of Bottled Water Consumption of bottled water is increasing rapidly worldwide. In the U.S. alone, over 3.6 billion gallons of bottled water were consumed in 1998 (International Bottled Water Association, Alexandria, VA). Unlike potable water, which is regulated by the U.S. EPA, bottled water is legally classified as food in the U.S. and regulated by the FDA (Federal Register. 1995. 21 CFR Part 103 et al. beverages: bottled water; final rule. 60(218) 57076-57130). FDA defines bottled water as "water that is intended for human consumption and that is sealed in bottles or other containers with no added ingredients except that it may contain safe and suitable antimicrobial agents" and, within limitations, some added fluoride. Bottled water may be used as a beverage by itself or as an ingredient in other beverages. These regulations do not apply to soft drinks or similar beverages. In addition to "bottled water" or "drinking water", in 21 CFR Part 103 FDA also defines various types of bottled water that meet certain criteria. These identities include "artesian or artesian well water", "ground water", mineral water", "purified or demineralized water", "sparkling bottled water", "spring water" and "well water". Additionally "sterile water" is defined as water that meets the requirements under the "Sterility Test" in the United States Pharmacopeia. Coliform organisms are not necessarily pathogens and are rarely found in bottled water, however, they serve as an indicator of insanitation or possible contamination. Surveys have shown that coliforms are useful indicators of bottled water quality, but some countries also monitor additional microbial populations as indicators of bottle water quality (10, 33). Under the current bottled water quality standard, FDA has established a microbiological quality requirement that is based on coliform detection levels. These levels may be obtained by membrane filtration (MF) or by 10-tube MPN analysis of ten 10-mL analytical units. For information on bottled water methods contact Dr. Peter Feng, FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740; 301-436-1650. 1. Equipment and Materials. a. Incubator at 35 0.5C. b. Membrane filtration units (filter base and funnels): glass, plastic, or stainless steel; wrapped in foil or paper and sterilized.

c. Ultraviolet sterilization chamber for sterilizing filter base and funnels (optional). d. Filter manifold or vacuum flask to hold filter funnels. e. Vacuum source (line vacuum, electric vacuum pump or water aspirator). f. Membrane filters; sterile, white, gridded, 47 mm diameter, 0.45 m pore size (or equivalent, as specified by the manufacturer) for enumeration of bacteria. g. Petri dishes, sterile, plastic, 50 x 12 mm, with tight fitting lids. h. Forceps designed to transfer membranes without damage. 2. Culture media. a. Lauryl sulfate tryptose (LST) broth (M-7621). b. Brilliant green lactose bile broth (BGLB) (M-2522). c. M-Endo medium or LES Endo Agar (for formulation see Standard Method for Examination of Water and Wastewater, 1998, 20th ed, p. 958 (3). 3. Ten tube MPN coliform test - Presumptive and Confirmed procedures. For routine examination of bottled water, take 100 mL of sample and inoculate 10 tubes of 2X LST (10 mL of medium) with 10 mL of undiluted sample each. Incubate tubes at 35C. Examine tubes at 24 2 h for growth and gas formation as evidenced by displacement of medium in fermentation vial or effervescence when tubes are gently agitated. If negative at 24 h, reincubate tubes for an additional 24 h and examine again for gas. Perform a confirmed test on all presumptive positive (gassing) tubes as follows: gently agitate each positive LST tube and, using a 3.0 - 3.5 mm sterile loop, transfer one or more loopfuls of suspension to a tube of BGLB broth. Sterile wooden applicator sticks may also be used for transfer by inserting it at least 2.5 cm into the broth culture. Incubate BGLB tubes for 48 2 h at 35C. Examine for gas production and record. Calculate MPN using 10 tube MPN Table (9221.III), p. 9-52, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (3). 4. Membrane filter method for coliforms. Filter 100 mL of test sample and transfer the filter to M-Endo medium or LES Endo Agar and incubate at 35 C for 22-24 h. Count colonies that are pink to dark red with a green metallic surface sheen. The sheen may vary from pinpoint to complete coverage of the colony. Use of a low power, dissecting-type microscope to examine filters is recommended. Confirmation - If there are 5 to 10 sheen colonies on the filter, confirm all by inoculating growth from each sheen colony into tubes of LST and incubate at 35 C for 48 h. If the number of sheen colonies exceeds 10, randomly select and confirm 10 colonies that are representative of all sheen colonies. Any gas positive LST tubes should be sub cultured to BGLB and incubated at 35C for 48 hr. Gas production in BGLB within 48 h is a confirmed coliform test. Report results as number of coliform colonies per 100 mL. NOTE: Standard Method, 1998, 20th ed, p. 9-60 (3), allows for simultaneous inoculation of LST and BGLB during verification. However, BGLB is somewhat inhibitory so the method described above, where samples are sub cultured from LST into BGLB is regarded as a more sensitive verification assay and therefore, recommended. IV. Examination of Shellfish and Shellfish Meats

The official FDA procedure for bacteriological analysis of domestic and imported bivalve molluscan shellfish is fully and properly described in the APHA's Recommended Procedures the Examination of Sea Water and Shellfish, 4th ed. 1970 (1). The methods, including the conventional 5-tube MPN for coliform, fecal coliform and standard total plate count for bacteria (see Chapter 323), are described below for examining shell stock, fresh-shucked meats, fresh-shucked frozen shellfish, and shellfish frozen on the half shell. These procedures do not apply to the examination of crustaceans (crabs, lobsters, and shrimp) or to processed shellfish meats such as breaded, shucked, pre-cooked, and heat-processed products. Also, many methods that are used for testing for environmental water or for shellfish harvest waters will not be covered here. Environmental water analyses are done by the U.S. EPA (3) and the quality of shellfish harvest waters are mainly the responsibilities of each State's Shellfish Control Authorities (20). 1. Sample Preparation Using 10-12 shellfish, obtain 200 g of shellfish liquor and meat. Blend 2 min, with 200 mL sterile phosphate buffered dilution water or 0.5% peptone water to yield a 1:2 dilution of sample. Analysis of the ground sample must begin within 2 min after blending. Make serial dilutions in 0.5% sterile peptone water or sterile phosphate buffered dilution water. 2. MPN - Presumptive and Confirmed Test for Coliform Use Lactose Broth (M74) or Lauryl Tryptose Broth (M76), at single strength in 10 ml volumes. Inoculate as follows: a. To each of 5 tubes, add 2 mL of the blended homogenate (equivalent to 1 g of shellfish). b. To each of 5 tubes, add 2 mL of 1:10 dilution of homogenate (0.1 g shellfish). c. To each of 5 tubes, add 2 mL of 1:100 dilution of homogenate (0.01 g shellfish). d. To each of 5 tubes, add 2 mL of 1:1000 dilution of homogenate (0.001 g shellfish). Further dilutions may be necessary to avoid indeterminate results. Incubate tubes at 35C then follow instructions in section 1.C and perform Confirmed test as in 1.D above, under "Conventional Method for Coliforms, fecal coliforms and E. coli". Calculate MPN as described in section 1.D above, except that shellfish analysis specifies that the coliform density be expressed as MPN per 100 g of sample rather than per g. 3. MPN - Presumptive and Confirmed Test for Fecal Coliforms in Shellfish Perform presumptive test as described in section 2 above. To confirm positive tubes, transfer one loopful from gas positive LST tubes to EC broth a nd incubate in a covered circulating waterbath at 44.50.2C for 24 2 hr. Gas production in EC is a positive confirmed test for fecal coliforms. Calculate the MPN for fecal coliforms as described above for coliform.

4. MPN - EC-MUG Method for Determining E. coli in Shellfish Meats The MUG assay for -glucuronidase (GUD) described above for detecting E. coli in chilled and frozen food can also be used for testing for E. coli in shellfish meats; but with slight modifications. This is due to the fact that foods, such as shellfish meats contain natural GUD activity (32). As a result, oyster homogenate inoculated directly into LST-MUG tubes in the Presumptive phase of the MPN test can cause false positive fluorescence reactions. Hence, in the analysis of E. coli in shellfish meats, the MUG reagent is added to the EC medium and used in the confirmatory phase of the assay. The EC-MUG tubes, incubated at 44.5C, can be used in the confirmatory phase of a conventional 5tube MPN assay to determine fecal coliform levels in shellfish meats, then by examining tubes for fluorescence under longwave UV, an E. coli MPN can also be readily obtained (32). See section 1.A and 1.B above for materials and reagents required. Use commercially prepared dehydrated EC-MUG, or prepare medium by adding MUG to EC broth (0.05 g/L) (M50). Several sources of MUG compound are suitable: Marcor Development Corp., Hackensack, NJ; Biosynth International, Skokie, IL; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO and Hach Chemical, Loveland, CO. Dispense 5 mL into new disposable borosilicate glass tubes (100 x 16 mm) containing, new disposable borosilicate glass Durham vials (50 x 9 mm) for gas collection. Sterilize EC-MUG broth tubes at 121C for 15 min; store up to 1 week at room temperature or up to a month under refrigeration. Perform the 5-tube MPN Presumptive and Confirmed Test for Fecal Coliforms in Shellfish as described above in Section 3, except use EC-MUG tubes instead of EC for the confirmed test. Determination of fluorescence in EC-MUG broth requires the use of 3 control tubes, one inoculated with E. coli as positive control; one with K. pneumoniae as negative control; and an uninoculated tube as EC-MUG medium batch control. Inoculate the positive and negative controls at the time when Confirmed test is being performed and incubate all tubes at 44.5C 0.2C for 24 h. Read fluorescence as described above under LST-MUG assay. Note that some (<10%) E. coli are anaerogenic (gas-negative), but should be MUG-positive. Include all fluorescence positive tubes in the E. coli MPN calculations. Determine E. coli MPN from tables using combination of fluorescence positive tubes at each dilution. V. Analysis for E. coli in citrus juices Analysis for E. coli has been implemented to identify potentially contaminated juices or for verifying the effectiveness of HACCP during processing of unpasteurized juices (21 CFR Part 120, Vol. 66, No. 13, January 19, 2001). The standard method commonly used for testing for E. coli is the MPN however, it does not seem adequate for juice testing because of the acidity (pH 3.6 to 4.3) of juices, which can interfere with the test, plus it only allows for testing 3.33 mL of sample. Unlike most E. coli methods, which are enumeration assays, the following method is a simple Presence/Absence test that can examine 10-mL volume of juices (34, 35). This assay, designated as modified

ColiComplete (CC) Method, is a modification of AOAC Official Method 992.30, which uses MUG for detection of E. coli (see Section on LST-MUG Method for details). 1. Equipment and materials o Covered water bath, with circulating system to maintain temperature of 44.5 0.2C. Water level should be above the medium in immersed tubes. o Incubator, 35 0.5C o Longwave UV light [~365 nm], not to exceed 6 W. 2. Media and reagents: Universal Preenrichment Broth (UPEB) (M188) or can be purchased from Difco Laboratories, Detroit, MI EC medium (M4924) ColiComplete (CC) discs - Biocontrol, Bellevue, WA 3. Sample preparation, enrichment and analysis Perform assay in duplicate. Aseptically, inoculate 10-mL portion of juice into 90 mL of UPEB and incubate at 35C for 24 h. After enrichment, mix and transfer 1-mL from each UPEB enrichment broth into 9 mL of EC broth containing a CC disc. Incubate EC/CC broth tubes at 44.5C in a circulating water bath for 24 h. Include a tube inoculated with a MUG (+) E. coli strain as positive control and another with K. pneumoniae as negative control. Examine tubes in the dark and under long wave UV light. The presence of blue fluorescence in either tube is indicative that E. coli is present in the sample. Note: The CC discs also contain X-gal, which when cleaved by -galactosidase will yield blue color on or around the disc. This reaction is analogous to measuring acid/gas production from fermentation of lactose hence, the presence of blue color is indicative of coliforms. VI. Other Methods for Enumerating Coliforms and E. coli For information and reference purposes there is a Table in Appendix I, which contains a partial listing of commercially-available assays, many of which uses fluorogenic reagents like MUG or other chromogenic substrates for presumptive detection and identification of coliform and E. coli in foods. Many of these tests, such as the Petrifilm dry rehydratable film, the hydrophobic grid membrane filter/MUG (HGMF/MUG) method (13), ColiComplete disc (16), etc, have been evaluated by collaborative studies and adopted as official first or final action by the AOAC. There are also many modifications of the membrane filtration assays that have been developed for testing for coliform, fecal coliform and E. coli and some of these may be useful in testing foods such as milk and beverages, but they are used mostly for water, environmental waters, and shellfish harvest waters analysis (5, 7, 20, 22, 23, 31). References

1. American Public Health Association. 1970. Recommended Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish, 4th ed. APHA, Washington, DC. 2. American Public Health Association. 1992. In: Marshall, R.T. (ed). Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16th ed. APHA. Washington, DC. 3. American Public Health Association. 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed. APHA, Washington, DC. 4. American Public Health Association. 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3rd ed. APHA, Washington, DC. 5. Brenner, K. P., C. C. Rankin, M. Sivaganesan, and P.V. Scarpino. 1996. Comparison of the recoveries of Escherichia coli and total coliforms from drinking water by the MI agar method and the U.S. Environmental protection agency-approved membrane filter method. Appl. Environ. Microbiol. 62:203208. 6. Caplenas, N.R. and M.S. Kanarek. 1984. Thermotolerant non-fecal source Klebsiella pneumoniae: validity of the fecal coliform test in recreational waters. Am. J. Public Health. 74:1273-1275 7. Ciebin, B.W., M.H. Brodsky, R. Eddington, G. Horsnell, A. Choney, G. Palmateer, A. Ley, R. Joshi, and G. Shears. 1995. Comparative evaluation of modified m-FC and m-TEC media for membrane filter enumeration of Escherichia coli in water. Appl. Environ. Microbiol. 61:3940-3942. 8. Chang, G.W., J. Brill, and R. Lum. 1989. Proportion of beta -glucuronidasenegative Escherichia coli in human fecal samples. Appl. Environ. Microbiol. 55:335-339. 9. Conway, P.L. 1995. Microbial ecology of the human large intestine. In: G.R. Gibson and G.T. Macfarlane, eds. p.1-24. Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology, and pathology. CRC Press, Boca Raton, FL. 10. Dege, N.J. 1998. Categories of bottled water. Chapter 3, In: D.A.G. Senior and P. R. Ashurst (ed). Technology of Bottled Water. CRC Press, Boca Raton, Florida. 11. Doyle, M.P. and J.L. Schoeni. 1987. Isolation of Escherichia coli O157:H7 from retail meats and poultry. Appl. Environ. Microbiol. 53:2394-2396. 12. Eijkman, C. 1904. Die garungsprobe bei 46 als hilfsmittel bei der trinkwasseruntersuchung. Zentr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. I. Orig. 37:742. 13. Entis, P. 1989. Hydrophobic grid membrane filter/MUG method for total coliform and Escherichia coli enumeration in foods: collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72:936-950. 14. Escherich, T. 1885. Die darmbakterien des neugeborenen und sauglings. Fortshr. Med. 3:5-15-522, 547-554. 15. Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th ed. Elsevier, New York. 16. Feldsine, P.T., M.T. Falbo-Nelson, and D.L. Hustead. 1994. ColiComplete Substrate-supporting disc method for confirmed detection of total coliforms and Escherichia coli in all foods: comparative study. J. Assoc. Off. Anal.Chem.77:58-63. 17. Feng, P. 1995. Escherichia coli serotype O157:H7: Novel vehicles of infection and emergence phenotypic variants. Emerging Infectious Dis. 1:16-21. 18. Feng, P.C.S. and P.A. Hartman. 1982. Fluorogenic assays for immediate confirmation of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 43:1320-1329.

19. Feng, P., R. Lum, and G. Chang. 1991. Identification of uidA gene sequences in beta-D-glucuronidase (-) Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 57:320323. 20. FDA. 1998. Fish and Fisheries Products Hazards and Control Guide. 2nd ed. Office of Seafood, CFSAN, U.S. FDA, Public Health Service, Dept. Health and Human Services, Washington DC. 21. Frampton, E.W. and L. Restaino. 1993. Methods for E. coli identification in food, water and clinical samples based on beta-glucuronidase detection. J. Appl. Bacteriol. 74:223-233. 22. Geissler, K., M. Manafi, I. Amoros, and J.L. Alonso. 2000. Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. J. Appl. Microbiol. 88:280-285. 23. Grant, M.A. 1997. A new membrane filtration medium for simultaneous detection and enumeration of Escherichia coli and total coliforms. Appl. Environ. Microbiol. 63:3526-4530. 24. Gunzer, F., H. Bohm, H. Russmann, M. Bitzan, S. Aleksic, and H. Karch. 1992. Molecular detection of sorbitol fermenting Escherichia coli O157 in patients with hemolytic uremic syndrome. J. Clin. Microbiol. 30:1807-10. 25. Hartman, P.A. 1989. The MUG (glucuronidase) test for Escherichia coli in food and water, pp. 290-308. In: Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. A. Balows, R.C. Tilton, and A. Turano (eds). Brixia Academic Press, Brescia, Italy. 26. Hayes, P.S., K. Blom, P. Feng, J. Lewis, N.A. Strockbine, and B. Swaminathan. 1995. Isolation and characterization of a -D-glucuronidase-producing strain of Escherichia coli O157:H7 in the United States. J. Clin. Microbiol. 33:33473348. 27. Manafi, M. 1996. Fluorogenic and chromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests. Int. J. Food Microbiol. 31:45-58. 28. Moberg, L.J., M.K. Wagner, and L.A. Kellen. 1988. Fluorogenic assay for rapid detection of Escherichia coli in chilled and frozen foods: collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71:589-602. 29. Neill, M. A., P. I. Tarr, D. N. Taylor, and A. F. Trofa. 1994. Escherichia coli. In Foodborne Disease Handbook, Y. H. Hui, J. R. Gorham, K. D. Murell, and D. O. Cliver, eds. Marcel Decker, Inc. New York. pp. 169-213. 30. Neufeld, N. 1984. Procedures for the bacteriological examination of seawater and shellfish. In: Greenberg, A.E. and D.A. Hunt (eds). 1984. Laboratory Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish, 5th ed. American Public Health Association. Washington, DC. 31. Rippey, S.R., W.N. Adams, and W.D. Watkins. 1987. Enumeration of fecal coliforms and E. coli in marine andestuarine waters: an alternative to the APHAMPN approach. J. Water Pollut. Control Fed. 59:795-798. 32. Rippey, S.R., L.A. Chandler, and W.D. Watkins. 1987. Fluorometric method for enumeration of Escherichia coli in molluscan shellfish. J. Food Prot. 50:685690, 710. 33. Warburton, D.W. 2000. Methodology for screening bottled water for the presence of indicator and pathogenic bacteria. Food Microbiol. 17:3-12. 34. Weagant, S.D. and P. Feng. 2001. Comparative evaluation of a rapid method for detecting Escherichia coli in artificially contaminated orange juice. FDA Laboratory Information Bulletin #4239, 17:1-6.

35. Weagant, S.D. and P. Feng. 2002. Comparative Analysis of a Modified Rapid Presence-Absence Test and the standard MPN Method for Detecting Escherichia coli in Orange Juice. Food Microbiol. 19:111-115. Hypertext Source: Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A, 1998. Chapter 4.

BAM: Enumeracin de Escherichia coli y bacterias coliformes

Septiembre 2002

Manual de anlisis bacteriolgicos Captulo 4 La enumeracin de Escherichia coli y bacterias coliformes

Autores: Peter Feng , Stephen D. Weagant, Michael A. Grant

Contenido del captulo

y y y y y y y

Mtodo convencional para la determinacin de coliformes y E. coli LST-MUG mtodo de deteccin de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados exclusivo de los moluscos bivalvos Agua embotellada El examen de carne de mariscos y moluscos Anlisis de E. coli en los zumos de ctricos Otros mtodos para la enumeracin de coliformes y E. coli Referencias
Escherichia coli , originalmente conocida como bacteria Escherichia comuna, fue identificado en 1885 por el pediatra alemn, Theodor Escherich ( 14 , 29 ). E. coli se encuentra ampliamente distribuido en el intestino de los seres humanos y animales de sangre caliente y es el principal anaerobio facultativo en el intestino y parte de la flora intestinal esencial que mantiene la fisiologa del husped sano ( 9 , 29 ).E. coli es un miembro de la familia Enterobacteriaceae ( 15 ), que incluye muchos gneros, incluyendo patgenos conocidos, tales como Salmonella , Shigella y Yersinia . Aunque la mayora de las cepas de E.coli no son considerados como patgenos, que pueden ser patgenos oportunistas que causan infecciones en huspedes inmunocomprometidos. Tambin hay cepas patgenas de E. coli que cuando se ingiere, causa enfermedades gastrointestinales en los seres humanos sanos (vase el Cap. 4A). En 1892, Shardinger propuso el uso de E. coli como indicador de contaminacin fecal. Esto se bas en la premisa de que E. coli es abundante en las heces humanas y animales y que no se encuentra en otros nichos. Adems, dado que E. coli pueden ser detectadas fcilmente por su capacidad de fermentar la glucosa (ms tarde cambiado a la lactosa), que era ms fcil de aislar que los conocidos patgenos gastrointestinales. Por lo tanto, la presencia de E. coli en los alimentos o el agua lleg a ser aceptada como un indicador de contaminacin fecal reciente y la posible presencia de patgenos franca. Aunque el concepto del uso de E. coli como un indicador indirecto de riesgo para la salud era buena, era muy complicado en la prctica, debido a la presencia de otras bacterias entricas comoCitrobacter , Klebsiella y Enterobacter que tambin pueden fermentar la lactosa y son similares a E. colien las caractersticas fenotpicas, de manera que no se distinguen fcilmente. Como resultado, el trmino "coliformes" fue acuado para describir este grupo de bacterias entricas. Coliformes no es una clasificacin taxonmica, sino ms bien una definicin de trabajo se utiliza para describir un grupo de bacterias Gram -negativas, anaerobios facultativos en forma de barra de las bacterias que fermentan la lactosa para producir cido y gas dentro de las 48 horas a 35 C. En 1914, el Servicio de Salud Pblica de EE.UU. aprob el recuento de coliformes como un estndar ms conveniente de importancia sanitaria. A pesar de coliformes eran fciles de detectar, su asociacin con la contaminacin fecal es cuestionable debido a que algunas bacterias col formes se encuentran naturalmente en las i muestras del medio ambiente ( 6 ). Esto llev a la introduccin de la coliformes fecales como indicador de contaminacin. Coliformes fecales, que defini por primera vez sobre la base de las obras de Eijkman (12 ) es un subconjunto de coliformes totales, que crece y fermenta la lactosa a temperatura de incubacin elevado, por lo tanto, tambin conocida como coliformes fecales. Fecal coliforme anlisis se realizan a 45,5 C para el anlisis de alimentos, a excepcin de los anlisis de agua, los mariscos y los crustceos de agua de la cosecha, que utilizan 44,5 C ( 1 , 3 , 30 ). El grupo coliforme fecal est compuesta principalmente por E. coli entricas, pero algunos otros como Klebsiella tambin pueden fermentar la lactosa a estas temperaturas y por lo tanto, ser considerada como coliformes

fecales. La inclusin de Klebsiella spp en la definicin de trabajo de coliformes fecales disminuy la correlacin de este grupo con la contaminacin fecal. Como resultado, los E. coli ha resurgido como un indicador, en parte facilitado por la introduccin de nuevos mtodos que pueden identificar rpidamente E. coli. En la actualidad, todos los tres grupos se utilizan como indicadores, pero en diferentes aplicaciones.Deteccin de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria del agua o como un indicador general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de alimentos. Coliformes fecales siendo el indicador estndar de eleccin para las aguas de recoleccin de mariscos y moluscos, y E. coli se utiliza para indicar la contaminacin fecal reciente o procesamiento insalubres. Casi todos los mtodos utilizados para detectar E. coli , coliformes totales o coliformes fecales son los mtodos de enumeracin que se basan en la fermentacin de la lactosa ( 4 ). Del Nmero Ms Probable (NMP) es una estadstica, de varios pasos de ensayo que consiste en las fases de presuncin, confirmada y completada. En el ensayo de diluciones seriadas de una muestra se inoculan en los medios de comunicacin caldo. Los analistas anotar el nmero de gas positivo (fermentacin de la lactosa) tubos, de la cual las otras 2 fases del ensayo se realiz a continuacin, utiliza las combinaciones de resultados positivos para consultar a un cuadros estadsticos (Anexo 2), para estimar el nmero de microorganismos presentes . Normalmente, slo los primeros dos fases se llevan a cabo en coliformes fecales y anlisis de coliformes, mientras que las 3 fases se realizan por E. coli . La prueba de MPN de 3 tubos se utiliza para probar la mayora de los alimentos. El MPN de 5 tubos se utiliza para el agua, los mariscos y las pruebas de cosecha de moluscos de agua y tambin hay un mtodo NMP -10 tubo que se utiliza para probar el agua embotellada o muestras que no se espera que estn muy contaminadas (3 ). Tambin hay un mtodo de recubrimiento medio s lido para los coliformes que utiliza Agar Violeta Rojo Bilis, que contiene indicadores de pH neutro de color rojo, por lo que los resultados de la lactosa fermentacin en la formacin de colonias de color rosa. Tambin hay pruebas de filtracin de membrana para coliformes y coliformes fecales, que la formacin de aldehdos medida debido a la fermentacin de la lactosa. Este captulo tambin incluye las variaciones de las pruebas anteriores que utilizan sustratos fluorognicos para detectar E. coli ( 18 ), pruebas especiales para el anlisis de los mariscos, una breve consideracin de las pruebas de agua embotellada y un mtodo pa probar grandes ra cantidades de zumos de ctricos de la presencia de E. coli , junto con la regla de jugo de HACCP.

I. Mtodo convencional de coliformes, coliformes fecales y E. coli

A. Equipos y materiales 1. Cubiertos bao de agua, con sistema de circulacin para mantener la temperatura de 45,5 0,2 C. Nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos. 2. Inmersin de tipo termmetro, 1-55 C, a unos 55 cm de largo, con 0,1 C subdivisiones, certificada por el Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST), o equivalente 3. Incubadora, 35 1,0 C 4. Equilibrio con la capacidad de > 2 kg y sensibilidad de 0,1 g 5. Licuadora y batidora frasco ( ver Captulo 1) 6. Estril pipetas graduadas, 1.0 y 10.0 mL 7. Utensilios estriles para la manipulacin de la muestra ( ver Captulo 1) 8. Botellas de dilucin de vidrio de borosilicato, con tapn de rosca de polietileno equipadas con cubiertas de Tefln. Preparados comercialmente botellas de dilucin con tampn fosfato estril Butterfield tambin se puede utilizar. 9. Quebec contador de colonias, o equivalente, con lente de aumento 10. La luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W. 11. pH metro B. Los medios de comunicacin y Reactivos Verde brillante bilis lactosa (BGLB) de caldo, 2% ( M25 ) Lauril triptosa (LST) de caldo ( M76 ) CE caldo ( M49 ) Eosina-azul de metileno de Levine (L-EMB) agar ( M80 ) Triptona (triptfano) de caldo ( M164 ) MR-VP caldo ( M104 ) Koser caldo de citrato ( M72 ) Placa de agar recuento (PCA) (mtodos estndar) ( M124 ) Tampn fosfato Butterfield agua ( R11 ) o diluyente equivalente (a excepcin de los mariscos) Reactivo de Kovacs ( R38 )

Voges-Proskauer (VP) reactivos ( R89 ) Reactivos de tincin de Gram ( R32 ) Indicador rojo de metilo ( R44 ) Agar bilis rojo violeta (Vrba) ( M174 ) VRBA-MUG agar ( M175 ) EC-MUG medio ( M50 ) Lauril triptosa MUG (LST-MUG) de caldo ( M77 ) Diluyente de peptona al 0,1% ( R56 ) C. MPN - prueba presuntiva de coliformes, coliformes fecales y E. coli Pesar 50 g de alimentos en el estril de alta velocidad vaso de la licuadora. (Vase el captulo 1 y los actuales programas de cumplimiento de la FDA para obtener instrucciones sobre la composicin y tamao de la muestra) Las muestras congeladas pueden ser suavizadas mediante el almacenamiento de < 18 horas a 2-5 C, pero no se descongelen. Aadir 450 ml de tampn fosfato Butterfield de agua y se mezcla durante 2 min. Si <50 g de la muestra estn disponibles, pese porcin que equivale a la mitad de la muestra y aadir un volumen suficiente de diluyente estril para realizar una dilucin 1:10. El volumen total en el vaso de la licuadora debe cubrir completamente las hojas. Preparar diluciones decimales con diluyente estril de fosfato de Butterfield. Nmero de diluciones que estar preparado depende de la densidad de coliformes anticipado. Temblar a todas las suspensiones de 25 veces en el arco de 30 cm o Agitar la mezcla durante 7 s. No utilizar pipetas para ofrecer <10% de su volumen total. La transferencia de porciones de 1 ml a 3 tubos LST para cada dilucin de al menos 3 diluciones consecutivas. Mantenga la pipeta en un ngulo de modo que su borde inferior se apoya contra el tubo. Vamos pipeta de drenaje 2.3 s.No ms de 15 minutos deben transcurrir del tiempo se mezcla la muestra hasta que todas las diluciones son inoculadas en medios adecuados. NOTA: El uso de 5 tubos MPN para el anlisis de las aguas de recoleccin de mariscos y crustceos. Incubar los tubos LST a 35 C. Examinar los tubos y las reacciones de registro a 24 2 h de gas, es decir, el desplazamiento de medio en el vial de fermentacin o efervescencia cuando los tubos se agita suavemente. Volver a incubar los tubos de gas-negativos durante 24 h, y examinar y registrar las reacciones de nuevo a las 48 2 h. Realizar la prueba confirmada en todos los supuestamente positivas (gas) tubos. D. MPN - la prueba de coliformes confirmados De cada tubo LST gas, la transferencia de un asa de suspensin a un tubo d caldo BGLB, e evitando la pelcula si est presente. Incubar los tubos BGLB a 35 C y examinar la produccin de gas a 48 2 h. Calcular el nmero ms probable (NMP) (ver Anexo 2) de coliformes basado en la proporcin de confirmarse gas tubos LST de tres diluciones consecutivas. E. MPN - prueba confirmada de coliformes fecales y E. coli De cada tubo de gas LST la prueba presuntiva, la transferencia de un asa de cada suspensin a un tubo de caldo EC (un palo estril aplicador de madera tambin puede ser utilizado para estas transferencias). Incubar los tubos de la CE de 24 2 horas a 45,5 C y examinar la produccin de gas. Si es negativo, reincubate y examinar de nuevo a las 48 2 h. Usar los resultados de esta prueba para el clculo de las heces feca les MPN. Para continuar con la E. coli anlisis, proceder a la seccin F infra. La CE caldo mtodo NMP se puede utilizar para agua de mar y mariscos, ya que se ajusta a los procedimientos recomendados ( 1 ). (Atencin: ver nota siguiente). NOTA: Fecal anlisis de coliformes se realizan a 45,5 0,2 C para todos los alimentos, a excepcin de las pruebas de agua y en los moluscos y crustceos de la cosecha de anlisis de agua, que utiliza una temperatura de incubacin de 44,5 0,2 C. F. MPN - ensayo se realiza para E. coli . Para realizar el ensayo se realiza para E. coli , agitar suavemente cada tubo de gas CE y raya para el aislamiento, un asa para un L-EMB placa de agar y se incuban durante 18-24 horas a 35 C. Examinar las placas para sospechar E. coli colonias, es decir, oscura centrada y plana, con o sin brillo metlico. De transferencia de hasta cinco colonias sospechosas de cada placa L-EMB a sesgos PCA se incuba durante 18-24 horas a 35 C y utilizar para su anlisis posterior. NOTA: La identificacin de cualquier una de las cinco colonias como E. coli es suficiente para considerar que el tubo de la CE como positivo, por lo que no todos los 5 aislados posible que tenga que hacerse la prueba. Realizar la tincin de Gram. Todas las culturas aparecen como Gram-negativas, bacilos cortos deben ser probados para las reacciones IMViC abajo y tambin re-inoculadas de nuevo en LST para confirmar la produccin de gas.

La produccin de indol . Inocular tubos de caldo triptona e incubar 24 2 horas a 35 C. Prueba de indol mediante la adicin de 0,2-0,3 ml de reactivo de Kovacs. Aparicin de distinto color rojo en la capa superior es positivo. Voges-Proskauer (VP)-compuestos reactivos . Inocular tubos de caldo MR-VP e incubar 48 2 horas a 35 C. Transferir 1 ml a 13 mm x tubo de 100. Aadir 0,6 ml solucin -naftol y 0,2 ml de KOH 40% y agitar. Aadir unos cristales de creatina. Agitar y dejar reposar 2 h. Prueba es positiva si eosina color rosado se desarrolla. Rojo de metilo-compuestos reactivos . Despus de la prueba VP, incuba MR-VP tubo adicional de 48 2 horas a 35 C. Aadir 5 gotas de solucin de rojo de metilo a cada tubo. Caracterstico color rojo es positivo. El amarillo es la reaccin negativa. Citrato . Ligeramente inocular tubos de caldo de citrato de Koser; evitar la turbidez detectable.Incubar durante 96 horas a 35 C. El desarrollo de la turbidez es distinta reaccin positiva. De gas de la lactosa . Inocular un tubo de LST e incubar 48 2 horas a 35 C. La produccin de gas (desplazamiento del medio de vial interior) o la efervescencia despus de una ligera agitacin es una reaccin positiva. Interpretacin: Todas las culturas que (a) fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 horas a 35 C, (b) aparecen como bacilos Gram -negativos nonsporeforming y (c) dar a los patrones de IMViC + + - (biotipo 1) o - + - (biotipo 2) se considera que E. coli . Calcular MPN (ver Anexo 2) de E. coli basados en la proporcin de la CE los tubos en tres diluciones sucesivas que contienen E. coli . NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba IMViC, use API20E o el ensayo automatizado VITEK bioqumicas para identificar el organismo como E. coli . Use el crecimiento de la PCA se inclina y llevar a cabo estos ensayos como se describe por el fabricante. G. Mtodo de medio slido - Coliformes Preparar Agar Bilis Rojo Violeta (Vrba) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enfriar a 48 C antes de su uso. Preparar, homogeneizar y diluir la muestra forma decimal como se describe en la seccin I. C por encima de lo que las colonias aisladas se obtiene cuando se siembran. Transferencia de dos alcuotas de 1 ml de cada dilucin a placas de Petri, y el uso de cualquiera de los siguientes dos mtodos verter placas, dependiendo de si las clulas daadas o estresadas se sospecha la presencia de ( 1 ). Vierta 10 mL VRBA templada a 48 C en placas, placas de remolino para mezclar, y dejar que se solidifique. Para prevenir el crecimiento de la superficie y la difusin de las colonias, superposicin con 5 ml VRBA, y dejar que se solidifique. Si la reanimacin es necesario, vierta una capa basal de 80-10 ml de agar de soja trptico templada a 48 C. Placas de remolino para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 0,5 h. Luego de superposicin con 8-10 ml de fundido, se enfra y deja solidificar VRBA. Invertir las placas e incubar solidificado 18-24 horas a 35 C. Incubar los productos lcteos a 32 C ( 2 ). Examinar las placas bajo lupa y con iluminacin. Contador de colonias de color rojo prpura que son de 0,5 mm o ms de dimetro y rode ado por la zona de los cidos biliares precipitado. Las placas deben tener colonias 25-250. Para confirmar que las colonias son los coliformes, escoger por lo menos 10 colonias y traslado a cada uno un tubo de caldo BGLB.Incubar los tubos a 35 C. Examine a las 24 y 48 h para la produccin de gas. NOTA: Si el gas-positivos tubo BGLB muestra una pelcula, lleve a cabo la tincin de Gram para garantizar que la produccin de gas no se debe a bacterias Gram -positivas, fermentan la lactosa bacilos. Determinar el nmero de coliformes por gramo multiplicando el nmero de colonias sospechosas por ciento confirmado en BGLB por el factor de dilucin. Por otra parte, E. coli colonias se pueden distinguir entre las colonias de coliformes en VRBA mediante la adicin de 100 mg de 4-metil- -umbeliferil-D-glucurnido (MUG) por ml en la superposicin VRBA. Despus de la incubacin, observar la fluorescencia azulada alrededor de las colonias bajo la luz de onda larga UV. (Ver LST-MUG la seccin II de la teora y la aplicacin.) H. La filtracin de membrana (MF) Mtodo - coliformes: vase la seccin III. El agua embotellada. NOTA: homogeneizados de alimentos fcilmente obstruir los filtros, por lo tanto, MF son los ms adecuados para el anlisis de muestras de agua, sin embargo MF puede ser , utilizado en el anlisis de los alimentos lquidos que no contengan altos niveles de material particulado.

II. LST-MUG mtodo de deteccin de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados exclusivo de los moluscos bivalvos
El ensayo LST-MUG est basada en la actividad enzimtica de la -glucuronidasa (GUD), que penetra en el substrato de 4 metilumbeliferil -D-glucurnido (MUG), para liberar 4metilumbeliferona (MU).Cuando se expone a onda larga (365 nm) la luz ultravioleta, MU presenta una fluorescencia azulada que se ve fcilmente en el medio o alrededor de las colonias. Ms del 95% de los E. coli produce GUD, incluyendo anaerogenic (no productoras de gas) de las cepas. Una excepcin es enterohemorrgica E.coli (EHEC) del serotipo O157: H7, que es constante SUG negativos ( 11 , 17 ). La falta de fenotipo SUG en O157: H7 se utiliza a menudo para diferenciar este serotipo de otras E. coli , aunque SUG variantes positivas de O157: H7 no existen ( 24 , 26 ). La produccin del SUG, por otros miembros de la familia Enterobacteriaceae es raro, a excepcin de algunos Shigella (44 -58%) y Salmonella (20-29%) ( 18 , 27 ). Sin embargo, la deteccin accidental de estos patgenos por SUG basado en los anlisis no se considera un inconveniente desde el punto de vista de salud pblica. Expresin de la actividad SUG se ve afectado por la represin catablica ( 8 ) para que, en ocasiones, algunos E. coli son SUG-negativas, a pesar de que llevan el uid de un gen ( Gus A) que codifica para la enzima ( 19 ). En la mayora de los anlisis sin embargo, alrededor del 96% de los E. coli cepas analizadas son SUG-positivos sin la necesidad de que la induccin de enzimas ( 27 ). MUG pueden ser incorporados en casi cualquier medio para su uso en la deteccin de E. coli . Sin embargo, algunos medios de comunicacin, como organismo electoral, que contienen compuestos fluorescentes, no son adecuados, ya que la mscara de la fluorescencia de MU. Cuando MUG se incorpora en medio de LST, coliformes pueden ser enumerados en la base de la produccin de gas de la lactosa y E. coli son presuntamente identificados por fluorescencia en el medio bajo la luz de onda larga UV, por lo que es capaz de proporcionar una identificacin presuntiva de E. coli dentro de las 24 h ( 18 , 28 ). El mtodo LST-MUG se describe a continuacin ha sido adoptado como Accin Final Oficial de la AOAC para la prueba de E. coli en los alimentos refrigerados o congelados, con exclusin de los mariscos ( 28 ). Para obtener ms informacin en la taza del ensayo de contacto, el Dr. Peter Feng FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740, 301-436-1650. PRECAUCIN: Para observar la fluorescencia, examinar inoculados MUG LST-tubos en onda larga (365 nm) la luz ultravioleta en la oscuridad. Un nio de 6 vatios de mano de la lmpara UV es adecuada y segura. Cuando se utiliza una fuente de UV ms potente, como una lmpara de 15 vatios fluorescente, usar gafas protectoras o gafas protectoras. Asimismo, antes de su uso en ensayos de MUG, examinar todos los tubos de vidrio para la fluorescencia de automviles. xido de cerio, que a veces se aade al vidrio como medida de control de calidad, presenta fluorescencia bajo la luz ultravioleta e interferir con la prueba de MUG ( 25 ). El uso de cepas de control positivo y negativo para la reaccin MUG es esencial. 1. Equipo y material: ver la seccin IA anterior y, adems, los tubos son nuevos y desechables de vidrio de borosilicato (100 x 16 mm) . nuevos y desechables de vidrio borosilicato viales Durham (50 x 9 mm) para la recoleccin de gas de la lmpara UV de onda larga, de 6 vatios o equivalente 2. Medios y reactivos: ver la seccin IB 3. Presunta LST-MUG prueba para E. coli. Preparar las muestras de alimentos y realizar la prueba presuntiva MPN como se describe en la seccin IC anterior, excepto el uso MUG LST-tubos en lugar de LST. Asegrese de inocular un tubo de LST-MUG con un conocido SUG-positivas E. coli aislar control positivo (ATCC 25922). Adems, vacunar a otro tubo con una cultura de Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) como control negativo, para facilitar la diferenciacin de los tubos de muestra que muestran un crecimiento de slo aquellos que muestran el crecimiento y la fluorescencia. Incubar los tubos de 24 a 48 2 horas a 35 C. Examine cada tubo para el crecimiento (turbidez, gas) y luego examinar los tubos en la oscuridad bajo la lmpara UV de onda larga (365 nm). Una fluorescencia azulada es un resultado positivo presuntivo de E. coli . Los estudios realizados por Moberg et al. ( 28 ) muestran que un 24 h lectura de la fluorescencia es un indicador preciso de la E. coli y se pueden identificar 83-95% de la E. coli positivas tubos. Despus de 48 h de incubacin, 96 a 100% de los E. coli -positivos los tubos pueden ser identificados ( 28 ).Realizar una prueba confirmada en todos los tubos positivos presuntivos por rayar un asa de la suspensin de cada tubo fluorescente en L -EMB agar e incubar 24 2 horas a 35 C. Seguir los protocolos descritos en I. F, por encima, para la prueba completada por E. coli . Calcular NMP de E. colibasada en la combinacin de tubos fluorescentes confirm en tres diluciones sucesivas.

III. Examen de Agua Embotellada

Consumo de agua embotellada est aumentando rpidamente en todo el mundo. Slo en los EE.UU., ms de 3,6 millones de galones de agua embotellada consumida en 1998 (Asociacin Internacional de Agua Embotellada, Alexandria, VA). A diferencia del agua potable, que est regulada por la EPA de los EE.UU., el agua embotellada es la calificacin legal de alimentos en los EE.UU. y regulados por la FDA (Federal Register 1995 21 CFR Parte 103 y otros bebidas: agua embotellada, la regla final 60 (.... 218) 57.076 a 57.130). La FDA define el agua embotellada como "el agua que se destina para el consumo humano y que est sellado en botellas u otros recipientes, sin ingredientes aadidos, excepto que pueden contener agentes antimicrobianos seguro y adecuado" y, dentro de los lmites, un poco de fluoruro aadido. El agua embotellada puede ser utilizado como una bebida por s solo o como ingrediente en otras bebidas. Estas normas no se aplican a los refrescos o bebidas similares. Adems de "agua embotellada" o "agua potable", en la FDA 21 CFR Part 103 tambin define varios tipos de agua embotellada que cumplan con ciertos criterios. Estas identidades son "agua de pozo artesiano o artesanal", "agua subterrnea", el agua mineral "," agua purificada o desmineralizada "," agua embotellada espumoso "," agua d manantial e "y" agua de pozo ". Adems" agua estril "se define como el agua que cumpla con los requisitos establecidos en la "prueba de esterilidad" en la Farmacopea de los Estados Unidos. Organismos coliformes no son necesariamente los agentes patgenos y rara vez se encuentran en el agua embotellada, sin embargo, sirven como un indicador de contaminacin o insalubridad posible.Las encuestas han demostrado que los coliformes son indicadores tiles de la calidad del agua embotellada, pero algunos pases ta mbin monitorear las poblaciones microbianas adicionales como indicadores de calidad de las botellas de agua ( 10 , 33 ). Bajo el actual estndar de calidad del agua embotellada, la FDA ha establecido un requisito de la calidad microbiolgica que se basa en los niveles de deteccin de coliformes. Estos niveles se pueden obtener por filtracin en membrana (MF) o por el anlisis MPN de 10 tubos de 10 ml diez unidades de anlisis. Para obtener informacin sobre los mtodos de contacto con el agua embotel ada Dr. Peter Feng , FDA, CFSAN, l College Park, MD, 20740, 301-436-1650. 1. Equipos y Materiales. a. Incubadora a 35 0,5 C. b. Unidades de filtracin por membranas (la base del filtro y el embudo): vidrio, plstico o acero inoxidable, envuelto en papel de aluminio o de papel y esterilizado. c. Cmara de esterilizacin ultravioleta para esterilizar la base del filtro y el embudo (opcional). d. Un filtro mltiple o termo para mantener embudos de filtracin. e. Fuente de vaco (la lnea de vaco, bomba de vaco elctrica o aspirador de agua). f. Los filtros de membrana, estril, blanco, cuadriculado dimetro, 47 mm, tamao del poro 0.45 micras (o su equivalente, segn lo especificado por el fabricante) para el recuento de bacterias. g. Placas de Petri, estril, de plstico, 50 x 12 mm, con tapas bien ajustadas. h. Pinzas diseadas para la transferencia de las membranas sin sufrir daos. 2. Los medios de cultivo. a. Lauril sulfato triptosa (LST) de caldo ( M-76 ). b. Verde brillante lactosa bilis caldo (BGLB) ( M-25 ). c. M-Endo LES medio o Agar Endo (para la formulacin vase el mtodo estndar para el Examen de Agua y Aguas Residuales, 1998, 20 ed, p. 9 -58 ( 3 ). 3. Diez tubos MPN coliformes prueba -. Procedimientos presuntivos y confirmados por examen de rutina de agua embotellada, toma 100 ml de muestra e inocular 10 tubos r de 2X LST (10 ml de medio) con 10 ml de muestra sin diluir cada uno. Incubar los tubos a 35 C.Examinar los tubos a 24 2 h para el crecimiento y la formacin de gas como se evidencia por el desplazamiento del medio en el vial de fermentacin o efervescencia cuando los tubos se agita suavemente. Si es negativo a las 24 h, los tubos de reincubate durante 24 h, y examinar de nuevo para el gas. Realizar una prueba confirmada en todos los supuestamente positivas (gas) tubos de la siguiente manera: agitar suavemente cada tubo LST positivo y, con un 3,0 a 3,5 mm asa estril, la transferencia de uno o ms loopfuls de suspensin a un tubo de caldo BGLB.Estril palos aplicador de madera tambin puede ser utilizado para la transferencia mediante la insercin de al menos 2,5 cm en el caldo de cultivo. Incubar los tubos BGLB durante 48 2 horas a 35 C. Examine para la produccin de gas y de registro. Calcular MPN con 10 tubos MPN tabla (9221.III), p. 9-52, los mtodos estndar para el Anlisis de Aguas y Aguas Residuales ( 3 ). 4. Mtodo de filtro de membrana para coliformes. Filtro de 100 ml de muestra y trasladar el filtro de M-Endo LES medio o Agar Endo e incubar a 35 C durante 22-24 h. Contar las colonias que son de color rosa a rojo oscuro

IV. El examen de carne de mariscos y moluscos

con un brillo de la superficie verde metlico. El brillo puede variar de precisar para completar la cobertura de la colonia. . El uso de un bajo consumo de energa, la diseccin de tipo microscopio para examinar los filtros se recomienda la confirmacin - Si hay de 5 a 10 colonias en el filtro de brillo, confirmar todos mediante la inoculacin de crecimiento de cada colonia brillo en los tubos de LST y se incuba a 35 C para 48 h. Si el nmero de colonias de brillo superior a 10, al azar seleccionar y confirmar las 10 colonias que son representativos de todas las colonias de brillo. Cualquier tubos de gas deben ser positivas LST sub culto a BGLB y se incuba a 35 C durante 48 horas. La produccin de gas en BGLB en las 48 horas es una prueba de coliformes confirmados. Informe de resultados como el nmero de colonias de coliformes por 100 ml. NOTA : El mtodo estndar de 1998, 20 ed, p. 9-60 ( 3 ), permite la inoculacin simultnea de LST y BGLB durante la verificacin. Sin embargo, es algo BGLB inhibitoria lo que el mtodo descrito anteriormente, donde las muestras se sub cultivadas a partir de LST en BGLB es considerado como un ensayo de verificacin ms sensibles y por lo tanto, recomend.

El procedimiento oficial de la FDA para el anlisis bacteriolgico de la nacional y de importacin de moluscos bivalvos es la forma correcta y completa se describe en la APHA procedimientos recomendados por el examen del agua de mar y mariscos , 4 ed. 1970 ( 1 ). Los mtodos, incluyendo el convencional de 5 tubos MPN para coliformes, coliformes fecales y el recuento total en placa estndar para las bacterias (ver captulo 3 ), se describen a continuacin para el examen de acciones cscara, frescos, carnes si concha, n dulce sin concha mariscos congelados y mariscos congelados en su concha. Estos procedimientos no se aplican a la exploracin de los crustceos (cangrejos, langostas y camarones) o carnes procesadas, tales como mariscos empanizados, productos de c oncha, pre-cocinados, procesados y el calor. Adems, muchos mtodos que se utilizan para las pruebas de agua del medio ambiente o para las aguas de la cosecha de mariscos no se cubren aqu. Anlisis ambientales del agua se realiza por la EPA de los EE.UU. ( 3 ) y la calidad de las aguas de la cosecha de mariscos son principalmente las responsabilidades de las autoridades de cada Estado de control de mariscos ( 20 ). 1. Preparacin de la muestra Utilizando 10-12 mariscos, obtener 200 g de licor de mariscos y carnes. Mezcla 2 min, con 200 ml tampn fosfato estril dilucin con agua, o el 0,5% de peptona para obtener una dilucin 1:2 de la muestra. El anlisis de la muestra de suelo debe comenzar dentro de dos minutos despus de mezclar. Hacer diluciones seriadas en el 0,5% de agua de peptona estril o estril tamponada con fosfato agua de dilucin. 2. MPN - Prueba presuntivos y confirmados por coliformes Use caldo de lactosa (M74) o lauril triptosa Caldo (M76), a la fuerza solo en volmenes de 10 ml.Inocular la siguiente manera: a. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml del homogenado mezclado (equivalente a 1 g de marisco). b. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de una dilucin de 1:10 de homogeneizado (0,1 g de mariscos). c. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de la dilucin 1:100 del homogeneizado (0,01 g de mariscos). d. Para cada uno de cinco tubos, agregar 2 ml de la dilucin 1:1000 de homogeneizado (0,001 g de mariscos). Diluciones que puedan ser necesarias para evitar resultados indeterminados. Incubar los tubos a 35 C y siga las instrucciones en la Seccin 1.C y realizar una prueba confirmada como en 1.D anteriormente en "Mtodo convencional de coliformes, coliformes fecales y E. coli ". Calcular MPN como se describe en la seccin 1.D anterior, excepto que el anlisis de los mariscos se especifica que la densidad de coliformes se expresa como NMP por 100 g de muestra en lugar de por g. 3. MPN - Prueba presuntivos y confirmados de coliformes fecales en los mariscos Realizar la prueba presuntiva como se describe en la seccin 2. Para confirmar los tubos positivos, la transferencia de un asa de los tubos de gas LST positivo de la CE caldo y se incuba en un bao de agua cubierta circular de 44,5 0,2 C durante 24 2 horas. La produccin de gas en la CE es un resultado positivo confirmado de coliformes fecales. Calcular el MPN para los coliformes fecales como se describe ms arriba para coliformes. 4. MPN - EC-MUG Mtodo para la determinacin de E. coli en carne de mariscos El ensayo MUG de -glucuronidasa (GUD) se ha descrito anteriormente para la deteccin de E.coli en los alimentos refrigerados y congelados tambin se puede utilizar para las

V. Anlisis de E. coli en los zumos de ctricos

pruebas de E.coli en carne de mariscos, pero con ligeras modificaciones. Esto se debe al hecho de que los alimentos, como carnes mariscos contienen actividad SUG natural ( 32 ). Como resultado, las ostras homogeneizado inoculado directamente en los tubos LST-MUG en la fase presuntiva de la prueba de MPN puede provocar falsas reacciones positivas de fluorescencia. Por lo tanto, en el anlisis de E. coli en carne de mariscos, el reactivo MUG se aade al medio de la CE y utilizado en la fase de confirmacin de la prueba. Los tubos de EC-MUG, se incubaron a 44,5 C, se puede utilizar en la fase de confirmacin de una prueba de MPN convencionales de 5 tubos para determinar niveles de coliformes fecales en carne de mariscos, a continuacin, mediante el examen de los tubos de fluorescencia en UV de onda larga, una E. coli MPN tambin se pueden obtener fcilmente ( 32 ). Vea la seccin 1.A y 1.B por encima de los materiales y reactivos necesarios. Usar comercialmente preparados deshidratados CE-MUG, o preparar el medio mediante la adicin de MUG a caldo EC (0,05 g / L) (M50). Varias fuentes de compuestos son adecuados MUG: Marcor Development Corp., Hackensack, NJ; Biosynth Internacional, Skokie, IL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO y Qumica Hach, Loveland, Colorado Dispense 5 ml en nuevas vidrio de borosilicato desechables tubos (100 x 16 mm) qu e contiene, nuevos desechables de vidrio borosilicato Durham viales (50 x 9 mm) para la recoleccin de gas. Esterilizar CE-MUG tubos de caldo de cultivo a 121 C durante 15 min; almacenar hasta 1 semana a temperatura ambiente o hasta un mes en refrigeracin. Realice la prueba de 5 tubos MPN presuntivos y confirmados de coliformes fecales en los mariscos como se describe en la Seccin 3, excepto el uso de AE-MUG tubos en lugar de la CE para el test de confirmacin. Determinacin de la fluorescencia en el EC-MUG caldo requiere el uso de 3 tubos de control, uno inoculado con E. coli como control positivo, con una K. pneumoniaecomo control negativo, y un tubo sin inocular como EC-MUG control de lotes medianos. Se inoculan los controles positivos y negativos en el momento de la prueba confirmada es que se realiza y se incuban los tubos a 44,5 C 0,2 C durante 24 h. Leer la fluorescencia como se describe ms arriba en ensayo LST-MUG. Tenga en cuenta que algunos (<10%) E. coli son anaerogenic (gas-negativo), pero debe ser MUGpositivos. Incluir todos los tubos de fluorescencia positiva en el E. coli clculos MPN. Determinar E. coli MPN de las tablas usando una combinacin de fluorescencia de tubos positivos en cada dilucin.

Anlisis de E. coli se ha implementado para identificar los jugos potencialmente contaminados o para verificar la eficacia del sistema de HACCP en el procesamiento de los jugos no pasteurizados (21 CFR Parte 120, vol. 66, N 13, 19 de enero de 2001). El mtodo estndar utilizado para las pruebas de E.coli es el MPN sin embargo, no parece adecuada para las pruebas de jugo debido a la acidez (pH 3,6 a 4,3) de los jugos, los cuales pueden interferir con el examen, adems de que slo se permite para las pruebas de 3,33 ml de muestra. A diferencia de la mayora de los E. coli mtodos, que son los ensayos de la enumeracin, el mtodo que sigue es un simple presencia / ausencia de pruebas que pueden examinar a 10 ml de volumen de los zumos ( 34 , 35 ). Este ensayo, designado como modificado ColiComplete (CC) Mtodo, es una modificacin del mtodo de la AOAC oficial 992.30, que utiliza para la deteccin de MUG E. coli (vase la seccin sobre la LST-MUG Mtodo para ms detalles). 1. Equipos y materiales o Cubiertos bao de agua, con sistema de circulacin para mantener la temperatura de 44,5 0,2 C. El nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos. o Incubadora, 35 0,5 C o La luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W. 2. Medios y reactivos: Universal Preenrichment caldo (UPEB) (M188) o se pueden comprar de Difco Laboratories, Detroit, MI CE medio ( M49 ) ColiComplete (CC) discos - Biocontrol, Bellevue, WA 3. Preparacin de la muestra, el enriquecimiento y el anlisis Realizar anlisis por duplicado. Aspticamente, inocular 10 mL porcin de jugo en 90 ml de la UPEB y se incuba a 35 C durante 24 h. Despus del enriquecimiento, la mezcla y la transferencia de 1 ml de cada caldo de enriquecimiento UPEB en 9 ml de caldo de CE contiene un disco de CC. Incubar CE / CC tubos de caldo de cultivo a 44,5 C en un bao de agua circulante durante 24 h. Incluye un tubo inoculado con una taza (+) E. coli cepa de control positivo y otro con K. pneumoniae como control negativo. Examinar los tubos en la

VI. Otros mtodos para la enumeracin de coliformes y E. coli

oscuridad y bajo la luz ultravioleta de onda larga. La presencia de fluorescencia azul en cualquiera de los tubos es indicativo de que E. coli est presente en la muestra. Nota: Los discos de CC tambin contienen X-gal, que cuando se divide por -galactosidasa dar color azul o en el disco. Esta reaccin es anloga a la medicin de cido / produccin de gas de la fermentacin de la lactosa por lo tanto, la presencia de color azul es indicativo de coliformes.

Con fines de informacin y referencia que hay una tabla en el Apndice I, que contiene una lista parcial de los ensayos disponibles en el mercado, muchos de los cuales utiliza reactivos fluorognico como MUG u otros sustratos cromognicos para la deteccin e identificacin presuntiva de coliformes yE. coli en los alimentos. Muchas de estas pruebas, como el Petrifilm rehidratable pelcula seca, la membrana de filtro de membrana hidrofbica / MUG (HGMF / MUG) mtodo ( 13 ), ColiComplete disco (16 ), etc, han sido evaluadas por los estudios en colaboracin y adoptado como oficial de primera o accin final de la AOAC. Tambin hay muchas modificaciones de los ensayos de filtracin por membranas que se han desarrollado para la prueba de coliformes, coliformes fecales y E. coli y algunas de ellas pueden ser tiles para pruebas de alimentos como la leche y las bebidas, pero se utilizan sobre todo para el agua, las aguas del medio ambiente, y la cosecha de mariscos aguas anlisis ( 5 , 7 , 20 , 22 , 23 , 31 ).

Referencias
1. 2. 3. 4. 5. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1970. Procedimientos recomendados para el examen del agua de mar y mariscos, 4 ed. APHA, Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1992. En: Marshall, RT (ed). Mtodos Standard para el Examen de Productos Lcteos, 16 ed. APHA. Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1998. Mtodos Standard para el Examen de Agua y Aguas Residuales 20a ed. APHA, Washington, DC. Asociacin Americana de Salud Pblica. 1992. Compendio de Mtodos para el examen microbiolgico de los alimentos, 3 ed. APHA, Washington, DC. Brenner, KP, CC Rankin, Sivaganesan M., y Scarpino PV. 1996. La comparacin de los porcentajes de recuperacin de Escherichia coli y coliformes totales de agua potable por el mtodo de agar MI y la proteccin Ambiental de los EE.UU. aprobado por la Agencia mtodo de filtro de membrana.Appl. Environ. Microbiol. 62 :203-208. Caplenas, NR y Kanarek MS. 1984. Termotolerantes no fecal fuente de Klebsiella pneumoniae :. validez de la prueba de coliformes fecales en las aguas de recreo soy. Salud Pblica J.. 74 :1273-1275 Ciebin, BW, MH Brodsky, R. Eddington, Horsnell G., A. Choney, Palmateer G., A. Ley, Joshi R. y G. Shears. 1995. Evaluacin comparativa de modificar m-FC y los medios de comunicacin m-TEC para el recuento de filtro de membrana de Escherichia coli en el agua. Appl. Environ. Microbiol. 61:3940-3942. Chang, GW, J. Brill, y Lum R.. 1989. Proporcin de beta-glucuronidasa negativa Escherichia coli en muestras fecales humanas. Appl. Environ. Microbiol. 55 :335-339. Conway, PL 1995. Ecologa microbiana del intestino grueso humano. En: GR Gibson y GT Macfarlane, eds. p.1-24. Las bacterias del colon humano: el papel de la nutricin, la fisiologa y la patologa. CRC Press, Boca Raton, FL. Dege, NJ 1998. Categoras de agua embotellada. Captulo 3, En: DAG Senior y PR Ashurst (ed).Tecnologa del agua embotellada. CRC Press, Boca Raton, Florida. Doyle, MP y JL Schoeni. 1987. Aislamiento de Escherichia coli O157: H7 a partir de carnes al por menor y aves de corral. Appl. Environ. Microbiol. 53 :2394-2396. Eijkman, C. 1904. Mueren garungsprobe bei 46 als hilfsmittel bei der trinkwasseruntersuchung.Zentr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. I. Orig. 37 : 742. Entis, P. 1989. Membrana hidrofbica cuadrcula de filtro / MUG mtodo para coliformes totales yEscherichia coli enumeracin de los alimentos: estudio en colaboracin. J. Assoc. Off. Anal. Chem.72 :936-950. Escherich, T. 1885. Mueren darmbakterien des neugeborenen und sauglings. Fortshr. Med. 3 :5-15-522, 547-554. Ewing, WH 1986. Identificacin de Edwards y Ewing de Enterobacteriaceae , 4 ed. Elsevier, Nueva York. Feldsine, PT, MT Falbo-Nelson, y Hustead DL. 1994. ColiComplete sustrato de apoyo mtodo de disco para la deteccin confirmada de coliformes totales y Escherichia coli en todos los alimentos:. estudio comparativo J. Assoc. Off. Anal.Chem. 77 :58-63. . Feng, P. 1995 Escherichia coli serotipo O157: H7:. vehculos nuevos de infeccin y de las variantes fenotpicas aparicin emergentes enfermedades infecciosas. 1 :16-21.

6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

18. Feng, PCS y Hartman PA. 1982. Ensayos fluorognicos para la confirmacin inmediata de laEscherichia coli . Appl. Environ. Microbiol. 43 :1320-1329. 19. Feng, P., R. Lum, y G. Chang. 1991. Identificacin de uid A secuencias de genes en beta-Dglucuronidasa (-) Escherichia coli . Appl. Environ. Microbiol. 57 :320-323. 20. FDA. 1998. Pescado y productos pesqueros Peligros y Control de Gua. 2 ed. Oficina de Mariscos, CFSAN, FDA de los EE.UU., Servicio de Salud Pblica, Departamento de Salud y Servicios Humanos, Washington DC. 21. Frampton, EW y restaino L.. 1993. Los mtodos para E. coli identificacin en muestras de alimentos, agua y clnicas basadas en la deteccin de betaglucuronidasa. J. Appl. Bacteriol. 74:223-233. 22. Geissler, K., M. Manafi, I. Amors, JL y Alonso. 2000. La determinacin cuantitativa de coliformes totales y Escherichia coli en las aguas marinas con los medios cromognicos y fluorognicos. J.Appl. Microbiol. 88 :280-285. 23. Grant, MA 1997. Una nueva membrana medio de filtracin para la deteccin simultnea y enumeracin de Escherichia coli y coliformes totales. Appl. Environ. Microbiol. 63 :35264530. 24. Gunzer, F., H. Bohm, H. Russmann, Bitzan M., Aleksic S. y H. Karch. 1992. Deteccin molecular de la fermentacin de sorbitol Escherichia coli O157 en pacientes con sndrome urmico hemoltico. J.Clin. Microbiol. 30 :1807-10. 25. Hartman, PA 1989. El MUG (glucuronidasa) prueba de Escherichia coli en los alimentos y el agua, pp 290-308. En: Mtodos rpidos y automatizacin en microbiologa e inmunologa. A. Balows, Tilton RC, y Turano A. (eds). Brixia Academic Press, Brescia, Italia. 26. Hayes, PS, K. Blom, Feng P., J. Lewis, Strockbine NA, y Swaminathan B.. 1995. Aislamiento y caracterizacin de una cepa de -D-glucuronidasa productora de Escherichia coli O157: H7. en los Estados Unidos J. Clin. Microbiol. 33 :3347-3348. 27. Manafi, M. 1996. Sustratos enzimticos cromognicos y fluorognicos en medios de cultivo y pruebas de identificacin. Int. J. Food Microbiol. 31 :45-58. 28. Moberg, LJ, MK Wagner, y Kellen LA. 1988. Ensayo fluorognico para la deteccin rpida deEscherichia coli en los alimentos refrigerados y congelados. estudio en colaboracin J. Assoc. Off.Anal. Chem. 71 :589-602. 29. Neill, MA, Tarr PI, Taylor DN, y Trofa AF. 1994. Escherichia coli . En Manual de Enfermedades de Transmisin Alimentaria, YH Hui, Gorham JR, Murell KD, y DO Cliver, eds. Marcel Decker, Inc. de Nueva York. pp 169-213. 30. Neufeld, N. 1984. Procedimientos para el examen bacteriolgico del agua de mar y mariscos. En: Greenberg, EA y DA Hunt (eds). 1984. Procedimientos de laboratorio para el examen del agua de mar y mariscos, 5 ed. Asociacin Americana de Salud Pblica. Washington, DC. 31. Rippey, SR, WN Adams, y Watkins WD. 1987. La enumeracin de los coliformes fecales y E. coli en las aguas marinas andestuarine: una alternativa a la APHA-MPN enfoque. J. Agua Pollut. Control de la Reserva Federal. 59 :795-798. 32. Rippey, SR, LA Chandler, y Watkins WD. 1987. Mtodo fluoromtrico para la enumeracin deEscherichia coli en los moluscos. J. Prot alimentos. 50 :685-690, 710. 33. Warburton, DW 2000. Metodologa para la deteccin de agua embotellada por la presencia de los indicadores y las bacterias patgenas. Alimentos y Microbiologa. 17 :3-12. 34. Weagant, SD y P. Feng. 2001. Evaluacin comparativa de un mtodo rpido para la deteccin deEscherichia coli en el jugo de naranja artificial contaminada. FDA Boletn de Informacin de Laboratorio # 4239, 17:1-6. 35. Weagant, SD y P. Feng. 2002. Anlisis comparativo de una modificacin rpida de Presencia-Ausencia de prueba y el mtodo estndar para detectar MPN Escherichia coli en jugo de naranja.Alimentos y Microbiologa. 19 :111-115. Fuente hipertexto: Manual de anlisis bacteriolgicos, 8 Edicin, Revisin A, 1998. Captulo 4.