Transesterificao Enzimtica do Azeite de Oliva em Presena de Etanol

Joo Henrique Dantas1, Leandro Daniel De Paris1, Carlos Eduardo Baro1, Flvio Faria de Moraes1, Gisella Maria Zanin1
Universidade Estadual de Maring Departamento de Engenharia Qumica Av. Colombo, 5790. Jd. Universitrio. Maring- PR - E-mail: carlosedubarao@yahoo.com.br
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RESUMO Neste trabalho foi investigada a reao de transesterificao enzimtica do azeite de oliva em presena de etanol como modelo das reaes de produo de biodiesel. As reaes foram conduzidas em reator batelada, empregando-se quatro diferentes enzimas livres (lpase de Thermomyces lanuginosus, lpase de pncreas suno tipo II, lpase Amano PS de Burkholderia cepacia e lpase de Candida rugosa), sendo realizadas com uma razo molar leo:lcool de 1:6, a 37 C, por 72 h. A adio do etanol reao foi feita em trs etapas (0, 12 e 24 h) e os steres de etila formados foram quantificados por CLAE. Realizou-se tambm a determinao da atividade de transesterificao das enzimas pela reao de formao do 2-fenetil acetato. Todos os resultados indicaram que as enzimas mais eficientes foram a Thermomyces lanuginosus e a lpase Amano PS, com rendimento de produo em steres de 71,3% e 68,5%, respectivamente. Palavras-chave: Biodiesel, Azeite de Oliva, Lpase, CLAE. INTRODUO O esgotamento das reservas e o aumento dos preos so a fora motriz para a substituio dos combustveis de origem fssil pelos de origem renovvel (Royon et al., 2007). Em especial o petrodiesel, obtido da destilao do petrleo, est amplamente inserido em atividades estratgicas de todos os pases, e para evitar um colapso na economia mundial, sua substituio deve ser realizada seguindo algumas diretrizes. Esta etapa deve ser gradual, tecnicamente aceitvel, economicamente competitiva, menos poluente e prontamente aplicvel (Martn-Hernndez et al., 2008). O biodiesel atende a todas essas diretrizes, tornando-se uma boa alternativa na substituio ao diesel convencional. O biodiesel definido como um combustvel de origem renovvel, derivado de biomassa, para utilizao em motores de combusto interna. No Brasil regulamentado como sendo steres alqulicos de cidos graxos de cadeia longa, derivado de leos vegetais ou gordura animal (ANP, 2004). Este biocombustvel pode ser adicionado em fraes gradualmente crescentes ao diesel, sem qualquer prejuzo qualidade do combustvel ou de componentes mecnicos dos

motores. Alm disso, menos poluente pelo fato de no emitir particulados ou compostos derivados de enxofre. A reao de produo dos steres alqulicos derivados de leos pode ser realizada por rotas cidas, bsicas, supercrticas ou enzimticas. As rotas cidas e bsicas esto amplamente desenvolvidas e j so empregadas em processos industriais consolidados, porm apresentam desvantagens, como a necessidade de adio de reagentes em excesso, concentrados e livres de gua, formao de sabes, purificao complexa dos produtos e contaminao dos subprodutos. Por outro lado, as reaes conduzidas por rota enzimtica apresentam algumas vantagens sobre as rotas convencionais, principalmente relacionadas utilizao de meios reacionais menos concentrados e menos agressivos, no formao de sabes e purificao dos produtos e subprodutos menos complexa (Shimada et. al., 2002). A reao de transesterificao para a produo de biodiesel a partir de leos e gorduras, em presena de etanol, promove a transformao de um trister (triglicerdeos) em um monoster (etilato de acila). Esta reao pode ser catalisada em condies especficas por um grupo de enzimas, as lpases. As lpases (glicerol-ster-hidrolases, E.C.3.1.1.3) so enzimas hidrolticas encontradas em diversos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e bactrias. Em seu ambiente natural, estas enzimas catalisam reaes de hidrlise, acidlise, alcolise, esterificao e transesterificao (Paiva, et al., 2000). No entanto, possvel configurar o meio reacional de forma que na sua atuao catalise apenas um tipo de reao. No caso da transesterificao, o meio reacional deve possuir mnimas quantidades de gua, ao contrrio da reao de hidrlise, na qual o meio deve possuir quantidade significativa de gua (Sotoft et al., 2010). No entanto, dependendo do microrganismo produtor da lpase, podem-se observar diferentes nveis de seletividade da enzima para um tipo de reao, e na maioria das vezes, mesmo em um meio reacional propcio, no h condies favorveis suficientes para a obteno do produto de interesse, muitas vezes gerando um rendimento de reao muito baixo. Assim, torna-se importante estudar a reao de produo de biodiesel por rota enzimtica, para avaliar o mecanismo e cintica da reao, com a finalidade de desenvolver uma aplicao industrial economicamente vivel (Sotoft et al., 2010). Diante desta perspectiva, o presente trabalho estudou como modelo das reaes de produo do biodiesel, a reao de transesterificao do azeite de oliva com etanol absoluto, catalisada por quatro diferentes enzimas livres. As reaes foram conduzidas em reatores batelada, com temperatura (37 C), razo molar entre leo:lcool (1:6) e quantidade de enzima (5% em massa, em relao ao leo). O etanol empregado na reao foi adicionado em trs etapas, e a quantificao de etil steres de cidos graxos formados foi realizada por meio de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), com padronizao externa. MATERIAL E MTODOS As enzimas utilizadas nas reaes de transesterificao foram a lpase de Thermomyces lanuginosus, lpase de pncreas suno tipo II (Porcine Pncreas), lpase Amano PS, de Burkholderia cepacia e lpase de Candida rugosa, todas adquiridas da Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). O azeite de oliva (Carbonell) foi adquirido em mercado local. O etanol P.A. foi adquirido da empresa Synth (So Paulo, Brasil). O equipamento de cromatografia lquida de alta eficincia da marca Varian modelo 920-LC, com bomba quaternria, operado com coluna ODS-C18 (Thermo Scientific, com 250 mm de comprimento, dimetro de 4,6 mm e dimetro de partcula de 5 m. Todos os reagentes

utilizados (acetonitrila, 2-propanol, n-hexano, lcool 2-fenetlico, acetato de vinila e 2-fenetil acetato) so de grau de pureza para CLAE e foram adquiridos da Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) assim como os padres de mono, di, triolena e ster de metila. A gua foi purificada por destilao, seguida por deionizao em coluna de troca inica, e ento filtrada e deionizada novamente em Milli-Q. Foram realizadas medidas de atividade em ster (produo de steres por grama de enzima em relao ao tempo), e de atividade em triacilgliceris (consumo de triacilgliceris por grama de enzima em relao ao tempo). DETERMINAO DA ATIVIDADE DE TRANSESTERIFICAO PELA PRODUO DO 2-FENETIL ACETATO A atividade de transesterificao (Amano, 2004) na reao de lcool 2-fenetlico com acetato de vinila foi medida em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) coluna ODSC18, detector UV-VIS a 254 nm e fase mvel de mistura de acetonitrila e gua (42:58), temperatura ambiente, injeo de 20 L e vazo de 0,5 mL.min-1. A mistura reacional foi preparada adicionando-se 0,6 mL de lcool 2-fenetlico, 2,4 mL de acetato de vinila e 20 mg de enzima e mantida sob agitao por 20 min a 37 C. Aps, pipetou-se 0,1 mL da mistura e adicionou-se 6,9 mL de ter isoproplico para a dosagem dos produtos em CLAE. As atividades foram expressas em U/g, (U = mol/min), sendo que g refere-se massa da lpase livre e mol ao produto de transesterificao, 2-fenetil acetato. SNTESE DE BIODIESEL Os ensaios para a sntese de biodiesel a partir do azeite de oliva foram conduzidos a 37 C, em reatores batelada encamisados, de 30 mL. Amostras foram retiradas do meio reacional em duplicata, de forma que o volume total do reator no final do experimento fosse de 90% em relao ao volume inicial. A razo molar lcool/leo foi de 6:1, e o etanol foi adicionado em trs etapas igualmente distribudas, sendo a primeira alquota adicionada no incio da reao, a segunda com 12 horas e a terceira com 24 horas. O tempo total de reao foi de 72 horas. A quantidade de biocatalisador utilizado foi de 5% em massa, em relao ao leo, para os quatro experimentos. CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) Para a identificao dos triacilgliceris, diacilgliceris, monoacilglicers e steres foi utilizado o mtodo de gradiente combinado linear aquoso-orgnico/no-aquoso, descrito por Holcapek et al. (1999). Este mtodo consiste na construo de um gradiente ternrio com tempo total de 30 minutos, dividido em duas etapas, uma de separao (aquosa/orgnica) e outra de eluio (no-aquosa), composto por gua ultra pura (A), acetonitrila (B) e uma soluo 5:4 (v/v) de iso-propanol/hexano (C). A condio inicial foi de 30% de A + 70% de B, 100% de B em 10 min, 50% de B + 50% de C em 20 min, seguida por 5 min de eluio isocrtica de 50% de B e 50% de C. Nos ltimos 5 min foi retomado o gradiente inicial (30% de A + 70% de B), para restabelecer as condies iniciais de operao da coluna. A coluna foi operada a 40 C, com deteco UV-VIS a 205 e 210 nm, com injeo de 20 L e vazo de 1,0 mL min-1. As curvas de calibrao foram construdas a partir de diluies consecutivas das misturas de padres de acilgliceris e a quantificao foi realizada somando-se as reas relativas s espcies qumicas comuns, submetidas curva de calibrao. Os grupos de espcies qumicas foram selecionados a partir de estudos de reviso bibliogrfica dos

trabalhos de Holcapek et al. (1999), Trkan et al. (2006), Di Nicola et al. (2008) e com base na anlise dos cromatogramas obtidos dos padres de acilgliceris. RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados obtidos para a atividade de transesterificao das enzimas livres so apresentados na Tabela 1. Todas as enzimas apresentam atividades semelhantes, com exceo da lpase Porcine pncreas, com resultado um pouco inferior em relao s demais enzimas. Tabela 1: Atividades de transesterificao das enzimas livres (A). Enzima (A) (mol/g enzima.min) Thermomyces lanuginosus 3298,8 Amano PS 3018,5 Candida rugosa 3154,2 Porcine pncreas 2655,5 A enzima lpase de Thermomyces lanuginosus (TL) apresentou os melhores resultados, tanto de rendimento quanto em atividade de ster, seguida da lpase Amano PS de Burkholderia cepacia. A lpase de Candida rugosa (CR) e a lpase Porcine pncreas (PP) apresentaram resultados inferiores aos verificados pelas enzimas citadas anteriormente. Os dados so apresentados na Tabela 2. Tabela 2: Valores de atividade e rendimento em relao produo de steres de acila e consumo de triacilgliceris. Atividade em Atividade em Rendimento Converso em Enzima ster Triacilgliceris em ster Triacilgliceris (mol/g.s) (mol/g.s) (%) (%) 316,67 200,00 71,3 86,4 Thermomyces lanuginosus 66,67 33,33 68,5 100 Amano PS 33,33 16,67 7,7 9,5 Candida rugosa 16,67 8,33 6,7 7,5 Porcine pncreas A lpase TL que um lpase 1,3 especifica apresenta valores de rendimento em ster muito prximos aos valores apresentados pela lpase Amano PS. No entanto, quando se analisa os valores de converso em triglicerdeos, a Amano PS apresentou valores superiores. Essa caracterstica tambm foi verificada por Jegannathan et al. (2010), que no estudo da converso de leo de Palma em biodiesel, verificaram alta converso de triacilgliceris pela lpase de Burkholderia cepacia. Este resultado pode indicar que esta enzima no possui alta seletividade para a produo de ster. Este fato pode estar ligado ao carter polar dos intermedirios formados, que pode dificultar o acoplamento correto da enzima com o substrato intermedirio, ou ainda, dificultar a formao da interface lcool:substrato, necessria para a atuao da enzima (Royon, 2007). interessante salientar que, mesmo com valores de rendimento prximos das enzimas PS e TL, as atividades de produo de ster e a atividade de consumo de triacilgliceris, apresentam valores muito diferentes, indicando que essas duas enzimas possuem mecanismos de atuao distintos. Observa-se que as lpases de PP e CR apresentam atividades de produo de ster e consumo de triglicerdeos baixos, o que foi relatado por Soares (2004), indicando que estas

enzimas possuem caractersticas prprias para a hidrlise, no apresentando resultados interessantes para a transesterificao. Como possvel verificar na Figura 1, a lpase de TL apresenta maior seletividade para a produo de ster, devido baixa concentrao de mono e diglicerdeos no final da reao, o que no ocorre nas reaes catalisadas pelas enzimas CR e PS. Essa diferenciao pode estar ligada ao fato de que a enzima TL uma enzima 1,3 especfica, ou seja, atua no ster quebrando as ligaes 1,3 do triglicerdeo (Novozymes, 2001). O que no ocorre com as outras enzimas estudadas, que so classificadas como enzimas sem especificidade de quebra das ligaes. A B

Figura 1: Perfil de concentrao dos compostos produzidos na transesterificao. (A) Thermomyces lanuginosus, (B) Amano PS, (C) Candida Rugosa, (D) Porcine Pancreas.

CONCLUSES A enzima lpase de Thermomyces lanuginosus apresentou os melhores resultados, tanto de rendimento em triglicerdeos (86,4%) e ster (71,3%), quanto em atividades de produo de ster (316,65 mol/g.s), consumo de triglicerdeos (200 mol/g.s) e transesterificao medida pelo mtodo da Amano (3298,8 mol/g.min), indicando que uma enzima 1,3 especfica. A lpase Amano PS apresentou converso em triglicerdeos de 100%, porm a converso em ster foi de 68,5%. As atividade de produo de ster (66,67 mol/g.s), consumo de triglicerdeos (33,33 mol/g.s) e transesterificao pelo mtodo da Amano (3018,5 mol/g.min) foram inferiores s da enzima TL.

Tanto a lpase de Candida rugosa quanto a de pncreas suno apresentaram valores de converso em ster baixos, 7,7% e 6,7% respectivamente, assim como os valores de converso de triglicerdeos (9,5% e 7,5%). A atividade de produo de ster para estas enzimas foi, respectivamente, de 33,33 mol/g.s e 16,67 mol/g.s e a atividade de consumo de triglicerdeos foi de 16.67 mol/g.s e 8,33 mol/g.s. As atividades de transesterificao foram de 3154,2 mol/g.min e 2655,5 mol/g.min. Estes resultados indicam que ambas as lpases CR e PP no so adequadas para catalisar as reaes de transesterificao estudadas, nas condies empregadas. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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