CLCULO DE INCERTIDUMBRE EN MEDIDAS QUMICAS: ANLISIS CROMATOGRFICO

Alicia Maroto, Ricard Boqu, Jordi Riu, F. Xavier Rius

Departamento de Qumica Analtica y Qumica Orgnica Instituto de Estudios Avanzados. Universitat Rovira i Virgili. Pl. Imperial Trraco, 1. 43005-Tarragona. Espaa

En anteriores artculos de esta serie hemos visto la importancia que tiene calcular la incertidumbre asociada a cualquier resultado analtico [Maroto 2001] as como las diversas estrategias existentes para calcular la incertidumbre [Maroto 2002]. Una de ellas consiste en calcularla de forma global, es decir, agrupando trminos de incertidumbre siempre que sea posible, y utilizando la informacin que se genera durante el proceso de validacin del mtodo analtico [Maroto 1999]. La ventaja de esta aproximacin es que requiere poco trabajo adicional puesto que los mtodos siempre deben validarse antes de aplicarlos al anlisis de muestras de rutina. En este artculo se explica cmo aplicar esta aproximacin para calcular la incertidumbre en la determinacin de clembuterol en hgado mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). 1. Determinacin de clembuterol en hgado mediante HPLC El consumo de carne de animales tratados con elevadas cantidades de clembuterol puede comportar la aparicin de efectos graves en el consumidor, como alteraciones de tiroides, palpitaciones, insomnio, espasmos musculares, aumento de la presin sangunea, etc. Por este motivo, la comunidad europea ha establecido un lmite mximo de clembuterol de 0.1 g/Kg en msculo, de 0.5 g/Kg en hgado y rin, y de 0.05 g/L en leche. El uso del clembuterol administrado como frmaco de forma teraputica y bajo prescripcin veterinaria comporta un riesgo mnimo para el consumidor. Sin embargo, el uso ilegal del clembuterol en animales como anabolizante para aumentar la cantidad de msculo puede dar lugar a graves intoxicaciones. Los graves efectos del clembuterol han hecho que sea muy importante determinar su contenido en carnes y, especialmente, en hgado ya que es donde se encuentran las mayores concentraciones. La Figura 1 muestra las etapas del mtodo analtico para determinar clembuterol en hgado.

Eliminar las partes visibles de grasa del hgado Triturar y homogeneizar 10 g de hgado

Centrifugar

Extraccin en fase slida del sobrenadante Extraccin con tercbutilmetilter

HPLC HPLC

Determinacin del clembuterol por HPLC

F=1

Vial 1

Figura 1. Etapas del mtodo analtico para determinar clembuterol en hgado por anlisis cromatogrfico.

En primer lugar, se deben triturar y homogeneizar 10 g de hgado despus de haber eliminado las partes visibles de grasa. Una vez homogeneizada, la muestra se centrifuga y se realiza una extraccin en fase slida del sobrenadante con un cartucho C18. El clembuterol retenido en el cartucho se eluye con metanol. Despus, deben realizarse diversas extracciones con tercbutilmetilter, evaporar a sequedad la fase orgnica y disolver el residuo en cido clorhdrico 0.01 M. Finalmente, se determina el clembuterol del extracto mediante HPLC. La concentracin final de clembuterol en hgado (expresada en g/Kg) se calcula como: c clembutero l = cHPLC Vex F R mhgado hom

[1]

donde cHPLC es la concentracin del extracto analizado por HPLC (en g/L), Vex es el volumen final del extracto (en L), R es la recuperacin del proceso de extraccin, m hgado es la masa de hgado analizada (en Kg), Fhom es el factor debido a la heterogeneidad de la muestra. A efectos prcticos, se asume que Fhom es igual a uno y por tanto no contribuye al resultado final. No obstante, Fhom tiene una incertidumbre asociada que s contribuye a la incertidumbre final de los resultados.

2. Verificacin de la trazabilidad de los resultados La trazabilidad del contenido en clembuterol puede verificarse utilizando un material de referencia certificado (CRM) [BCR 2000]. En este ejemplo se utiliz un CRM cuya concentracin certificada de clembuterol en hgado liofilizado y homogeneizado era 1.21 0.11 g/Kg. Adems, en el certificado del CRM se dispona de la informacin de que la incertidumbre se haba calculado utilizando un factor de cobertura de k = 2.2. El CRM se analiz diez veces en el laboratorio en condiciones intermedias siguiendo el protocolo del mtodo analtico. Es decir, el CRM se analiz en diferentes series y variando los equipos y los analistas. Los resultados obtenidos (expresados en g/Kg de clembuterol) se muestran en la Tabla 1:
Anlisis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media Desviacin estndar Resultado 1.21 1.28 1.32 1.34 1.36 1.19 1.25 1.30 1.26 1.22 1.27 0.057

Tabla 1. Resultados del anlisis del CRM

La desviacin estndar de los resultados corresponde a la precisin intermedia del mtodo ya que el CRM se analiz en condiciones intermedias. La trazabilidad del mtodo se verific mediante un test t-Student:

t cal =

xCRM xmtodo UCRM sI + k n

2 2

1.25 - 1.27 0.11 0. 057 + 2. 2 10

2 2

= 0. 43

[2]

Donde x CRM es la concentracin certificada de clembuterol, UCRM es la incertidumbre asociada a dicha concentracin y n es el nmero de veces que se analiz el CRM con el mtodo analtico (en este caso, n=10). El valor de t calculado, tcal, debe compararse con el valor de t tabulado de dos colas para (n-

1) = 9 grados de libertad y un nivel de significacin (en este ejemplo = 5%). El valor de t tabulado es 2.26; por tanto, los resultados proporcionados por el mtodo son trazables al valor certificado del CRM ya que el valor de t tabulado es mayor que el valor de t calculado. Una vez verificada la trazabilidad al CRM, se puede trasladar dicha trazabilidad a los resultados obtenidos al analizar las muestras de rutina de hgado. Para ello, es necesario que las muestras de rutina sean similares al CRM utilizado en trminos de concentracin y de matriz. Adems, es necesario que el mtodo est bajo condiciones de aseguramiento de la calidad para poder asegurar a lo largo del tiempo que los resultados siguen siendo trazables.

3. Clculo de la incertidumbre de los resultados Identificacin de las fuentes de incertidumbre Para calcular la incertidumbre de los resultados es necesario identificar todas las fuentes de incertidumbre de los trminos de la expresin utilizada para calcular la concentracin de clembuterol (Ec. 1). En concreto, las fuentes de incertidumbre de la concentracin del extracto analizado, c HPLC, son debidas al proceso de extraccin, a la recta de calibrado con patrones de clembuterol y al anlisis cromatogrfico (es decir, a la inyeccin del extracto, al rea obtenida y a la calibracin del cromatgrafo). La incertidumbre del volumen de extracto analizado, Vex , depende de la tolerancia y de la precisin del material volumtrico utilizado. La incertidumbre de la recuperacin del proceso de extraccin depende del anlisis cromatogrfico, de los pretratamientos realizados para extraer el clembuterol en la muestra enriquecida y en la muestra sin enriquecer y de la cantidad de patrn adicionada. Las fuentes de incertidumbre de la masa de hgado analizada, m hgado, dependen de la precisin y la calibracin de la balanza. Por ltimo, la incertidumbre del factor Fhom es debida a los procesos de homogeneizacin de la muestra (eliminacin de partes visibles de grasa y trituracin). Como vemos, existen muchas contribuciones a la incertidumbre del resultado final y el clculo individual de cada una de ellas siguiendo el procedimiento bottom-up propuesto por la ISO [Maroto, 2002] resultara ciertamente complejo. Sin embargo, es posible agrupar trminos y calcular la incertidumbre de forma global, aprovechando la informacin que se ha generado durante el proceso de verificacin de la trazabilidad. La Fig. 2 muestra la expresin para

calcular globalmente la incertidumbre. Se observa que las fuentes de incertidumbre identificadas en la determinacin de clembuterol (y de forma general en la determinacin de cualquier analito mediante cualquier mtodo analtico) pueden agruparse en cuatro componentes: 1) incertidumbre debida a la precisin; 2) incertidumbre debida a la verificacin de la trazabilidad; 3) incertidumbre debida a la heterogeneidad de la muestra; y 4) incertidumbre debida a otros trminos.

Verificacin de la trazabilidad

Submuestreo y pretratamientos

Otros componentes

2 2 2 2 U = k u precisin + u trazabilid ad + u heterogene idad + u otros trminos

Figura 2. Componentes de incertidumbre de la estrategia basada en utilizar informacin generada durante la verificacin de la trazabilidad.

La Fig. 2 muestra que los dos primeros trminos de la expresin se pueden obtener utilizando la informacin generada durante el proceso de verificacin de la trazabilidad, es decir, en este ejemplo en concreto cuando se analiz el CRM. La incertidumbre debida a la precisin corresponde a la variabilidad experimental del mtodo analtico, y en ella se incluyen las fuentes de incertidumbre asociadas a todas las etapas del mtodo analtico, pero consideradas de una forma global. En este caso en concreto se incluye la precisin de la balanza, las etapas de extraccin, la recta de calibrado, la recuperacin y la precisin del material volumtrico. El segundo trmino, u2trazabilidad, considera la incertidumbre asociada a asegurar que el mtodo proporciona resultados trazables. Para asegurar esto se ha debido analizar el CRM, con los consiguientes componentes de error asociados (incertidumbre del propio material y los mismos trminos de incertidumbre asociados a la precisin del mtodo, u2precisin). El tercer trmino de la expresin considera la incertidumbre asociada a la heterogeneidad de las muestras de hgado. Esto es debido a que como el CRM es una muestra homognea, la u2trazabilidad no tiene en cuenta las etapas de homogeneizacin que se tendrn que aplicar a las futuras muestras de rutina. Por ltimo, el cuarto trmino, y en el caso concreto del anlisis de clembuterol, podra incorporar la incertidumbre asociada a la variabilidad de las matrices de las muestras de rutina (en caso de analizar

muestras que no fueran de hgado, o muestras de hgado de diferentes especies de animales).

Clculo de los diferentes componentes de incertidumbre A continuacin se explica cmo se calcularon los diferentes trminos de incertidumbre de la expresin propuesta en la Fig. 2. Tal y como se observa en esta figura, pueden obtenerse dos trminos de incertidumbre a partir de la informacin obtenida durante la verificacin de la trazabilidad: la incertidumbre debida a la precisin y la incertidumbre de la verificacin de la trazabilidad. 1. Incertidumbre debida a la precisin La incertidumbre debida a la precisin corresponde a la precisin intermedia del mtodo analtico. La precisin intermedia del mtodo puede obtenerse a partir del anlisis del CRM ya que ste se analiz en condiciones intermedias. Por tanto:
uprecisin = sI N = 0. 057 N

g/Kg

[3]

Donde sI es la desviacin estndar de los 10 resultados obtenidos al analizar el CRM y N es el nmero de veces que se analiza la muestra de rutina en condiciones intermedias (normalmente, N=1). 2. Incertidumbre debida al proceso de verificacin de la trazabilidad Se calcula teniendo en cuenta la incertidumbre de la referencia y la precisin intermedia del mtodo. U s 0. 11 0.057 = CRM + I = = 0. 053 g/Kg + k n 2.2 10
2 2 2 2

utrazabilid ad

[4]

El primer trmino de la expresin corresponde al cuadrado de la incertidumbre estndar del CRM (es decir, corresponde a la incertidumbre expandida del CRM dividida por el factor de cobertura k) y el segundo trmino corresponde a la incertidumbre del valor medio obtenido al analizar 10 veces el CRM.

3. Incertidumbre debida a la heterogeneidad de la muestra Para calcular la incertidumbre de la heterogeneidad, se realiz la homogeneizacin de 6 porciones de 10 g de una muestra de hgado. Despus, se analiz cada una de las 6 porciones homogeneizadas con el procedimiento analtico (es decir, se extrajo el clembuterol y se determin el clembuterol del extracto mediante HPLC). Cada una de las 6 porciones se analiz en condiciones de repetibilidad (es decir, las 6 muestras homogeneizadas las analiz el mismo el analista con el mismo equipo en un intervalo corto de tiempo). Se obtuvieron los siguientes resultados (expresados en g/Kg de clembuterol):
Porcin 1 2 3 4 5 6 Media Desviacin estndar, s porciones Resultado 1.05 1.08 1.01 1.17 1.22 1.12 1.11 0.078

Tabla 2. Resultados de las 6 porciones homogeneizadas de una muestra hgado.

La incertidumbre de la heterogeneidad corresponde a la desviacin estndar de los resultados obtenidos al anali zar las 6 porciones de muestra:
2 uheterogene idad = sporciones = 0.078 g/Kg

[5]

4. Incertidumbre debida a otros trminos En caso de que el laboratorio analice el hgado de diferentes tipos de carne (vacuno, ovino, porcino,...) es posible que la matriz de la muestra afecte al resultado final y dicho efecto debe considerarse como un trmino ms de incertidumbre. En el ejemplo que presentamos hemos asumido que se analizan siempre muestras de una misma especie de animal.

Clculo de la incertidumbre final La incertidumbre final de los resultados se obtiene combinando los cuatro trminos de incertidumbre estndar de la Tabla 3 y multiplicando por el factor

de cobertura k, tal y como muestra la Fig. 2. La incertidumbre final (asumiendo que las muestras de rutina se analizan una sola vez) es:
U = k u = 2 0.11 = 0.22 g/Kg

[6]

en trminos absolutos o

U = k uR = 2 0.0936 c = 0.187 c g/Kg

[7]

en trminos relativos. Esta ltima expresin considera que los trminos de incertidumbre varan linealmente con la concentracin. As, para una concentracin de clembuterol, cclembuterol = 0.50 g/Kg, U = 0.09 g/Kg, mientras que para cclembuterol = 1.00 g/Kg entonces U = 0.18 g/Kg. La incertidumbre se ha calculado en ambos casos utilizando un factor de cobertura k = 2. Por tanto, hay aproximadamente un 95% de probabilidad de que la concentracin verdadera de clembuterol de una muestra de rutina est contenida dentro del intervalo proporcionado por la concentracin obtenida al analizar la muestra de rutina y su incertidumbre asociada, U.
Incertidumbre estndar, u(x) (g/Kg) Incertidumbre estndar relativa u(x)R

Trmino, x

Concentracin (g/Kg)

Precisin Trazabilidad Heterogeneidad Otros trminos Total

0.057 0.053 0.078 0.094

1.27 1.25 1.11 -

0.0449 0.0424 0.0703 0.0936

Tabla 3. Componentes de incertidumbre en el anlisis de clembuterol por HPLC

La Tabla 3 muestra la incertidumbre estndar (en trminos absolutos y relativos) de los cuatro componentes de incertidumbre de la Fig. 2. La incertidumbre de cada uno de los componentes en trminos relativos se calcula dividiendo el valor de incertidumbre estndar por el nivel de concentracin de clembuterol en el que se ha obtenido dicho valor de incertidumbre. Por ltimo, la Tabla 3 tambin muestra la incertidumbre total en trminos absolutos y relativos. La Fig. 3 muestra cmo contribuye cada uno de los componentes de incertidumbre a la incertidumbre total. Se observa que la incertidumbre debida a la heterogeneidad es la que tiene mayor contribucin a la incertidumbre final

del resultado. No obstante, se observa que las incertidumbres debidas a la precisin y a la trazabilidad tambin contribuyen a la incertidumbre final de forma muy similar. Si se requiriese rebajar la incertidumbre de los resultados deberamos incidir en los puntos que, a priori, contribuyen ms a dicha incertidumbre y, por ejemplo, nos podramos plantear la optimizacin de los procesos de homogeneizacin y/o extraccin de la muestra. Otra posibilidad para disminuir la incertidumbre final sera verificar la trazabilidad de los resultados con un CRM con una incertidumbre asociada menor.

Precisin Trazabilidad Heterogeneidad Otros trminos Total

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

Incertidumbre estndar, u

Figura 3. Contribucin de los componentes de incertidumbre a la incertidumbre total. Todos los trminos de incertidumbre estn expresados como incertidumbre estndar, u.

Es importante resaltar que el laboratorio debe estar bajo condiciones de aseguramiento de la calidad para que, a lo largo del tiempo, el laboratorio pueda asegurar: 1) que sus resultados siguen siendo trazables; y 2) que sigue siendo vlida la incertidumbre calculada [Maroto, 2002]. Otro aspecto importante a tener en cuenta es que el intervalo de concentraciones para aplicar las Ec. 6-7 no debera abarcar ms de un orden de magnitud. En caso contrario deberamos verificar la trazabilidad y calcular la precisin del mtodo a ms de un nivel de concentracin.

Conclusiones En este artculo hemos abordado el clculo de la incertidumbre en anlisis cromatogrfico. En concreto, hemos explicado cmo calcular la incertidumbre en la determinacin de clembuterol en hgado mediante cromatografa lquida (HPLC). En primer lugar, se han identificado las numerosas fuentes de incertidumbre presentes en la determinacin. Posteriormente, la incertidumbre

se ha calculado globalmente agrupando dichas fuentes de incertidumbre en nicamente cuatro componentes. La ventaja de utilizar esta estrategia global es que el clculo de la incertidumbre resulta ms sencillo. Adems, requiere poco trabajo adicional ya que se aprovecha la informacin obtenida durante el proceso de validacin del mtodo.

Referencias bibliogrficas Community Bureau of Reference (BCR). Certified reference material BCR-649. Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel (Belgium), 2000. BIPM,IEC,IFCC,ISO,IUPAC,IUPAP,OIML, Guide uncertainty in measurement, ISO, Ginebra,1993 to the expression of

EURACHEM/CITAC, Quantifying uncertainty in analytical measurement, EURACHEM/CITAC Guide, 2 nd Edition, 2000. http://www.eurachem.bam.de/ Alicia Maroto, Ricard Boqu, Jordi Riu, F. Xavier Rius, Incertidumbre y precisin Tcnicas de Laboratorio, 266 (2001) 834-837. Alicia Maroto, Ricard Boqu, Jordi Riu, F. Xavier Rius Estrategias para el clculo de la Incertidumbre Tcnicas de Laboratorio 270 (2002) 223-227. Alicia Maroto, Jordi Riu, Ricard Boqu, F. Xavier Rius, Estimating uncertainties using information from the validation process Analytica Chimica Acta 391 (1999) 173-185

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