CULTIVO DE CELULAS MADRE. 1) MTODOS DE CULTIVO a) Aislamiento: i.

Clulas Madre embrionarias (SC): Los embriones humanos que son utilizados para obtener las SC son producidos en clnicas de Fertilizacin In Vitro (donados o desechados), donde son deshidratados, congelados y enviados a los centros de investigacin de SC para su utilizacin. Los embriones son, entonces, descongelados y rehidratados al bao mara en placa calefactora, durante 50 segundos a 37C. Estos embriones, listos para ser cultivados (derivados), se dejan desarrollar hasta fase de mrula en el da 4 y forman el blastocito el da 6.
Fig1. Aislamiento y diferenciacin de Clulas Madre embrionarias humanas

Luego, el blastocito es aislado y cultivado sobre una capa de clulas feeder, donde es fijado y la Masa Celular Interna (ICM) queda expuesta, permitiendo su extraccin y disociacin mecnica de los blastocitos con nmero de clulas y morfologa adecuadas (derivacin). Otra tcnica para la obtencin de SCs es la transferencia nuclear, que consiste introduccin del ncleo de una clula somtica en un huevo fertilizado cuyo ncleo original ha sido eliminado. El ambiente del huevo fertilizado tiene el efecto de reprogramar el ncleo transferido a su estado primordial, continuando normalmente con la divisin del huevo.

ii. Clulas Madre adultas:

Clulas Madre Hematopoyticas: Estas celulas pueden diferenciarse como cualquier tipo celular sanguneo: eritrocitos, linfocitos B, T y natural killer, neutrfilos, basfilos, eosinfilos, monocitos, macrfagos y plaquetas.

Fig. 2. Diferenciacin de clulas hematopoyticas y de estroma. Tomado de Stem Cell Institutes of Health.

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Clulas Madre Mesenquimales: Provienen de tejidos conectivos embrionarios inmaduros. Se diferencian en una gran variedad de tipos de clulas, como osteocitos, condrocitos, adipocitos y otras clases de clulas de tejidos conectivos, como tendones. Clulas Madre Neurales: Se encuentran en el tejido neural adulto y, en el cerebro, se diferencian en sus tres mayores tipos celulares: neuronas, y dos categoras de celulas no neuronales, como son astrocitos y oligodendrocitos. Clulas Madre Epiteliales: Se desarrollan en criptas profundas del tracto digestivo y se diferencian en varios tipos celulares: clulas de absorcin, endocrinas, etc. Clulas Madre de la piel: Se desarrollan en las lminas basales de la epidermis y en la base de los folculos pilosos. Las Clulas Madre Epidrmicas pueden diferenciarse en queratocitos, que migran a la superficie de la piel y forman una lmina protectora. Las Clulas Madre Foliculares se pueden diferenciar tanto en tejido folicular como epidrmico.

iii. Clulas Madre Fetales: Aisladas de embriones muertos y sangre del cordn umbilical. b) Derivacin: Las colonias formadas a partir de las Clulas Madre aisladas o de las ICMs, en el caso de SC embrionarias, son disgregadas y sometidas a pases sucesivos hasta obtener lneas celulares estables. c) Diferenciacin: Es el proceso mediante el que una clula no especializada se transforma en cualquier tipo celular (cardaco, pulmonar, pancretico, etc...) por la activacin o desactivacin de determinados genes, regulada por distintos mecanismos celulares (microRNA, activacin de receptores, factores de crecimiento, etc). 2). CARACTERIZACIN Durante el proceso de cultivo y diferenciacin de Clulas Madre, se producen cambios en la composicin antignica de superfcie, las protenas intracelulares y los factores de transcripcin. La deteccin inmunolgica o por Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR) de estos marcadores es ampliamente utilizada para caracterizar el estado de pluripotencia de las Clulas Madre humanas y de ratn, los carcinomas embrionarios, as como su estado de diferenciacin en los diversos linajes celulares. Existen varios marcadores caractersticos de la Clulas Madres embrionarias indiferenciadas: - Glicolpidos de superfcie: glycolipid surface Stage Specific Embryonic Antigens: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4 - Tumour related antigen TRA-1-60 and TRA-1-8119 - Octamero-4, relacionado con el mantenimiento de la pluripotencia. - Factores de transcripcin, como Sox-2 and Germ Cell Nuclear Factor (GCNF), Rex1 y Nanog. Posteriormente, las Clulas Madre embrionarias dan lugar a las tres capas germinales embrionarias que constituyen la fuente de todo los tejidos de un organismo: - Marcadores de ectodermo: ASH1, CNPase, Dopamina B hidrolasa, EN1, GBX, LIM-1/ISLET1, LHX3, NFH - Marcadores de endodermo: antitripsina, alfa-fetoprotena, allbmina, amilasa, quimotripsina. - Marcadores de mesodermo: actinina, cardiotina, CD34 claseI, II y II, troponina, miosina, renal cell carcinoma. Durante el cultivo y diferenciacin, adems de caracterizar cambios en la expresin de diferentes marcadores celulares, es necesario el anlisis del estado de proliferacin celular, los perfiles de muerte y viabilidad celular, la activacin de seales intracelulares, as como las caractersticas morfolgicas y funcionales (motilidad celular, extensin neurtica, etc). En este sentido, el desarrollo de estrategias para el anlisis multiparamtrico en formato multipocillo permite obtener resultados fiables con poco material de partida.

3). CONDICIONES DE CULTIVO Desde la derivacin hasta la diferenciacin de Clulas Madre, cada tipo celular tendr unos requerimientos distintos de sustrato, pasando desde clulas en suspensin hasta adheridas, as como de nutrientes y factores de crecimiento.

a) El medio de cultivo: El cultivo celular se realiza en medios artificiales, preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior. Por ello, consideraremos que el medio de cultivo estar formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las clulas, las condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas del medio, la naturaleza y composicin de la fase gaseosa y las condiciones de incubacin, especialmente la humedad y la temperatura. i. Medio de cultivo: En la fase de proliferacin de Clulas Madre se suelen utilizar medios de cultivo suplementados con factores de crecimiento y en ausencia de suero, que les permiten no pasar a la fase de diferenciacin. En la fase de diferenciacin, se usan medios de cultivo suplementados con suero y en ausencia de factores de crecimiento Los principales medios empleados en Clulas Madre son: DMEM/F12 DMEM

 IMDM Para aplicaciones teraputicas se han desarrollado medios de cultivo libres de componentes de origen animal. ii. Hormonas y factores de crecimiento (suero): En los medios no definidos suele aportarlos el suero. En algunas aplicaciones de Clulas Madre, se suelen aportar individualmente para evitar el uso de sueros. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS) y suero humano ("human serum", HuS). La utilizacin de suero es problemtica pues siempre existe la posibilidad de que contenga contaminaciones (micoplasmas y virus), aunque ltimamente las distintas casas comerciales han desarrollado sueros testados especialmente para Clulas Madre o sustitutivos del suero. iii. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibiticos y antifngicos): Con el fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo, ste se suele suplementar con sustancias antibiticas de diferente espectro de accin. La adicin de antibiticos debe controlarse estrictamente para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o ms antibiticos. Las mezclas de uso ms comn son: Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 microbiana. g/mL). Combinacin antig/mL) / Fungizona.

Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 Combinacin anti-microbiana y anti-fngica.

b) Mtodos de disgregacin celular: Durante el cultivo de las clulas es necesaria su disociacin para separar las clulas entre s y del sustrato, manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo, se debe romper la malla de protenas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas, mediante procesos que separen las molculas proteicas de esta matriz extracelular o bien romper proteolticamente las mismas protenas. Generalmente, los mtodos empleados se pueden clasificar en tres categoras: i. Mecnicos: (Scrapers, Lifters, Magdem ) En cultivos celulares se emplean con frecuencia los mtodos de rascado (scrapping) de la placa para arrancar las clulas adheridas. Actualmente, el rascado manual puede ser sustituido por un rascado automtico, que se realiza mediante imanes que son colocados en el interior del frasco de cultivo (Magdem).. ii. Qumicos: Se llevan a cabo mediante la adicin de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso, se reduce la concentracin de los iones que estabilizan las uniones de las protenas de la matriz extracelular y de stas con los receptores celulares. iii. Enzimticos: Tratamiento del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papana, pronasa, hialuronidasa, etc...). Existen otros productos sustitutivos de las enzimas de orgen animal, que permiten realizar la misma funcin pero sin afectar a las protenas de la membrana. Son las denominadas HyQTasas. Soluciones de orgen no mamfero en D-PBS con EDTA. La eleccin de uno u otro procedimiento depender, fundamentalmente, de la naturaleza o cantidad del cultivo disponible y del uso previsto de las clulas obtenidas.

Linkografia:

www.cultek.com