DEPARTAMENTO DE FARMACIA APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA EN TERAPUTICA (2015678) GRUPO 2 NANYID LISSETHE CHAPUEL FLREZ.

CDIGO: 124760 CAMILO FONSECA FACTOR. CDIGO: 124563 ABRIL 29 DE 2011 UN ACERCAMIENTO A LAS TCNICAS MODERNAS EMPLEADAS PARA EL DESARROLLO DE VACUNAS

Las vacunas son un gran avance para la medicina y la biotecnologa, de modo que han permitido mejorar la calidad de vida al disminuir la incidencia de muerte y contagio de enfermedades de tipo infecciosa. Paralelo al estudio de las vacunas se han desarrollado mltiples tcnicas para su elaboracin permitiendo el despliegue aun ms evidente de la biotecnologa. Existen varios tipos de vacunas de acuerdo a los mtodos que se utilicen para obtenerlas y de acuerdo a la composicin. En este escrito se van a mencionar los distintos tipos de vacunas que existen o las tcnicas ms comunes con el fin de brindar un panorama general de las caractersticas de cada subtipo y establecer ventajas y desventajas entre unas y otras.

Aspectos generales de las Vacunas (4)

Las vacunas son medicamentos que contiene como principio activo un antgeno este antgeno , puede ser a su vez particulado o soluble. Las vacunas contienen auxiliares de formulacin como los adyuvantes (agua, sistemas buffer, etc.) que se encuentran en la gran mayora de vacunas. Las vacunas son de uso parenteral y por esta razn deben ser estriles, es decir que slo deben de poseer la entidad con la que fue fabricada. Las vacunas al ser un medicamento requieren de un control de calidad de tipo fsico, qumico y microbiolgico, por esta razn se debe establecer un control en primer lugar sobre el principio activo con el fn de determinar qu tipo de i contaminacin tiene, que depende directamente del origen de donde se obtuvo. El control microbiolgico se realiza durante todo el proceso, adems del anlisis de trazas de metales, reactivos, etc. El antgeno debe ser cosechado, purificado y dosificado, para luego realizar una prueba de la potencia de la vacuna a esa dosis acompaada de una prueba de estabilidad. El principio del desarrollo de una vacuna es la respuesta inmunolgica, que se da en dos etapas: la respuesta primaria y la secundaria, para brindar as una respuesta especifica que este dirigida a eliminar el patgeno invasor. La vacuna desencadena estas dos respuestas y minimiza la respuesta inmune. Las vacunas tienen funciones profilctica y teraputica. En cuanto a la funcin profilctica, la vacuna busca prevenir enfermedades y en cuanto a la teraputica, las vacunas se usan cuando el paciente ya tiene la patologa para generar la recuperacin del paciente.

Tcnicas de Desarrollo de Vacunas

Mtodos para obtencin de Vacunas:

1. 2. 3. 4.

Inocul ci n en ani ales. Huevos embrionados. Cultivo celular. Mtodos de Biologa molecular: a. Protenas recombinantes. b. Vacuna Conjugada. c. DNA. d. Pptidos sintticos. e. VLPs. f. Mutantes: toxinas mutadas/Bacterias con mutaciones. g. Toxoides. h. Fracciones subcelulares.

A su vez las vacunas pueden clasi icarse en:

y y

Vacunas muertas: protenas recombinantes, conjugada, DNA, pptidos sintticos, VLPs, toxinas mutadas, fracciones subcelulares y toxoides. Vacunas vivas atenuadas: Bacterias con mutaciones.

Toda esta variedad de metodologas para la obtenci n de vacunas existe porque se requiere continuamente y con el paso del tiempo del mejoramiento de la calidad de la vacuna que por mtodos convencionales o cl sicos no puede ser obtenida; entonces cada nueva tcnica aparece porque hay limitaciones tecnol gicas en dada metodologa para mejorar la calidad y los procesos de obtenci n de vacunas de importancia clnica. La existencia de enfermedades para las cuales no hay tratamiento o cura y que pueden ser tratadas con vacuna, son un gran motivo para la innovaci n en los mtodos y el uso de nuevas tecnologas y conocimientos; mas sin embargo la respuesta al tratamiento depende de la gentica del sistema inmune de cada individuo. Hay que decir que la incorporaci n en tiempos recientes de avances cientficos y tecnol gicos, en lo que se refiere al proceso de elaboraci n de vacunas. Uno de ellos es el a islamiento de (1) antgenos glico-proteicos , ya que no son partculas enteras de microorganismos, que presentan problemas en su manejo en cuanto a la seguridad (cuidado del personal encargado de manejar el producto terminado). Ahora, a partir del desarrollo de mtodos biotecnol gicos sustentados en la tcnica de ADN recombinante, que nos lleva a una nueva generaci n de vacunas, que presentan las siguientes ventajas:

Tcnicas

sarr

acunas

Eliminar los genes virulentos de un agente infeccioso, manteniendo la misma capacidad de la respuesta inmune; funcionando como una vacuna viva, sin que haya reversi n de la virulencia. Crear sistemas vivos de carcter no patognico que puedan transportar determinantes antignicos de un agente pat geno con el que no est relacionado: inducci n de una respuesta inmune dirigida a un agente pat geno en particular. Las nuevas tcnicas permiten aislar, clonar y expresar en un husped alternativo, los genes relacionados con determinantes antignicos.

Por ello, se han desarrollado mtodos que nos conducen a obtener vacunas ms seguras y eficaces en cuanto se potencializa la respuesta inmunol gica, de los cuales, vamos a hacer referencia en este escrito, y son las vacunas obtenidas a partir de mtodos de biologa molecular (2) : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Vacunas atenuadas mediante modificaci n gentica. Vacunas de pptidos sintticos. Vacunas anti-idiotipo. Vacunas de protenas y pptidos recombinantes Vacunas gnicas. Vacunas comestibles. Otras.

1. Vacunas atenuadas mediante modificacin gentica

El uso de la tcnica de gentica reversa (2), que es el uso de de la ciencia de la gentica para identificar genes y sus funciones a partir de la selecci n de mutaciones. Esa identificaci n de secuencias genmicas virulentas lleva a que adems de ello, tambin puedan ser retiradas (delecin), siguiendo este procedimiento: Aqu voy a colocar un diagrama de flujoaunque en el archivo grande, est un esquema, pero no estoy seguro de copiarlo tal cual
 

Aislamiento del fragmento del ADN del patgeno (gen)

Secuenciacin y expresin de parte del ADN del patgeno. Caracterizacin de las propiedades patognicas de la protena

Diseo de un patgeno sin el fragmento de ADN causante de la patogenia

Figura 1: Esquema que describe la obtencin de vacunas atenuadas mediante modifica cin gentica

2. Vacunas de pptidos sintticos

Se fundamenta en la copia de la secuencia genotpica que contiene informacin sobre protenas antignicas procedentes de patgenos, y su sntesis por mtodos qumicos. Empleando tcnicas de Ingeniera Gentica y el uso de anticuerpos monoclonales, donde se pueden reconocer fragmentos con capacidad inmunolgica. Luego de realizado el proceso, de sntesis, se logra que stos tengan una configuracin adecuada (mimtropos) para ser reconocidos por el sistema inmune del individuo. El proceso descrito para la elaboracin de este tipo de medicamentos es:

Tcnicas

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Aislar fragmento de ADN del patgeno

Secuenciacin del fragmento de ADN del patgeno

Sntesis del pptido

Figura 2: Descripcin del procedimiento para la obtencin de vacunas sintticas

3. Vacunas anti-idiotipo
Tienen como objetivo utilizar un anticuerpo que pueda ser capaz de reproducir la morfologa del antgeno, induciendo una respuesta inmune, pero que a su vez pueda ser usado con seguridad El . anticuerpo contra el antgeno, denominado anticuerpo idiotipico, se inyecta en animales, donde en stos se estimula la produccin de anticuerpo anti-idioptico. ste ltimo acta como vacuna en la medida en que contiene un determinante antignico, similar al antgeno original. Este tipo de vacunas confieren una inmunidad pasiva, ya que se suministran anticuerpos procedentes del patgeno, y en su elaboracin se sigue el procedimiento que se describe a continuacin:

Figura 3: mtodo en el que se basa la produccin de vacunas anti-idiotipo Este tipo de vacunas son de utilidad en los casos en que el agente patgeno sufre un gran nmero de mutaciones, como en el caso del virus de la gripe. Sin embargo, estas vacunas presentan una serie de inconvenientes debido fundamentalmente a su carcter experimental, y a que suponen un tipo de inmunoterapia pasiva que requiere la administracin de frecuentes dosis.

3. Vacunas obtenidas a partir de protenas y pptidos recombinantes

A partir de la tcnica del ADN recombinante permite identificar secuencias de genes que se relacionan con la informacin para otras protenas que se encuentran sobre la superficie del patgeno sobre la cual se busca obtener una vacuna. Las protenas antignicas producidas son purificadas y utilizadas directamente como vacunas. El gen se puede introducir en:
y y y

Bacterias Levaduras Otras clulas

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Dentro de los microorganismos ms empleados a la hora de elaborar vacunas recombinantes est la E.Coli aunque se pueden obtener a partir de levaduras o de plantas. Dentro de las ventajas de usar la primera est su poca complejidad gentica a la hora de referirnos a su crecimiento, pero tiene dificultad en mostrar caractersticas que slo sean reproducibles en clulas eucariotas. En cuanto al uso de las levaduras se generan problemas debido a que no crecen tan rpido y presentan mayores complicaciones de manejo, elevando los costos de la produccin de protenas recombinantes. Las plantas por el contrario, son sistemas de produccin de muy bajo costo, y con una alta capacidad de escalado, adems de permitir ciertas modificaciones en las protenas. Las vacunas recombinantes que se producen en la actualidad, utilizan plantas y bacterias como sistemas biolgicos de produccin.

Identificar la protena de inters inmunolgico

Aislamiento del fragamento de ADN que codifica la protena

Insercin del fragmento del ADN en un plsmido

Seleccin de vectores que hayan incorporado el fragmento de ADN que exprese la protena antignica

Introducir en un plsmido en un vector de expresin (por ejemplo, una bacteria)

Figura 4: descripcin del mtodo para obtener vacunas recombinantes a partir de la secuencia de ADN del patgeno

5. Vacunas gnicas
Su principal caracterstica es que el antgeno inmunizante no se administra directamente al paciente a vacunar; sino que el gen que lo codifica, dirige la sntesis de ste en las clulas del husped. Luego de la sntesis, se desencadena la correspondiente respuesta inmunitaria que es de tipo inmunitaria y celular como en las vacunas vivas atenuadas. Dentro de sus principales ventajas caben mencionar la posibilidad de administrar varios antgenos, pero medio de varias secuencias que puedan determinar ms de un gen antignico. Sin embargo, en la actualidad las vacunas gnicas no poseen la capacidad de generar una respuesta inmune igual de intensa a la que generan las vacunas vivas inactivadas. Otro de los problemas que genera es que al administrar continuamente antgeno puede desembocar en un cuadro de autoinmunidad. Para lograrlo, se recurre a un vehculo en el cual se pueda expresar el gen que codifica el antgeno. De acuerdo al perfeccionamiento de los vectores y al desarrollo de mtodos biotecnolgicos basados en ADN recombinante, se encuentran estos tipos de vacunas gnicas:

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Las que se basan en clonaje de genes en organismos vivos: bacterias o virus atenuados que portan los genes que portan los antgenos inmunizantes de los microorganismos a los que se quiere proteger a un paciente al sujeto vacunado. Vacunas de ADN desnudo: es un ADN que no est recubierto de ninguna estructura qumica, envuelta viral u otro tipo de estructura. El vehculo transportador de ese material gentico que se busca introducir es un plsmido. Vacunas de vectores virales: consiste en emplear la maquinaria de stos para multiplicar el antgeno que tiene actividad inmunitaria, adems de permitir la insercin de genes en su propio genoma. No obstante, su principal inconveniente, est en que la inmunogenicidad del vector recombinante est en su capacidad de replicarse dentro del organismo. As pues, el vector referido a mayor inmunogenicidad tambin est asociado a una mayor patogenicidad. Vacunas de vectores bacterianos: tienen un gran potencial para ser administrados oralmente. Permiten la induccin de respuesta inmune a nivel de mucosa, que es de especial importancia en patologas que se desarrollan con facilidad en mucosas. Sin embargo, presenta dificultades y fallas en su empleo como: reversin hacia la patogenicidad y la inmunidad preexistente.

6. Vacunas comestibles
Son plantas, a las cuales se han introducido por tcnicas de ingeniera gentica, un gen que contiene la informacin necesaria para producir una protena antignica. Al igual que las anteriores tienen como ventaja inducir respuesta inmune en mucosas. El principal problema tcnico radica en que los antgenos pueden ser degradados a nivel del tracto gastrointestinal, mucho antes de que puedan desencadenar una respuesta inmune. Por eso, es necesario plantear estrategias para mejorar la efectividad y administracin del medicamento consiste en proteger los antgenos frente a la degradacin a nivel intestinal y a la replicacin de los antgenos en las plantas empleadas como vectores.

7. Otras: 7.1. Vacunas Conjugadas:

La primera vacuna conjugada se cre contra Haemophilus influenzae, en el caso de la tipo b (Hib), ha sido prcticamente eliminada gracias a la vacunacin. Desde 1990 se cuenta con vacunas conjugadas, seguras y eficaces. Los frecuentes informes en la literatura mdica que destacan los logros de la salud pblica en los pases donde dichas vacunas han sido introducidas ha motivado al Programa Especial para Vacunas e Inmunizacin (SVI) de la OPS a recomendar su introduccin como parte de los esquemas regulares de vacunacin en todos aquellos pases en los que la relacin costo beneficio sea ventajosa y no ponga en riesgo la sostenibilidad del programa (5). Las vacunas conjugadas unen un polisacrido capsular con una protena transportadora, consiguiendo con ello cambiar una inmunidad timo-independiente a timo-dependiente. La respuesta T-independiente se manifiesta por la induccin de Ac (anticuerpo) de tipo IgM y, en mucha menor medida, IgG1 e IgG2, y no presenta capacidad para inducir memoria inmunolgica. La respuesta timo-dependiente mejora la inmunidad en nios pequeos (menores de 18 meses) siendo eficaz ya a partir de los 2 meses de edad, y consigue una memoria inmunolgica que consiste en que dosis repetidas de vacuna aumentan el nivel de Ac, que permanecer alto durante aos. As, las vacunas conjugadas se diferencian de las no conjugadas porque:

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 Producen una respuesta inmunolgica T-dependiente con induccin de memoria inmunolgica, mediada por clulas B. Se produce un rpido e intenso incremento en el ttulo de anticuerpos anti-PRP tras la administracin de una dosis de recuerdo de vacuna conjugada. La induccin de IgG, con niveles de IgG1 (la IgG1 fija bien el complemento, de importancia capital para la fagocitosis bacteriana) superiores a los de IgG2. No provoca fenmeno de tolerancia: hiporrespuesta tras dosis repetidas. Produce memoria comunitaria o de grupo por disminuir el estado de portador. Todo ello sucede ya a partir de los 2 meses de edad. Esta conjugacin se ha utilizado en las vacunas Hib, VCP-7v y MCC, siendo las protenas utilizadas para unirse al polisacrido la toxina diftrica mutante CRM197 (en la Hib, VPN-7v y MCC), el toxoide tetnico (en la Hib y MCC), el toxoide diftrico (en la Hib) y el complejo proteico de la membrana externa de N. meningitidis (en la Hib) (6).

7.2. Vacunas de VL s:
Las Partculas similares a virus (VLPs) se asemejan a los virus , pero no son infecciosas, ya que no contienen material gentico viral. La expresin de las protenas estructurales virales, tales como cpside, puede resultar en el autoensamblaje de partculas similares al virus (VLP). Ms recientemente, VLPs han sido producidos a partir de componentes de una amplia variedad de familias de virus incluidos Parvoviridae, Retroviridae (por ejemplo el VIH), y Flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C). Los VLPs pueden producirse en una variedad de sistemas de cultivo de clulas, incluidas las lneas de clulas de mamferos, las lneas celulares de insectos, hongos y clulas de las plantas. En la actualidad existe ya una vacuna basada en VLP en el mercado, la denominada vacuna del virus del papiloma humano (VPH), pero este tipo de vacunas podra funcionar para la gripe, segn un estudio llevado a cabo por investigadores del Centro de Investigacin de Vacunas de la Universidad de Pittsburgh, dando a lugar a vacunas de la gripe ms fuertes y de mayor duracin con unos tiempos de produccin y desarrollo ms cortos que las actuales, lo que permitira a las autoridades pblicas de salud reaccionar ms rpido ante una posible pandemia. Segn los investigadores, las VLP se pueden producir de forma rpida por varias vas, incluyendo su desarrollo en cultivos celulares o en plantas. Adems, si los genes del virus de la enfermedad son identificados, los investigadores pueden producir partculas para una vacuna sin una muestra real del agente (7).

7.3. Vacunas de Toxoides:

Son preparaciones obtenidas a partir de toxinas inactivadas de bacterias. La vacunacin con estos inmunizantes a gran escala no comenz hasta que en 1924 se hallo una forma segura y reproducible de inactivacin de las toxinas y los microorganismos patgenos, mediante su tratamiento con formaldehido; y despus de conseguir su atenuacin mediante pasos sucesivos en medios de cultivo in vitro (8). Los toxoides diftrico y tetnico y la vacuna contra la pertussis (conocida como vacuna triple o DPT) es un agente de inmunizacin combinado que se aplica por inyeccin para prevenir la difteria, el ttanos y la pertussis.

Ventajas y Desventajas
Ya habiendo considerado los tipos de vacunas, es momento de mencionar cuales son las perspectivas a mediano plazo de tener xito en cuanto a efectividad, en lo que se refiere a

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conferir un cuadro de inmunogenicidad potente. En ese contexto las que parecen tener una perspectiva con menos nubarrones son las vacunas gnicas, ya que permiten la vacunacin simultnea frente a varias enfermedades. No obstante se mencionan a continuacin una serie de ventajas y desventajas de los tipos de vacunas que existen y que fueron descritas anteriormente:

Muertas o inactivadas

* Tienden a ser ms estables. * Por lo general se administran por va parenteral. * No es posible la difusin de la infeccin a los no vacunados. Posee mayor seguridad. * Bajo costo de produccin.

Vacunas de Subunidades

* Menos efectos secundarios que las vacunas con el patgeno entero. * Bajo costo de produccin. Tabla No.1. Ventajas y desventajas de Vacunas Clsicas (9).

Lo anterior se menciona en cuanto a las caractersticas generales de las vacunas vivas atenuadas, las vacunas muertas o inactivadas y las vacunas de subunidades, ms sin embargo estas categoras encierran diferentes tipos de vacunas como se hizo al inicio de este texto, y cada uno de esas clases de vacunas poseen ventajas y desventajas unas frente a otras; no obstante cada tipo o clase de vacuna se siguen usando hoy en da porque son tiles de alguna forma para combatir alguna enfermedad de tipo infecciosa, y las caractersticas individuales de cada antgeno son las que marcan de alguna manera, la forma o la metodologa a usar para generar la vacuna.

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Tipo de Vacuna Vivas atenuadas

Ventajas
La inmunidad provocada es de larga duracin y muy intensa, parecida a la originada por la enfermedad natural. * Disminucin progresiva de la cantidad de antgeno necesario para inducir una respuesta humoral y otra celular, ambas elevadas. * Pequeas dosis de vacuna producen una buena respuesta inmune. * Bajo costo de produccin.

Desventajas
* En general, suele ser suficiente una dosis, salvo que se administre por va oral (vacuna antipolio). * La infeccin vacunal puede ser contagiosa para el entorno (ejemplo: vacuna antipolio oral), favoreciendo la dispersin de la infeccin por el virus atenuado en lugar del virus salvaje. Esto obliga a investigar si entre los convivientes del vacunado hay alguien para quien pudiera suponer un riesgo (inmunosuprimidos). * Posible reversin a la virulencia del patgeno. * Variaciones genticas en el caso de los virus. * Baja estabilidad. * La respuesta inmunitaria es menos intensa y duradera y fundamentalmente, de tipo humoral. * Se necesitan varias dosis para la primovacunacin y para mantener un nivel adecuado de anticuerpos sricos. * Muy a menudo requieren adyuvantes (cualquier sustancia que incorporada a una vacuna acelera, prolonga o potencia la respuesta inmunognica frente a la misma). * Presentan ms efectos secundarios. * Toxoides: Posible reversin a la toxicidad. * Polisacridos: sin respuesta humoral.

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Tabla No.2. Ventajas y Desventajas de vacunas de nueva generacin (2): Tipo de Vacuna Vacunas atenuadas mediante modificacin Gentica Vacunas Sintticas Ventajas * Respuesta humoral y celular. * No requiere de adyuvantes. * No requiere de administracin del patgeno en gran cantidad. * Seguridad. * Estabilidad trmica.
* No requieren de adyuvante, ni administracin del patgeno. * Potente respuesta humoral y no hay riesgo de seguridad.

Desventajas * Variaciones genticas en el caso de los virus. * Riesgo de seguridad.

* Caracterizacin del antgeno necesaria. * Sin respuesta celular. * No tiene formas nativas. * Sin respuesta celular y respuesta menos duradera. * No adquiere configuracin nativa. * Escasa respuesta celular. * Requiere dosis de recuerdo y adyuvantes. * Baja estabilidad. * Requiere de altos niveles de expresin del antgeno en el tejido vegetal. * Posible reversin a la virulencia del vector. * Resistencia/anticuerpos preexistentes. * Requiere dosis de recuerdo. * Respuesta celular insuficiente. * Posibles dosis de recuerdo. * Baja eficiencia en al transfeccin in vivo. * Respuestas inmunitarias frente al ADN, inmunotolerancia y autoinmunidad. * Expresin de antgenos inapropiadamente. * Altos costos de produccin.

Vacunas Anti-idiotipo Vacunas de Pptidos Recombinantes

Vacunas Comestibles Insercin o clonaje de genes de inters en vectores vivos

* Seguridad. * Fuerte inmunidad en mucosas y fcil administracin * Respuesta humoral y celular.

Vacunas de ADN

* Respuesta humoral y celular. * Estabilidad relativa, sin riesgos de seguridad. * Mltiples antgenos en la misma vacuna. * Vacunacin neonatal posible. *Antgenos de protenas transmembrana y fcil produccin.

CONCL SIN
* Uno de los campos donde tambin hay inters en mejorar la aplicacin de vacunas como medicamentos es en lo referido a su formulacin. Se busca conseguir vacunas que puedan liberar el antgeno de forma controlada empleando tcnicas de microencapsulacin (2) (recubrimiento del antgeno con un polmero biodegradable, que es el responsable de modular el proceso de liberacin), lo que no hara necesaria una dosificacin excesiva; o el uso de agentes adyuvantes, como el aluminio, que permite prolongar el efecto deseado e ideal de la vacuna. Sin embargo, no permite la obtencin de vacunas por mtodos de liofilizacin ni la congelacin; de ah que otra lnea de estudio sea la bsqueda de nuevos adyuvantes, que debern ser e scogidos acorde a:

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sarr

acunas

y y

La va de administracin. Tipo de vacuna

Ello traera a su vez otras ventajas en el medicamento en cuanto a: la disminucin de su costo, lo que conlleva a que se pueda emplear una menos cantidad de antgeno, y que no requiera de varias inmunizaciones para lograr el efecto deseado. * La comprensin del sistema inmune y de las complejas interacciones entre los agentes patgenos y el husped humano han abierto oportunidades para encontrar vacunas nuevas aplicando estrategias novedosas y usando tecnologas recientes y adyuvantes, y para mejorar la inocuidad y la eficacia de vacunas ya autorizadas en el mbito clnico. A esto han contribuido tambin diversos adelantos cientficos y tcnicos extraordinarios, entre ellos la tecnologa de recombinacin del cido desoxirribonucleico (ADN), la secuenciacin de genes y la sntesis peptdica, todas estas nombradas anteriormente dentro de las vacunas basadas en metodologas de Biologa Molecular. * Independiente de que tipo o clase de vacuna se trate, cada vacuna debe tener una inmunogenicidad, eficacia, seguridad y accesibilidad comprobadas. Asimismo, es necesario determinar la interaccin de la vacuna con otros antgenos y sus posibles consecuencias en presencia de determinados problemas de salud. Es de importancia bsica que las nuevas vacunas puedan administrarse simultneamente con otras vacunas, sin interferir con la respuesta inmunitaria provocada por ellas (10).

BIBLIOGRAFA (1) Parte introductoria de vacunas, tomado de: http://www.ceurconicet.gov.ar/imagenes/PICT_Dto_8_Vacunas%5B1%5D.pdf Consultado: 19 de abril de 2011 (11: 21 am) (2) Vacunas de Nueva Generacin, tomado de: http://www.genes.org/12_publicaciones/docs/pub_70_d.pdf . pp. 19-33, 52-53. Consultado: 18 de abril de 2011 (1:51 pm) (3) Zerda Ordez E,. Cmo redactar un ensayo: gua mnima, Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia, Bogot. pp. 1-4 (4) Notas de clase de Microbiologa Farmacutica, Universidad Nacional de Colombia. (5). Artculo: Introduccin de la vacuna conjugada contra Hib en Chile y Uruguay, tomado de: http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S102049891999000300022&script=sci_abstract&tlng= es. pp. 200. (6). Artculo: Vacunas Conjugadas. Tomado de: http://www.pap.es/files/1116-494pdf/519.pdf. pp. 65-66. (7). Link: VLP para el desarrollo de vacunas frente a la gripe. Tomado de: http://www.vacunas.org/index.php?option=com_content&task=view&id=9296&Itemid=0. (8). Link: Vacunas. Tomado de: http://www.salud.bioetica.org/vacunas.htm. (9). Link: Tipos de Vacunas. Tomado de: http://www.alfabeta.net/vacunas/vacunas-tipos.xtp. (10). Artculo: El desarrollo de nuevas vacunas: generacin de informacin para la toma de decisiones. Tomado de: http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S102049892004000100001.

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