UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FARMCIA

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS A PARTIR DO POLI-(3HIDROXIBUTIRATO) E DIFERENTES ADJUVANTES DE FORMULAO VISANDO O PROLONGAMENTO DA LIBERAO DO IBUPROFENO PARA O TRATAMENTO LOCALIZADO DA ARTRITE

JULIANA BIDONE

Florianpolis 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FARMCIA

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS A PARTIR DO POLI-(3HIDROXIBUTIRATO) E DIFERENTES ADJUVANTES DE FORMULAO VISANDO O PROLONGAMENTO DA LIBERAO DO IBUPROFENO PARA O TRATAMENTO LOCALIZADO DA ARTRITE

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Farmcia como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Farmcia.

Orientadora: Profa. Dra. Elenara Lemos-Senna

JULIANA BIDONE

Florianpolis 2008

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS A PARTIR DO POLI-(3HIDROXIBUTIRATO) E DIFERENTES ADJUVANTES DE FORMULAO VISANDO O PROLONGAMENTO DA LIBERAO DO IBUPROFENO PARA O TRATAMENTO LOCALIZADO DA ARTRITE POR JULIANA BIDONE

Esta dissertao foi julgada adequada para obteno do ttulo de Mestre em Farmcia e aprovada em sua forma final pelo Programa de Ps-Graduao em Farmcia da Universidade Federal de Santa Catarina.

____________________________ Profa. Dra. Elenara M. T. Lemos-Senna Orientadora

____________________________ Profa. Dra. Elenara M. T. Lemos-Senna Coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Farmcia

Banca Examinadora:

_______________________________ Profa. Dra. Slvia Stanisuaski Guterres UFRGS

_______________________________ Prof. Dr. Alfredo Tburcio Nunes Pires -UFSC

_______________________________ Profa. Dra. ngela Machado de Campos - UFSC

 Martha e Daniela.

Agradecimentos

Profa. Dra. Elenara Lemos-Senna pela oportunidade concedida, pela orientao e por possibilitar a concretizao deste sonho. A todas as Profas. do Laboratrio de Farmacotcnica por terem desejado o sucesso deste trabalho, de forma explcita ou por um simples olhar de incentivo. Ao Prof. Dr. Valdir Soldi e Marli Soldi pela sempre presente disposio em ajudar e compartilhar seus conhecimentos. Ao Prof. Dr. Rogrio Tonussi pelo acolhimento e carinho, e por viabilizar a realizao de importantes segmentos deste trabalho. Ao Prof. Dr. Alfredo Tibrcio N. Pires e a todos os integrantes do Laboratrio de Polmeros, por permitirem a utilizao de seu laboratrio, e principalmente, querida Giovana, pela pacincia, pelas conversas e por ter-me socorrido inmeras vezes. Aos amigos do Laboratrio de Neurobiologia da Nocicepo, seres humanos simplesmente incrveis e admirveis. Em especial, Taty morena, no apenas por sua ajuda nos experimentos, mas por sua luz e a, sempre contagiante, alegria de viver. Por ser um exemplo de pesquisadora e de mulher. Ao Prof. Dr. Marcos A. Segatto pelos primeiros ensinamentos na trajetria da pesquisa e por ter disponibilizado seu laboratrio sempre que se fez necessrio. Sandra e ao Nilson, exemplos de luta, trabalho e honestidade. Aos amigos da Farmacotcnica, pela pacincia extrema, pelo carinho, e por esta amizade reconfortante. Dani, Tati loira, Andria e C, obrigada tambm pelas conversas (teraputicas). Aos amigos do Controle de Qualidade, da Farmacognosia, da Virologia Aplicada e de todos os cantos da UFSC, dos quais no cito nomes com receio de ser injusta, mas a quem deixo meus profundos agradecimentos por tudo, pelo carinho, ateno, pacincia e, claro, por todos os momentos de diverso e alegria. A todos os demais amigos (de fora do mestrado), em especial Simone e Raquel, pelo companheirismo, amizade, compreenso e por todas as longas conversas, regadas a vinho e sorrisos. Tica, companheira inseparvel na redao desta dissertao. E, em especial, minha me Martha e minha irm Daniela por existirem e por sempre estarem ao meu lado, apesar de todas as dificuldades e diferenas.

Podemos escolher o que semear, mas somos obrigados a colher aquilo que plantamos. (Provrbio chins)

SUMRIO

Lista de Tabelas .................................................................................................... XII Lista de Figuras .................................................................................................... XIV Lista de Siglas e Abreviaturas ............................................................................ XVII Resumo .................................................................................................................. XIX Abstract .................................................................................................................. XX

1. INTRODUO E OBJETIVOS ............................................................................. 21 1.1 Introduo ........................................................................................................... 22 1.2 Objetivos ............................................................................................................. 25 1.2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 25 1.2.2 Objetivos Especficos ...................................................................................... 25
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2. REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................ 26 2.1 Microencapsulao de frmacos ........................................................................ 27 2.2 Polihidroxialcanoatos .......................................................................................... 31 2.2.1 Histrico dos PHAs .......................................................................................... 32 2.2.2 Biossntese dos PHAs ..................................................................................... 34
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2.2.3 Caractersticas qumicas e fsico-qumicas dos PHAs .................................... 36

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2.2.4 Degradao ..................................................................................................... 38

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2.2.5 Toxicidade e biocompatibilidade dos polihidroxialcanoatos ............................ 40 2.2.6 Aplicaes do PHA em sistemas de liberao ................................................ 42
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2.3 Artrite Reumatide .............................................................................................. 52 2.4 Ibuprofeno .......................................................................................................... 57

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3. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................... 61

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3.1 Materiais ............................................................................................................. 62

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3.1.1 Matrias-primas ............................................................................................... 62

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3.1.2 Reagentes e solventes .................................................................................... 62

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3.1.3. Equipamentos ................................................................................................. 62 3.2 Mtodos : PARTE I - Avaliao do efeito da adio de trimiristato de glicerila sobre a liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli (3hidroxibutirato)........................................................................................................... 64 3.2.1 Preparao e caracterizao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir de blendas de poli (3-hidroxibutirato) e trimiristato de glicerila ................................................................................................................................... 64 3.2.1.1 Preparao das microesferas ....................................................................... 64 3.2.1.2 Avaliao da viscosidade cinemtica da fase interna .................................. 65
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3.2.1.3 Caracterizao das microesferas ................................................................. 66

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3.2.1.3.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas ............................................................................................................. 66

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3.2.1.3.1.1 Curva de calibrao do IBF em metanol ................................................ 66

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3.2.1.3.1.2 Determinao da eficincia de encapsulao e do teor de ibuprofeno... 67 3.2.1.3.2 Avaliao da morfologia das microesferas ................................................ 68 3.2.1.3.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) ............................. 68 3.2.1.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas ............... 69
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3.2.1.4.1 Curva de calibrao do IBF em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 ................ 69

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3.2.1.4.2 Determinao da solubilidade do IBF no meio de liberao ..................... 69 3.2.1.4.3 Avaliao do perfil de liberao do IBF em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 ................................................................................................................................... 69 3.2.2 Preparao e avaliao da morfologia de filmes obtidos a partir de blendas de poli (3-hidroxibutirato) e trimiristato de glicerila ........................................................ 70
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3.2.2.1 Preparao dos filmes .................................................................................. 70

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3.2.2.2 Avaliao da morfologia dos filmes .............................................................. 70

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PARTE II - Efeito da adio de poli (D-L-cido ltico)-co-polietilenoglicol (PLA-PEG) e gelatina (GEL) sobre as propriedades fsico-qumicas das partculas e sobre o perfil de liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli(3-hidroxibutirato) ................................................................................................................................... 71
.

3.2.3 Preparao e caracterizao das microesferas .............................................. 71

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3.2.3.1 Preparao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG ................................................................................ 71 3.2.3.2 Preparao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir do P(3HB) e gelatina ..................................................................................................... 72
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3.2.3.3 Caracterizao fsico-qumica das microesferas .......................................... 73

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3.2.3.3.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas ............................................................................................................. 73

..

3.2.3.3.2 Avaliao da morfologia das microesferas ................................................ 73

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3.2.3.3.3 Determinao do dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas ............................................................................................................. 74

..

3.2.3.3.4 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) ............................. 74

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3.2.3.3.5 Difrao de Raios-X .................................................................................. 74

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3.2.3.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas ............... 74

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3.2.3.5. Preparao e avaliao da morfologia de filmes obtidos a partir de blendas de poli (3-hidroxibutirato) e poli(D,L-cido ltico)-b-polietilenoglicol .................................................................................................................................... 75 3.2.3.5.1 Preparao dos filmes ............................................................................... 75 3.2.3.5.2 Avaliao da morfologia dos filmes ........................................................... 76
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PARTE III- Avaliao preliminar da eficcia teraputica in vivo do ibuprofeno liberado a partir das microesferas em modelo de artrite crnica induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA) ..................................................................... 77
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3.2.4 Animais ............................................................................................................ 77

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3.2.5 Protocolos Experimentais ................................................................................ 77

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3.2.5.1 Induo da artrite crnica pelo Adjuvante Completo de Freund (CFA) ................................................................................................................................... 77 3.2.5.2 Avaliao da incapacitao articular ............................................................ 78
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3.2.5.3 Avaliao do edema articular ....................................................................... 79

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3.2.5.4 Leucograma do fluido sinovial ........................................................................ 79 3.2.6 Avaliao da resposta teraputica do ibuprofeno aps administrao i.a. das microesferas ............................................................................................................. 80
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3.2.7 Anlise estatstica dos resultados ................................................................... 81

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4. RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................... 82 PARTE I - Efeito da adio de trimiristato de glicerila sobre a liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli (3-hidroxibutirato) ................................................... 83
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4.1 Preparao e caracterizao das microesferas ................................................. 83

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4.1.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas ............................................................................................................. 84

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4.1.2 Caracterizao fsico-qumica ......................................................................... 88

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4.1.2.1 Avaliao da morfologia das microesferas ................................................... 88 4.1.2.2 Avaliao da morfologia dos filmes .............................................................. 95
.

4.1.2.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) ................................ 97

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4.1.3 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas ................ 100
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PARTE II - Efeito da adio de poli(D,L-cido lctico)-b-poli(etilenoglicol) (PLA-PEG) e gelatina (GEL) sobre as propriedades fsico-qumicas e sobre o perfil de liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli (3-hidroxibutirato) ................................................................................................................................. 105 4.2 Preparao e caracterizao das microesferas a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG ................................................................................................................ 105 4.2.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas ........................................................................................................... 106 4.2.2 Caracterizao fsico-qumica ....................................................................... 108 4.2.2.1 Avaliao da morfologia das partculas....................................................... 108 4.2.2.2 Avaliao da morfologia de filmes de P(3HB) e de blendas ...................... 111
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4.2.2.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) .............................. 111 4.2.2.4 Difrao de Raio-X ..................................................................................... 115
.

4.2.3 Determinao do dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas ........................................................................................................... 120
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4.2.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas ................ 121
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PARTE III - Avaliao preliminar da eficcia teraputica in vivo do ibuprofeno liberado a partir das microesferas em modelo de artrite crnica induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA) ................................................................... 129
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4.3 Avaliao da eficcia teraputica do ibuprofeno liberado a partir das microesferas ........................................................................................................... 129
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5. CONCLUSES .................................................................................................. 133 6. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 136

XII

LISTA DE TABELAS TABELA 1 Fatores que demonstraram afetar a velocidade de liberao de frmacos a partir de micropartculas de PHAs, preparadas pela tcnica de emulso evaporao do solvente ........................................................................................... 43
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TABELA 2 Solubilidade aproximada do ibuprofeno em temperatura ambiente ...... 58 TABELA 3 Composio das microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e TMG ....................................................................................................................... 66 TABELA 4 Composio das microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG ............................................................................................................... 71 TABELA 5 Composio das formulaes de microesferas preparadas a partir do P(3HB) e gelatina 10:1 ............................................................................................. 73 TABELA 6 Delineamento dos grupos de animais utilizados para avaliar a resposta teraputica com ibuprofeno liberado a partir das microesferas ................................ 80 TABELA 7 Anlise dos dados da regresso obtidos a partir da curva de calibrao do ibuprofeno por espectrofotometria de absoro no ultravioleta ........................... 85 TABELA 8 Valores de eficincia de encapsulao e de teor de ibuprofeno nas microesferas .............................................................................................................. 86 TABELA 9 Anlise da varincia obtida a partir dos valores de teor de frmaco ................................................................................................................................... 87 TABELA 10 Valores da diferena entre as mdias dos teores de IBF (mg/ 100mg microesferas) para as formulaes .......................................................................... 87 TABELA 11 Viscosidade cinemtica de solues de P(3HB) e trimiristato de glicerila em clorofrmio das microesferas e das matrias primas utilizadas ......................... 90 TABELA 12 Resultados da anlise por calorimetria exploratria diferencial .......... ................................................................................................................................. 100 TABELA 13 Anlise dos dados da regresso obtidos a partir da curva de calibrao do ibuprofeno por espectrofotometria de absoro no ultravioleta ........................ 101 TABELA 14 Valores eficincia de encapsulao e de teor de ibuprofeno nas microesferas ..................................................................................................................... 107 TABELA 15 Anlise da varincia obtida a partir dos valores de teor de frmaco . 107 TABELA 16 Valores da diferena entre as mdias dos teores de IBF (mg/ 100 mg microesferas) obtidas para as formulaes ............................................................ 108

XIII

TABELA 17 Resultados obtidos por anlise de calorimetria exploratria diferencial das microesferas e das matrias primas utilizadas ................................................ 113 TABELA 18 Resultados obtidos por anlise de calorimetria exploratria diferencial das microesferas e das matrias primas utilizadas ................................................ 114 TABELA 19 Intensidade dos picos de difrao de raios-X obtidos a partir dos difratogramas do frmaco, P(3HB), PLA-PEG e microesferas brancas e contendo IBF........................................................................................................................... 119 TABELA 20 Resultados obtidos por difrao a laser para dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas ........................................................ 121 TABELA 21 Anlise da varincia referente aos valores de percentagem obtidos na primeira hora de ensaio de liberao ..................................................................... 123 TABELA 22 Valores de diferena entre as mdias do percentual de IBF liberado aps uma hora ........................................................................................................ 124 TABELA 23 Anlise da varincia obtida a partir dos valores de AUC dos perfis de liberao, obtidas aps 96 horas de ensaio ........................................................... 125 TABELA 24 Valores da diferena entre as mdias das reas sob as curvas dos perfis obtidos aps 96 horas .................................................................................. 125 TABELA 25 Dados de regresso obtidos aps aplicao do modelo de BakerLonsdale nos perfis de liberao do ibuprofeno a partir das microesferas ............ 127

XIV

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Rota metablica para sntese de PHAs .................................................. 35 FIGURA 2 Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos ............................................... 37 FIGURA 3 Esquema do tratamento da artrite reumatide ....................................... 56 FIGURA 4 Estrutura qumica do ibuprofeno ............................................................. 57 FIGURA 5 Esquema ilustrativo da preparao das microesferas pelo mtodo de emulso/evaporao do solvente ............................................................................. 65 FIGURA 6 Esquema ilustrativo da preparao de microesferas de P(3HB) e gelatina ................................................................................................................................... 72 FIGURA 7 (A) Ratas com as sapatilhas metlicas e (B) cilindro de ao inox utilizado na determinao da incapacitao articular atravs da medida do tempo de elevao da pata (TEP,s) ........................................................................................................ 78 FIGURA 8 Medida do dimetro articular com auxlio de um paqumetro no-digital ................................................................................................................................... 79 FIGURA 9 Estrutura qumica do trimiristato de glicerila ........................................... 84 FIGURA 10 Curva de calibrao do ibuprofeno em metanol obtida por espectrofotometria de absoro no ultravioleta ........................................................ 85 FIGURA 11 Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo frmaco IBF preparadas com solvente clorofrmio a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes ........................................................................................................................ 89 FIGURA 12 Micrografias obtidas por MEV das microesferas brancas preparadas com solvente diclorometano a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes......................................................................................................................... 92 FIGURA 13 Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo frmaco IBF preparadas com solvente diclorometano a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes................................................................................................................ 93 FIGURA 14 Micrografias obtidas por MEV das microesferas de P(3HB):TMG 3:1 brancas preparadas utilizando diclorometano como solvente e (a) com e (b) sem adio de lcool isoproplico na fase externa da emulso, em aumento de 1000 vezes......................................................................................................................... 94

XV

FIGURA 15 Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes obtidos a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, usando clorofrmio como solvente................................. 96 FIGURA 16 Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes preparados a partir do (a) P(3HB) e (b) P(3HB):TMG 3:1, usando diclorometano como solvente .......................................................................................................... 97 FIGURA 17 Termogramas obtidos por DSC aps anlise do (a) IBF, (b) P(3HB), (c) TMG, (d) Microesferas P(3HB) brancas, (e) Microesferas P(3HB) com IBF, (f) Mistura fsica de P(3HB), TMG e IBF, (g) Microesferas P(3HB):TMG 3:1 brancas e (h) Microesferas P(3HB): TMG 3:1 com IBF................................................................... 98 FIGURA 18 Curva de calibrao do ibuprofeno em tampo fosfato 0,02M pH 7,4, obtida por espectrometria de absoro no ultravioleta........................................... 101 FIGURA 19 Perfis de liberao obtidos a partir das microesferas preparadas usando (a) clorofrmio e (b) diclorometano como solvente da fase interna ........................ 103 FIGURA 20 Micrografias obtidas por MEV das microesferas obtidas a partir de (a) P(3HB) e (b) P(3HB):TMG 3:1 em clorofrmio e (c) P(3HB):TMG 3:1 em diclorometano, aps sete dias do incio do ensaio de liberao ............................ 104 FIGURA 21 Estrutura qumica do PLA-PEG. n= unidades de etileno glicol, m= unidades de cido ltico.......................................................................................... 106 FIGURA 22 Micrografias obtidas por MEV das microesferas brancas preparadas a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):PLA-PEG 3:1, (c) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (d) P(3HB):gelatina, (e) P(3HB):gelatina (etanol) ........................................................ 109 FIGURA 23 Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo IBF preparadas a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):PLA-PEG 3:1, (c) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (d) P(3HB):gelatina e (e) P(3HB):gelatina (etanol). ......................................... 110 FIGURA 24 Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes de P(3HB):PLA-PEG 3:1 ............................................................................................. 111 FIGURA 25 Termogramas obtidos por DSC para (a) IBF, (b) P(3HB), (c) PLA-PEG, (d) Mistura fsica de P(3HB), PLA-PEG e IBF, (e) Microesferas P(3HB) brancas, (f) Microesferas P(3HB):PLA-PEG 3:1 brancas , (g) Microesferas P(3HB) com IBF, (h) Microesferas P(3HB): PLA-PEG 3:1 com IBF......................................................... 112 FIGURA 26 Termogramas obtidos por DSC para (a) IBF, (b) P(3HB), (c) Gelatina; (d) Mistura fsica de P(3HB), gelatina e IBF, (e) Microesferas P(3HB):gelatina 10:1 brancas e (f) Microesferas P(3HB): gelatina 10:1 com IBF..................................... 115

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FIGURA 27 Difratogramas obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) microesferas de P(3HB) brancas e (d) microesferas de P(3HB) contendo IBF ................................................................................................................................. 116 FIGURA 28 Difratogramas obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) PLA-PEG, (d) microesferas P(3HB):PLA-PEG 3:1 brancas, (e) microesferas P(3HB):PLA-PEG 1:1 brancas, (f) microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 com IBF e (g) microesferas P(3HB):PLA-PEG 1:1 com IBF..................................................... 117 FIGURA 29 Difratogramas obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) microesferas P(3HB): gelatina 10:1 brancas e (d) microesferas de P(3HB):gelatina 10:1 com IBF........................................................................................................... 118 FIGURA 30 Histograma da distribuio granulomtrica das microesferas obtidas a partir de P(3HB), P(3HB):gelatina 10:1, P(3HB):gelatina 10:1 (etanol), P(3HB):PLA-PEG 3:1 e P(3HB):PLA-PEG 1:1 ....................................................... 121 FIGURA 31 Perfis de liberao obtidos a partir de microesferas P(3HB) puro , P(3HB):gelatina 10:1, P(3HB):gelatina 10:1 (etanol), P(3HB):PLA-PEG 3:1, P(3HB):PLA-PEG 1:1 e ibuprofeno livre, aps (a) 168 horas e (b) 24 horas de ensaio...................................................................................................................... 123 FIGURA 32 Grfico obtido aps aplicao do modelo Baker-Lonsdale nos perfis de liberao do IBF a aprtir das microesferas de P(3HB), P(3HB):GEL 10:1, P(3HB): GEL 10:1(etanol), P(3HB):PLA-PEG 3:1 e P(3HB):PLA-PEG 1:1.......................... 127 FIGURA 33 Micrografias obtidas por MEV das microesferas de (a) P(3HB):PLA-PEG 3:1, (b) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (c) P(3HB):GEL e (d) PHB:GEL(etanol), aps sete dias do incio do ensaio de liberao ..................................................................... 128 FIGURA 34 Avaliao da resposta antinociceptiva de microesferas contendo ibuprofeno atravs da medida de incapacitao articular. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey) ............... 130 FIGURA 35 Avaliao do aumento do dimetro articular de microesferas contendo ibuprofeno. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey). *** e ## indicam diferena estatstica entre os grupos tratados com micropartculas de ibuprofeno e salina (p<0.001) e os grupos tratados com micropartculas de ibuprofeno e ibuprofeno livre (p<0.01) ..................................... 131 FIGURA 36 Avaliao da migrao celular de microesferas contendo ibuprofeno. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey) ..................................................................................................................... 132

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Hexp
3HB 3HHx 3HV 4HB a/o a/o/a AINES ANOVA AR AUC COX Cst d.m.s DSC EBV F F crtico gl HA IBF MEV MQ o/a

variao da entalpia de fuso experimental 3- hidroxibutirato 3-hidroxihexanoato 3-hidroxivalerato 4- hidroxibutirato angstron gua em leo gua em leo em gua antinflamatrios no-esteroidais anlise de varincia artrite reumatide rea sob a curva ciclooxigenase centistokes diferena mnima significativa Calorimetria Exploratria Diferencial vrus Epstein-Barr valor de F calculado valor de F tabelado ao nvel de significncia de 5% grau de liberdade hidroxicido ibuprofeno microscopia eletrnica de varredura mdia dos quadrados leo em gua

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o/o P(3HB) P(3HB)a

leo em leo poli-(3-hidroxibutirato) poli [(R,S)-3-hidroxibutirato] attico

P(3-HB-co-HV) poli-(3-hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) P(3HV) p/p p/v PCL PEG PGs PHAs PHBHHx PLA PLAGA PLA-PEG PVA r2 RPM s s/o/a SQ Tg Tm TMG Xc TEP DA poli-(3-hidroxivalerato) peso por peso peso por volume policaprolactona poli(etilenoglicol) prostaglandinas polihidroxialcanoatos poli(hidroxibutirato-co-hidroxihexanoato) poli-(cido ltico) poli(cido ltico- co-gliclico) poli-(D-L-cido ltico)-b-poli(etilenoglicol) lcool polivinlico coeficiente de regresso rotaes por minuto desvio padro slido em leo em gua soma dos quadrados temperatura de transio vtrea temperatura de fuso trimiristato de glicerila grau de cristalinidade relativo tempo de elevao da pata dimetro articular

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RESUMO

Polihidroxialcanoatos (PHAs) so polisters biodegradveis e biocomptiveis, produzidos por uma ampla variedade de microorganismos e estocados como fonte de carbono e energia. Poli-(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) o membro mais comum desta famlia e tem sido usado na obteno de carreadores de frmacos. Na maior parte dos casos, a liberao de frmacos a partir de microesferas de P(3HB) ocorre em taxas excessivas e tem sido assumido que o fenmeno de liberao mais dependente da velocidade de dissoluo do frmaco do que da degradao da matriz. A estratgia de misturar diferentes materiais em uma formulao pode ser empregada para modificar as propriedades fsico-qumicas de microesferas e controlar a liberao. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da formao de blendas de P(3HB) com trimiristato de gricerila (TMG) ou poli (D,L-cido ltico)-b-poli (etilenoglicol) (PLA-PEG) e da obteno de partculas compostas de P(3HB) e gelatina (GEL) sobre as caractersticas fsico-qumicas das microesferas e o perfil de liberao do ibuprofeno. O mtodo de emulso/evaporao do solvente foi empregado no preparo das microesferas de P(3HB):TMG (9:1, 4:1, 3:1 e 1:1) e P(3HB):PLA-PEG (3:1 e 1:1), usando clorofrmio ou diclorometano/ lcool isoproplico como solventes. As microesferas de P(3HB):GEL 10:1 foram preparadas usando o procedimento de dupla emulso/evaporao do solvente. Elevados valores de eficincia de encapsulao foram verificados em todas as formulaes testadas. Partculas esfricas e de superfcie rugosa, apresentando dimetro mdio entre 21,93 e 41,55 m, foram obtidas. A utilizao de diclorometano e o aumento da proporo de TMG na blenda conduziram reduo da porosidade das partculas. Entretanto, os estudos de liberao em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 mostraram que a associao de P(3HB) e TMG no conduz ao controle de liberao do IBF, a qual foi bastante pronunciada na primeira hora de ensaio. Elevados valores de liberao inicial (efeito burst) tambm foram observados nas microesferas preparadas a partir das blendas de P(3HB) e PLA-PEG 3:1 e P(3HB):GEL 10:1. Neste ltimo caso, a adio de etanol acelerou a liberao do IBF, indicando que a adio do solvente afeta a localizao do frmaco na matriz. As anlises por calorimetria exploratria diferencial (DSC) e difrao de raios-x indicaram a reduo da cristalinidade do P(3HB) somente quando a blenda P(3HB):PLA-PEG 1:1 foi testada. Entretanto, independente das condies de preparo das microesferas, o IBF pareceu estar parcialmente disperso na sua forma amorfa ou molecular na matriz. Apesar da utilizao da blenda de P(3HB) e PLA-PEG 1:1 ter conduzido reduo da cristalinidade, a velocidade de liberao foi mais prolongada quando as microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 foram testadas, sugerindo que o grau de hidratao da matriz pode ter interferido na cintica de liberao. A avaliao in vivo do ibuprofeno encapsulado nas microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 foi conduzida em ratos artrticos (modelo CFA). Os resultados obtidos indicaram reduo do edema articular e da migrao celular aps administrao das microesferas contendo IBF, quando comparado aos grupos tratados com IBF livre e microesferas brancas, respectivamente. Palavras-chave: microesferas, poli-(3-hidroxibutirato), ibuprofeno, liberao controlada, blendas polimricas, compsitos.

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ABSTRACT Title: Development of microspheres from poly-(3-hydroxybutyrate) and different formulation adjuvants aiming to prolong the release of the ibuprofen for local treatment of arthritis
Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable and biocompatible polyesters produced by a wide variety of microorganisms, which are accumulated by the bacteria as an energy and carbon storage material. Poly-(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) is the most common member of this family, and it has been used to obtain polymer-based drug carriers. In most of the cases, the release of drugs from P(3HB) microspheres occurs at excessive rates and it has been assumed that the release phenomenon is more dependent on drug dissolution rather than on matrix degradation. The strategy of blending multiple polymers in a formulation may be employed to modify physicochemical properties of microspheres and control drug release. The aim of this study was to evaluate the effect of blending P(3HB) and glyceryl trimyristate (TMG) or poly(D,L-lactide)-b-polyethylene glycol (PLA-PEG), and of preparing P(3HB) and gelatin (GEL) composites on IBF release rate from microspheres. P(3HB), P(3HB):TMG (9:1, 4:1, 3:1 and 1:1) and P(3HB):PLA-PEG (3:1 or 1:1) microspheres were prepared by a single emulsion/evaporation method, using chloroform or methylene chloride/isopropilic alcohol as solvent. P(3HB):GEL (10:1) composite microspheres were prepared using a double emulsion/evaporation process. The encapsulation efficiency was high in all tested formulations. Spherical particles displaying rough surface and mean diameter ranging from 21.93 m to 41.55 m were obtained. The increasing of TMG ratio in the blend lead to the reduction of the particle porosity in a concentration-dependent manner, since the micropheres prepared from a PHB:TMG ratio of 1:1 were less porous than those obtained from PHB:TMG ratio of 9:1. However, even though the addition of glyceryl trimyristate in the internal phase of the emulsion to have resulted in a noticeable reduction of the particle porosity, the association of P(3HB) and TMG did not allow the control of IBF release, which was very quick in the first hour of assay. Burst effect was also observed in the IBF release profiles obtained from P(3HB):PLA-PEG 3:1 and P(3HB):GEL 10:1 microspheres. Upon ethanol addition, a faster IBF release was verified from P(3HB)/GEL composite microspheres, indicating that the solvent addition affects the location of the drug in the matrix. DSC and XRD analyses indicated the reduction of the crystallinity degree of the P(3HB) only when the 1:1 P(3HB):PLA-PEG blend was used to prepare the microspheres. However, independent of the conditions under which microspheres were prepared, the IBF appeared to be partially dispersed in its amorphous or molecular form in the matrix. Although the reduction of the crystallinity degree of P(3HB) has been verified in 1:1 P(3HB):PLA-PEG microspheres, the IBF release rate was more prolonged from 3:1 P(3HB):PLA-PEG microspheres, indicating that the matrix hydration degree had played an important role in the release kinetic. The in vivo evaluation of ibuprofen-loaded 3:1 P(3HB):PLA-PEG microspheres was carried out in arthritic rats (CFA model). The articular edema and the cell migration were significantly reduced after IBF-loaded microspheres administration, when compared with the groups treated with IBF alone and unloaded microspheres, respectively. Keywords: microspheres, poly-(3-hydroxybutyrate), ibuprofen, controlled release, polymer blends, composites.

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INTRODUO E OBJETIVOS

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1.1 INTRODUO A preocupao com o sucesso de tratamentos realizados com frmacos de caractersticas singulares, como toxicidade elevada, estreita faixa teraputica, rpida metabolizao, ou que precisam ser empregados em esquemas teraputicos de longa durao, levou os pesquisadores do setor farmacutico a buscarem novas alternativas de administrao, alm daquelas consideradas convencionais. Este interesse torna-se ainda mais pertinente quando se trata de frmacos de uso contnuo, destinados terapia de doenas crnico-degenerativas. Neste contexto, as micropartculas tm sido bastante estudadas, pois oferecem um importante meio de controlar a liberao dos frmacos, por meio do emprego de uma ampla variedade de materiais polimricos e de metodologias para a sua obteno (WATTS et al., 1990; FREIBERG, ZHU, 2004; FREITAS, MERKLE, GANDER, 2005). A flexibilidade de se projetar e selecionar polmeros com caractersticas nicas, capazes de se adequarem a diferentes situaes, garante uma ampla aplicabilidade destes materiais na medicina. Dentre os materiais polimricos, destacam-se os polmeros biodegradveis, que podem ser usados, por exemplo, na substituio temporria de tecidos ou como sistemas de liberao de frmacos (ORFICE, 2008). De acordo com a forma de obteno, os polmeros biodegradveis podem ser classificados em duas categorias, sintticos e naturais. Dentre os polmeros sintticos mais utilizados esto o poli (cido gliclico) (PGA), o poli (cido ltico) (PLA), os copolmeros do cido ltico e gliclico (PLAGA) e a policaprolactona (PCL). Tais polmeros, pertencentes classe dos polisteres alifticos, sofrem hidrlise qumica ou enzimtica de suas ligaes steres no meio fisiolgico, formando produtos de degradao que so metabolizados e eliminados do organismo. Em alternativa ao uso destes polmeros consideram-se os polihidroxialcanoatos (PHAs). Tais polmeros so polisteres de hidrxicidos estereoregulares e opticamente ativos, no sendo produzidos por sntese qumica, mas biossinteticamente por bactrias a partir de matrias primas naturais. Os membros mais comuns da famlia dos PHAs so o poli-(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o copolmero poli-(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)) (VERHOOGT, RAMSAY, FAVIS, 1994; ZINN et al., 2001).

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No Brasil, a produo de PHAs teve nicio na dcada de 90, por meio de um projeto cooperativo entre o Instituto de Pesquisa e Tecnologia (IPT), Copersucar e Universidade de So Paulo, usando carboidratos como material de partida, em especial o acar de cana (IPT, 2008). Desde ento, a produo nacional destes polmeros tem aumentado consideravelmente, tornando o Brasil o nico pas produtor de P(3HB) e P(3HB-co-3HV) da Amrica Latina. Estes polmeros tm sido produzidos a partir de matrias-primas de baixo custo, fato que, em conjunto com suas caractersticas de biodegradabilidade e biocompatibilidade, torna-os materiais promissores no que se refere ao desenvolvimento de medicamentos inovadores. A degradao hidroltica do P(3HB) leva formao do monmero cido D(-)-3-hidroxibutrico, um constituinte normal do sangue. No entanto, apesar das suas vantagens, a utilizao do P(3HB) torna-se limitada por sua lenta velocidade de biodegradao e alta estabilidade hidroltica nos tecidos. A degradao hidroltica do P(3HB) em condies fisiolgicas pode levar meses e est relacionada com a sua elevada cristalinidade e natureza hidrofbica das cadeias alqulicas (RENARD et al., 2003). A elevada cristalinidade responsvel tambm pela grande porosidade observada nas matrizes obtidas a partir do P(3HB), o que torna difcil o controle da liberao. Um recente estudo realizado por Carmingnan (2006) demonstrou uma rpida liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de P(3HB), ou seja, cerca de 70%, na primeira hora de ensaio, contrastando com a liberao de unicamente 25% do frmaco encapsulado a partir das microesferas de PLAGA. Neste caso, a velocidade de liberao do ibuprofeno foi claramente dependente da cristalinidade da matriz polimrica empregada, sugerindo tambm que a localizao do frmaco na partcula depende deste parmetro. A melhor disperso do frmaco, encontrada nos sistemas matriciais amorfos, e o aumento da interao frmaco-polmero podem ser considerados fatores determinantes no controle da velocidade de liberao (FREIBERG & ZHU, 2004). A associao de polmeros em sistemas matriciais tem se mostrado uma estratgia promissora para a obteno de novos materiais com melhor desempenho. Essas misturas, denominadas blendas, permitem a obteno de materiais com propriedades diferentes s dos componentes puros, sendo efetivas para alterar as propriedades fsicas e mecnicas de cada polmero individualmente. Desta maneira, as caractersticas fsico-qumicas das microesferas de P(3HB) podem ser

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modificadas por meio da obteno de blendas com outros materiais, na busca da modulao do perfil de liberao de frmacos (BHATT, SHAH, TRIVEDI, 2008). Outra estratgia que tem sido adotada para a alterao da cintica de liberao de substncias ativas encapsuladas em sistemas matriciais consiste na obteno de partculas compostas, ou seja, compsitos. Materiais compsitos podem ser definidos como materiais formados de dois ou mais constituintes com distintas composies, estruturas e propriedades e que esto separados por uma interface. O objetivo principal em se produzir compsitos de combinar diferentes materiais para produzir um nico dispositivo com propriedades superiores s dos componentes unitrios (YU, DEAN, LI, 2006). Neste contexto, ambas estratgias de formao de blendas e de obteno de partculas compostas foram estudadas neste trabalho, visando a modulao do perfil de liberao do ibuprofeno a partir das microesferas de P(3HB). O ibuprofeno um antiinflamatrio no esteroidal (AINE) utilizado para o tratamento da osteoartrite e artrite reumatide aguda e crnica. Devido a sua meia vida biolgica relativamente curta (1 a 3 horas) e aos seus efeitos colaterais indesejveis, o ibuprofeno um potencial candidato para a utilizao em sistemas de liberao prolongada. Alm disso, especial interesse tem sido dado administrao intraarticular de AINES, como alternativa ao uso de corticosterides. Entretanto, seu curto tempo de meia-vida no lquido sinovial faz com que eles tenham que ser administrados vrias vezes, para a manuteno dos nveis teraputicos. Assim, o triglicerdeo trimiristato de glicerila, o polmero em bloco poli-(cido ltico-bpolietilenoglicol) e a gelatina, materias adequados administrao parenteral, foram testados para a obteno de blendas e/ou partculas compostas. Com estas estratgias buscou-se mudar as caractersticas das partculas convencionais de P(3HB) e, conseqentemente, a velocidade de liberao do ibuprofeno a partir das mesmas. As caracteristicas fsico-quimicas das microesferas obtidas e os perfis de liberao do ibuprofeno foram avaliados e comparados.

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1.2 OBJETIVOS 1.2.1 OBJETIVO GERAL Desenvolver microesferas a partir de blendas e/ou compsitos de P(3HB) com outros materiais, visando a liberao prolongada do IBF nas articulaes, para o tratamento da artrite.

1.2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS * Preparar microesferas de ibuprofeno a partir de blendas de P(3HB) e trimiristato de gricerila ou poli(D-L-cido ltico)-b-poli(etilenoglicol) pela tcnica de emulso/evaporao do solvente;
* Preparar microesferas compostas de ibuprofeno, utilizando a tcnica de dupla

emulso/evaporao do solvente, a partir de P(3HB) e gelatina; * Caracterizar as microesferas de ibuprofeno quanto a tamanho, morfologia, propriedades trmicas, eficincia de encapsulao e teor do frmaco; * Avaliar e comparar a cristalinidade do polmero e frmaco nas diferentes formulaes de microesferas; * Avaliar os perfis de liberao do ibuprofeno in vitro a partir das microesferas; * Comparar os resultados obtidos com as diferentes formulaes no que se refere a velocidade de liberao do frmaco; * Aplicar um modelo matemtico aos perfis de liberao do ibuprofeno a partir das microesferas; * Selecionar a formulao com as melhores caractersticas e avaliar sua eficcia teraputica, por via intra-aticular, em modelo de artrite crnica induzida pelo Adjuvante Completo de Freund (CFA) em ratos Wistar, comparando com a administrao do frmaco livre pela via intra-articular.

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REVISO BIBLIOGRFICA

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2 REVISO BIBLIOGRFICA 2.1 Microencapsulao de frmacos A resposta biolgica de um frmaco resultante de sua interao com os receptores celulares ou sistemas enzimticos importantes e, por conseqncia, da alterao de processos biolgicos presentes anteriormente administrao do medicamento. A magnitude da resposta est relacionada concentrao do frmaco que alcana o stio de ao que, por sua vez, depende da dose administrada e da velocidade e extenso de sua absoro e eliminao (ANSEL, POPOVICH, ALLEN, 2007). De modo geral, a administrao de frmacos em formas farmacuticas convencionais leva ao rpido aumento da concentrao plasmtica dos mesmos (FREIBERG & ZHU, 2004). Aps um perodo relativamente curto em nveis teraputicos, a concentrao plasmtica do frmaco cai, havendo necessidade de uma nova administrao do medicamento. A administrao de uma nova dose produz um segundo pico plasmtico e assim sucessivamente, gerando flutuaes na concentrao do frmaco e o aparecimento de efeitos txicos (SWARBRICK & BOYLAN, 1990). Assim, especialmente nos casos em que esquemas teraputicos de longa durao so empregados, sobretudo com frmacos que so rapidamente metabolizados, a utilizao de especialidades farmacuticas que permitam a liberao contnua dos mesmos torna-se desejvel. A administrao de formas farmacuticas de liberao prolongada permite a reduo do nmero de doses dirias, a manuteno das concentraes plasmticas em nveis teraputicos e a reduo dos efeitos colaterais, alm de favorecer a adeso do paciente ao tratamento (WATTS et al., 1990). Neste contexto, a microencapsulao de frmacos, empregando

polmeros naturais ou sintticos, tem sido considerada uma boa estratgia para a obteno de formas farmacuticas de liberao prolongada. O processo de microencapsulao consiste em encapsular slidos ou lquidos dentro de matrizes compactas ou reservatrios polimricos, sendo tais partculas denominadas de microesferas e microcpsulas, respectivamente (WATTS et al., 1990). As micropartculas apresentam dimetro mdio variando entre um a algumas centenas

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de micrmetros, sendo o frmaco liberado por mecanismos de difuso e/ou de degradao do material polimrico. Apesar do objetivo principal da microencapsulao ser o prolongamento da liberao, a curta meia-vida biolgica e a baixa biodisponibilidade dos frmacos tambm podem ser contornadas quando as micropartculas so administradas diretamente no tecido alvo, com reduo da absoro sistmica (THOMPSON et al., 2007). Vrias tcnicas so descritas na literatura para a preparao de micropartculas, permitindo uma ampla adequabilidade no que se refere s diferentes classes de medicamentos. Para a obteno de microesferas, o mtodo de emulsificao seguida da evaporao do solvente tem sido freqentemente empregado face simplicidade dos procedimentos envolvidos e possibilidade de modulao das caractersticas fsicas e fsico-qumicas das partculas por meio da escolha dos componentes da formulao e das condies de preparao (BHARDWAJ et al., 1995; KHIDR et al., 1998). Neste mtodo, o frmaco dissolvido ou disperso em uma soluo do polmero em um solvente orgnico voltil. A fase orgnica ento emulsificada em uma fase aquosa, contendo um estabilizante da disperso. O solvente removido da fase interna pela aplicao de calor, vcuo (DEASY, 1984; WATTS et al., 1990), ou ainda, pela sua evaporao em temperatura ambiente, que pode ser acelerada pela adio de um solvente extrator (VILA JATO, 1997). As microesferas formadas so separadas por filtrao ou centrifugao, lavadas com solvente adequado e secas sob condies apropriadas ou liofilizadas (JAIN, 2000). Apesar da simplicidade dos procedimentos envolvidos, a formao das microesferas pode ser influenciada por diversos fatores, destacando-se, entre eles, agitao e natureza do estabilizante e dos solventes empregados na preparao. A capacidade de dissoluo do polmero e, preferencialmente, de dissoluo do frmaco so caractersticas desejveis do solvente da fase interna. Alm dessas caractersticas, o solvente deve ser imiscvel na fase contnua e apresentar baixo ponto de ebulio. A fim de garantir a formao das partculas e proporcionar uma elevada taxa de encapsulao, o frmaco e o polmero tambm devem ser insolveis na fase externa (WATTS et al., 1990). A eficincia de encapsulao do frmaco estimada como sendo a diferena percentual entre a concentrao inicialmente adicionada na formulao e a concentrao associada s partculas. Desta maneira, quando a tcnica de emulso/

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evaporao do solvente utilizada, a eficincia de encapsulao fortemente influenciada pelo coeficiente de partio do frmaco entre a fase interna e externa da emulso. Frmacos caracterizados por apresentar baixa hidrossolubilidade podem ser encapsulados com sucesso pela formao de uma emulso leo em gua (o/a). Entretanto, quando frmacos que apresentam elevada hidrossolubilidade so utilizados, baixas taxas de encapsulao tm sido observadas. Neste caso, a encapsulao pode ser realizada por meio da formao de uma emulso gua em leo (a/o), onde um solvente polar contendo o frmaco e o polmero emulsificado em uma fase oleosa, como o leo mineral (SHUKLA et al., 1989), ou pela formao de uma emulso mltipla (a/o/a), em que uma fase aquosa contendo o frmaco dispersa em uma soluo do polmero no solvente voltil, e a emulso (a/o) resultante , por sua vez, dispersa em uma segunda fase aquosa (OGAWA et al., 1988; WATTS et al., 1990). A tcnica de spray drying tem sido tambm amplamente aplicada no preparo de sistemas microparticulados, pois possibilita a encapsulao tanto de frmacos solveis como de frmacos insolveis em gua (MU, FENG, 2001). Vrios polmeros tm sido empregados na preparao de sistemas de liberao prolongada. Entre eles pode-se citar os polisteres alifticos, os copolmeros do cido metacrlico e dos steres acrilatos, alm de diferentes polissacardeos, tais como a celulose e seus derivados, os alginatos e as quitosanas (LINHARDT, 1988). Para a administrao parenteral, polmeros biodegradveis so claramente os materiais de escolha. Alm disso, os requisitos de segurana, biocompatibilidade e baixa toxicidade do polmero e de seus produtos de degradao devem ser considerados no desenvolvimento das formulaes (WHATELEY, 1993). Enquanto a biodegradao um processo natural pelo qual compostos orgnicos so convertidos a molculas mais simples no ambiente biolgico (catabolismo), o termo biocompatibilidade refere-se aceitabilidade mtua entre o polmero e seu ambiente fisiolgico (POUTON & AKHTAR, 1996; CHANDRA & RUSTGI, 1998), e pode ser obtida com a utilizao de polmeros naturais ou sintetizados a partir de monmeros encontrados na natureza (ZHU & FREIBERG, 2004). Os principais mecanismos que governam a liberao de um frmaco a partir de um sistema de liberao controlada so a difuso e a eroso. Na prtica, o

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perfil de liberao o resultado da combinao destes mecanismos, podendo ser usado no somente como meio de assegurar a qualidade da preparao, mas principalmente para descrever a estrutura do sistema e a conduta da formulao. A velocidade de liberao pode ser influenciada por diversos fatores que envolvem tanto o tipo de estrutura da matriz polimrica, como as propriedades fsico-qumicas do frmaco e do polmero (ZHU & FREIBERG, 2004). Recentemente, a associao de diferentes materiais para a obteno de micropartculas tem se mostrado uma estratgia importante na busca da modulao do perfil de liberao de frmacos. Em especial, as blendas polimricas so misturas fsicas de diferentes polmeros, com a finalidade de modular as propriedades fsicas e mecnicas de um material (SUDESH & DOI, 2000; BHATT, SHAH, TRIVEDI, 2008). A formao de blenda no tem o intuito de mudar drasticamente as caractersticas dos componentes puros, mas sim melhorar ao mximo o desempenho do sistema teraputico (YU, DEAN, LI, 2006). A natureza dos polmeros envolvidos na blenda e sua miscibilidade conferem importantes caractersticas morfolgicas s partculas, influenciando no processo de liberao. A miscibilidade, por exemplo, existente entre o poli-(cido ltico-co-gliclico) (PLAGA) e o Pluronic F68 ou L121 pareceu influenciar na reduo do efeito burst e no controle da liberao de diversas protenas a partir das micropartculas preparadas com esta blenda (YEH, DAVIS, COOMBES, 1996; TOBO et al., 1999; SNCHEZ et al., 2003). Quando a blenda imiscvel, a adio de um componente hidroflico na sua composio pode provocar o efeito contrrio, ou seja, a elevao da velocidade de liberao de frmacos, por facilitar a difuso do meio para o interior das partculas. Este foi o motivo descrito por Sanli e colaboradores (2007) ao observarem o aumento da liberao do diclofenaco de sdio a partir de esferas obtidas com blendas de lcool polivinlico (PVA) e alginato de sdio (NaAgI). Alm da miscibilidade da matriz polimrica, cristalinidade e porosidade das partculas so outros fatores controlveis pela utilizao e escolha da composio da blenda e que influenciam no processo de liberao do frmaco encapsulado. O aumento na porosidade demonstrou ser um fator determinante no acrscimo de at 45% na liberao do diclofenaco de sdio a partir de microesferas de acetobutirato de celulose com a adio de Pluronic F68 para a formao da blenda (MEDEIROS, 2003). A maior porosidade de microesferas obtidas de blendas

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de PLAGA e PCL, em relao quelas obtidas com PLAGA puro, tambm resultou no aumento da liberao do antibitico doxicilina, em condies fisiolgicas (MUNDARGI et al., 2007). O efeito da reduo da cristalinidade foi verificado em microesferas preparadas com blendas de polmeros de diferentes pesos moleculares. A liberao do paclitaxel foi mais lenta quando PLA de baixo molecular foi adicionado a matrizes de PLA de peso molecular elevado. A liberao completa do frmaco ocorreu em setenta dias, em quatro fases distintas (LIGGINS & BURT, 2004). O maior empacotamento da matriz polimrica foi verificado com a utilizao de PLAGA de alto e baixo peso molecular, resultando igualmente na reduo da velocidade de liberao do ganciclovir a partir de microesferas (DUVVURI, JANORIA, MITRA, 2006). Estudos tambm revelaram que o teor de nifedipina nas microesferas constitudas de blendas de etilcelulose e metacrilato de amnio (Eudragit RL 100) afeta o mecanismo de liberao. Em baixos nveis de teor do frmaco, a interao polmero-nifedipina gerou um efeito plastificante sobre a matriz, levando ao aumento da liberao com o aumento da taxa de encapsulao. Entretanto, em valores mais elevados de teor de nifedipina, a alterao da cintica de liberao foi verificada pela formao de reservatrios deste frmaco (HUANG et al., 2006).

2.2 Polihidroxialcanoatos Polisteres alifticos biodegradveis, tais como o poli-(cido ltico) (PLA) e seu copolmero poli-(cido ltico-co-gliclico) (PLAGA), so freqentemente usados na preparao de micropartculas (POUTON & AKHTAR, 1996, ANDERSON & SHIVE, 1997). Estes polmeros so biodegradados a cido ltico e gliclico, que so metabolizados atravs do ciclo do cido carboxlico (ciclo de Krebs) e, subseqentemente, eliminados do corpo como dixido de carbono e gua (JAIN, 2000). Entretanto, a necessidade de importao destes materiais ainda representa um custo elevado para o desenvolvimento de medicamentos de liberao prolongada em nvel nacional. Outra classe de polmeros biodegradveis e biocompatveis,

genericamente conhecida como polihidroxialcanoatos (PHAs), tem representado imenso potencial para aplicao farmacutica, uma vez que oferece uma alternativa

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como matria-prima para a obteno de formas farmacuticas de liberao controlada para a via parenteral (POUTON & AKHTAR, 1996). PHAs so polisteres lineares de 3-hidroxicidos, naturalmente produzidos por bactrias, como reserva de energia e fonte de carbono, sendo acumulados na forma de incluses celulares com dimetro mdio de 0,2 a 0,5 m (SURIYAMONGKOL et al., 2006). O mais comum dos PHAs o homopolmero poli-(3-hidroxibutirato) (P(3HB)), seguido do seu copolmero com hidroxivalerato (P(3HB-co-3HV)). Os PHAs possuem propriedades similares a vrios termoplsticos sintticos, como o polipropileno, podendo ser moldados na forma de fios ou filmes (KHANNA & SRIVASTAVA, 2004). Desta forma, os PHAs so importantes materiais para aplicao mdica e farmacutica, principalmente para a utilizao em suturas, prteses, suportes de culturas de tecidos em implantes, e obteno de formas farmacuticas de liberao prolongada.

2.2.1 Histrico dos PHAs A primeira observao da existncia de grnulos refratrios em clulas bacterianas data de 1888, com Beijerinck. No entanto, embora a presena destes grnulos tenha sido observada por muitos microbiologistas no decorrer dos anos, foi apenas em 1927 que sua composio foi determinada por Lemoigne. Este pesquisador verificou que a degradao anaerbica de um material desconhecido pelo Bacillus megaterium conduzia a formao de cido 3-hidroxibutrico. Lemoigne identificou este material como um homopolister do 3-hidroxibutirato, ou poli-(3hidroxibutirato) (P(3HB)). Nos trinta anos seguintes, o interesse por este material foi pequeno, limitando-se a estudos de avaliao de condies de cultura e de mtodos de deteco e determinao do teor de grnulos nas clulas. Em 1958, a primeira hiptese sobre a funo do P(3HB) foi descrita por Macrae e Wilkinson. Aps observarem que o Bacillus megaterium estocava rapidamente o homopolmero em presena de um excesso de glicose e restrio de nitrognio no meio, e o degradava na ausncia de fonte de energia ou de carbono exgeno, os pesquisadores concluram que o P(3HB) servia como material de reserva, e que sua sntese envolvia os complexos acetato e coenzima A (BRAUNEGG, LEFEBVRE, GENSER, 1998).

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At 1973, apesar dos inmeros estudos, o interesse nos biopolmeros permaneceu diretamente ligado a sua significncia fisiolgica como substncia de origem microbiolgica. No entanto, com a crise do petrleo o interesse da utilizao do P(3HB) como material plstico alternativo foi retomado, no somente porque poderia ser obtido a partir de fontes renovveis, mas tambm por apresentar algumas propriedades semelhantes as do propileno (BRAUNEGG, LEFEBVRE, GENSER, 1998). Em 1974, Wallen e Rohwedder identificaram um polister contendo unidades de cido 3-hidroxivalrico (3HV) e 3-hidroxibutrico (3HB) como principais componentes, alm de unidades de cido 3-hidrohexanico e 3-hidroxipentanico, em menor quantidade. O interesse nestes polmeros, em particular nos copolmeros do 3HB e 3HV, deve-se ao fato de apresentarem ponto de fuso mais baixo e serem menos cristalinos que o P(3HB), o que os torna materiais promissores para a aplicao em diversas reas. Atualmente, uma variedade de copolmeros com diferentes teores de 3HB e 3HV obtida a partir da bactria Ralstonia eutropha, sob a marca registrada BIOPOL (Monsanto) (SUDESH, ABE, DOI, 2000). No Brasil, o desenvolvimento da tecnologia para a produo de PHAs como plsticos biodegradveis e biocompatveis teve incio em meados da dcada de 90, por meio de um projeto cooperativo entre o Instituto de Pesquisa e Tecnologia (IPT), Copersucar e Universidade de So Paulo, usando carboidratos como material de partida, em especial derivados da cana-de-acar. A produo de P(3HB) realizada em tanques agitados e aerados em condies controladas de pH, temperatura, oxignio dissolvido e aporte de matrias-primas. O copolmero P(3HBco-3HV) produzido pela adio concomitante de cido propinico e acar. Dando prosseguimento ao projeto, um melhoramento gentico foi realizado na Burkholderia sacchari IPT 101, obtendo-se um mutante IPT 189 que tem maior capacidade de acmulo do polmero (P3HB-co-3HV), quando alimentado com sacarose e cido propinico (IPT, 2008)

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2.2.2 Biossntese dos PHAs Numerosas bactrias gram-positivas e gram-negativas, assim como cianobactrias sintetizam PHAs. Dependendo do nmero de tomos de carbonos na cadeia, os PHAs podem ser divididos em trs classes: de cadeia curta, consistindo de monmeros com 3 a 5 carbonos, de cadeia mdia, com monmeros de 6 a 14 carbonos, e de cadeia longa, formados por monmeros com mais de 14 carbonos (ZINN, WITHOLT, EGLI, 2001). Esta diferena atribuda, principalmente, a especificidade das PHAs sintases frente ao substrato (KHANNA & SRIVASTAVA, 2004). J foram identificados e caracterizados diversos tipos de polimerases e algumas cepas bacterianas podem apresentar mais de uma polimerase ativa (ZINN, WITHOLT, EGLI, 2001). As bactrias responsveis pela produo de PHAs podem ser divididas em dois grupos, conforme as caractersticas do meio de cultura. O primeiro grupo de bactrias requer um meio com limitao de nutriente essencial, tal como nitrognio, fsforo, magnsio ou enxofre, e com excesso de fontes de carbono. Os exemplares deste grupo so Ralstonia eutropha, Protomonas extorquens, e Protomonas oleovorans. A Ralstonia eutropha consegue acumular at 80% do seu peso seco em polmero, quando nitrognio ou fsforo est ausente no meio. O segundo grupo, cujas representantes so as cepas Alcaligenes latus, uma mutante da Azotobacter vinelandii, e a recombinante E. coli, no necessita de limitao de nutrientes e pode sintetizar PHAs mesmo durante o crescimento celular (KHANNA & SRIVASTAVA, 2004). A sntese do P(3HB), o mais conhecido PHA, pela Ralstonia eutropha ocorre a partir de vrios substratos. A metabolizao dos acares conduz formao de acetil-CoA, que pela ao da -cetotiolase, conjugada a outra acetilCoA formando a acetoacetil-CoA. A acetoacetil-CoA transforma-se em (R)-3hidroxibutiril-CoA pela ao de uma acetoacetil-CoA redutase NADPH-depentente. Finalmente, os monmeros (R)-3-hidroxibutiril-CoA so polimerizados a P(3HB) pela enzima PHA sintase (Figura 1). A Ralstonia eutropha pode utilizar para o seu crescimento e/ou produo de PHAs substratos como cido ltico, leos de vegetais e dixido de carbono. Alm disso, ela capaz de acumular PHAs a partir de fontes de carbono especiais, tais como cido 4-hidroxibutrico, -butirolactona e 1,4-

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butanediol, que permitem a incorporao de monmeros 4HB, juntamente com 3HB (SUDESH, ABE, DOI, 2000).

Fonte de carbono (acares)

Acetil-CoA

A
Acetoacetil-CoA

B
(R)-3-hidroxilbutiril-CoA

PHA

FIGURA 1: Rota metablica para sntese de PHAs. A: -cetotiolase, B: acetoacetilCoA redutase, C: PHA sintase (Adaptado de SUDESH et al., 2000).

produo

dos

PHAs

por

bactrias

garante

sua

completa

estereoespecificidade - todos os carbonos quirais da cadeia principal esto na configurao R - o que essencial para a existncia de biodegradabilidade e biocompatibilidade destes polmeros. O fato de ser obtido naturalmente tambm exclui o risco de toxicidade pelo uso de reagentes qumicos. Como a biossntese do polmero regulada a nvel gentico, passvel de ser reproduzida e manipulada. Por esta razo, a obteno de PHAs constitui um importante alvo da engenharia gentica. Os genes da Ralstonia eutropha, para sntese do P(3HB), foram clonados e expressados em Escherichia coli, que tem seu metabolismo amplamente conhecido e mapeado, e tambm em clulas de plantas, possibilitando o aumento

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da produo e a reduo dos custos, e se tornando uma alternativa aos plsticos no-biodegradveis. Nota-se, neste contexto, o surgimento de novas rotas metablicas para sntese dos PHAs (POUTON & AKHTAR, 1996; ZINN, WITHOLT, EGLI, 2001).

2.2.3 Caractersticas qumicas e fsico-qumicas dos PHAs PHAs so polisteres alifticos de carbono, oxignio e hidrognio e sua estrutura geral encontra-se demonstrada na Figura 2. A composio da cadeia lateral (R), juntamente com o valor x, identifica uma unidade monomrica. O P(3HB), o mais comum dos PHAs, constitudo de monmeros contendo um grupo metila na cadeia lateral e valores de x=1, enquanto as unidades do P(3HV) contm um grupo etila no carbono 3 (BRAUNEGG, LEFEBVRE, GENSER, 1998). A natureza da cadeia lateral influencia consideravelmente nas propriedades do biopolmero, como ponto de fuso, temperatura de transio vtrea e cristalinidade (ZINN, WITHOLT, EGLI, 2001). A massa molar destes polmeros varia entre 2 x 105 a 3 x 106 Daltons (Da), dependendo do microorganismo que os produz e das condies de crescimento. Entretanto, alguns PHAs, como o homopolmero poli-(3hidroxivalerato) (P(3HV)), podem apresentar massas molares de 60.000 Da ou menos (LEE, 1996). As propriedades mecnicas dos PHAs so amplamente variveis e dependem da composio monomrica (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). No interior dos grnulos citoplasmticos os PHAs apresentam-se na forma amorfa, provavelmente devido ao estabilizante da gua presente nestes grnulos. No entanto, a extrao do polmero a partir dos microorganismos conduz sua rpida cristalizao (SUDESH, ABE, DOI, 2000). Os PHAs podem ser extrados dos grnulos pela utilizao de solventes orgnicos, como o clorofrmio, ou pela ruptura mecnica, qumica ou enzimtica da membrana (POUTON & AKHTAR, 1996). O P(3HB) isolado das bactrias possui grau de cristalinidade de cerca de 55-80% e as densidades do polmero cristalino e amorfo so 1,26 e 1,18 g/cm3, respectivamente (SUDESH, ABE, DOI, 2000).

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R CH (CH2)x

O C O n

FIGURA 2: Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos.

No estado slido, o P(3HB) apresenta-se na forma de uma hlice com duas unidades monomricas completando uma volta. As foras envolvidas nesta conformao so principalmente interaes do tipo Van der Waals entre os oxignios dos grupamentos carbonilas e os grupamentos metilas. A estereoregularidade do polmero responsvel por sua elevada cristalinidade. O P(3HB) possui vrias propriedades teis, tais como resistncia a umidade, piesoeletricidade e pureza ptica. Porm, apresenta duas grandes limitaes. Primeiro, o P(3HB) tem baixa estabilidade trmica, pois se degrada a 200 oC, prximo temperatura de fuso. Segundo, o P(3HB), sob condies ambientais, torna-se quebradio aps alguns dias de armazenamento (LEE,1996). A estrutura cristalina do copolmero P(3HB-co-3HV) semelhante a do P(3HB), contudo tem sua cristalinidade reduzida com o aumento da proporo de monmeros 3HV, apresentando propriedades mecnicas mais promissoras, como menor dureza, o que o torna um termoplstico mais promissor que o P(3HB) (BRAUNEGG, LEFEBVRE, GENSER, 1998). A introduo de outros co-monmeros, tal como 4-hidroxibutirato, 3-hidroxihexanoato e 3-hidroxipropionato, na cadeia do P(3HB) tambm conduz obteno de polmeros com melhores propriedades fsicas e mecnicas (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). A solubilidade dos PHAs dependente da temperatura e do peso molecular do polmero. O P(3HB) e P(3HBco-3HV) so solveis em solventes orgnicos, como clorofrmio, diclorometano e anidrido actico (POUTON & AKHTAR, 1996). Dependendo dos monmeros que constituem o polmero, a temperatura de fuso dos PHAs pode variar de 50 a180 oC (LEE, 1996). O P(3HB) funde entre 160-180
o

C, conforme o peso molecular e a histria trmica da amostra. O

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copolmero P(3HB-co-3HV) apresenta temperatura de fuso mais baixa que o homopolmero, mas esta influenciada pelo teor de HV na molcula. As temperaturas de transio vtrea do P(3HB) e P(3HB-co-3HV) ocorrem na faixa de -5 a 20 oC e parecem ser independentes da composio do copolmero (POUTON & AKHTAR, 1996).

2.2.4 Degradao A caracterstica mais atraente dos PHAs sua biodegradabilidade. No processo de degradao ocorre a deteriorao do polmero por meio da clivagem das cadeias polimricas, formando oligmeros e, posteriormente, monmeros. Existem diferentes tipos de degradao polimrica, dependendo do processo de iniciao, tais como fotoqumica, trmica, mecnica, e por meio de ataque qumico, sendo este ltimo o mais importante (GOPFERICH, 1996). A velocidade da degradao influenciada por diversos fatores, como presena de microorganismos no ambiente, temperatura, teor de umidade, pH, composio do polmero, cristalinidade e rea de superfcie (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). Estudos de degradao qumica dos PHAs tm sido realizados utilizando filmes obtidos a partir destes materiais. A degradao hidroltica in vitro do P(3HB) tem se mostrado relativamente lenta. Estudos estimam que a perda de massa de filmes de 85 m de espessura, a 37oC e pH 7,4, ocorre com uma meia vida de, aproximadamente, 152 semanas. A perda de massa de filmes de P(3HB-co-3HV) mostrou ser mais rpida que a do homopolmero, no entanto no foi verificada uma correlao com o teor de HV na cadeia polimrica. A penetrao da gua nos polmeros foi muito baixa e impossvel de ser determinada precisamente. Desta forma, os autores concluram que a degradao in vitro do P(3HB-co-3HV) ocorre por um mecanismo de eroso superficial (POUTON & AKHTAR, 1996). Desde que os PHAs so materiais slidos e incapazes de atravessar as membranas celulares, muitos microorganismos secretam as PHA-depolimerases extracelulares, capazes de hidrolisar o PHA em oligmeros e monmeros solveis em gua, que so utilizados como fonte de nutrientes (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). As enzimas PHA-depolimerases possuem um domnio hidrofbico que serve

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como stio de ligao para aderir superfcie dos PHAs e um domnio cataltico com seqncia de aminocidos de lipase (LEE, 1996). Visto que o polmero P(3HB) insolvel em gua e as P(3HB)-depolimerases so solveis, acredita-se que a degradao enzimtica seja uma reao heterognea, ocorrendo em duas etapas: adsoro da enzima na superfcie do P(3HB) e, posteriormente, hidrlise das cadeias polimricas pelo stio ativo da enzima (KHANNA & SRIVASTAVA, 2005). Os produtos finais da degradao aerbica dos PHAs so dixido de carbono e gua; metano tambm produzido em condies anaerbicas (LEE, 1996). A velocidade de degradao enzimtica do P(3HB) no estado amorfo vinte vezes maior que no estado cristalino, demonstrando que a biodegradabilidade do P(3HB) pode ser regulada variando seu grau de cristalinidade (SUDESH, ABE, DOI, 2000). Neste contexto, inmeros estudos tm sido realizados com intuito de modificar a velocidade de degradao dos PHAs atravs da alterao de sua cristalinidade, utilizando alternativas como a obteno de blendas e de copolmeros. Dependendo das propriedades termodinmicas e da escolha dos polmeros, diferentes graus de separao de fases podem ser observados nas blendas, levando variao no seu comportamento de degradao (MI et al., 2006). Blendas miscveis tm sido obtidas com P(3HB) e polioxietileno, poli(epicloridrina) e poli(acetato de vinila), e parcialmente miscveis com poli(metilmetacrilato). Blendas imiscveis compatveis tm sido formadas com policaprolactona, etileno-propileno, polibutilacrilato e polissacardeos (AVELLA, MARTUSCELLI, RAIMO, 2000). A imiscibilidade entre PCL e o P(3HB), assim como a reduo da cristalinidade do biopolmero, foi observada em estudos de anlise trmica de filmes preparados a partir de blendas destes dois polmeros (ANTUNES & FELISPERTI, 2005). Rosa e colaboradores (2001) avaliaram a influncia da adio de amido no processo de degradao enzimtica de trs diferentes polmeros: P(3HB), P(3HB-co-3HV) e PCL. A mudana da morfologia e das propriedades mecnicas foi observada com a adio de amido nos polmeros puros. Quando expostos a microorganismos em presena de lodo ativado, o material que apresentou maior degradao foi o P(3HB) puro. No entanto, a adio de amido acelerou a degradao dos filmes obtidos a partir da PCL e do P(3HB-co-3HV).

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A degradao enzimtica em solo de filmes constitudos de blendas de poli [(R,S)-3-hidroxibutirato] attico (P(3HB) sinttico e amorfo preparado a partir da polimerizao aninica da -butirolactona, P(3HB)a) e P(3HB) natural ou PLA foi avaliada por Rychter e colaboradores (2006). Durante o estudo, os filmes constitudos de P(3HB) puro no demonstraram perda de massa significativa, no entanto, quando preparados com 50% de P(3HB)a, os filmes tiveram 40% de sua massa reduzida aps 183 dias. Por outro lado, os filmes constitudos de PLA e P(3HB)a (50:50) sofreram alterao na sua composio durante a degradao, visto que o PLA degrada numa maior velocidade que o P(3HB)a. Portanto, a acelerao da degradao enzimtica do PLA e P(3HB) pode ser obtida com o uso de blendas com o P(3HB)a. A adio de polietilenoglicol (PEG) tambm afeta a degradao enzimtica do P(3HB) nas blendas. Chen e colaboradores (2003) demonstraram que a adio de PEG nos filmes de P(3HB) aumenta a velocidade de degradao, quando estes so incubados em tampo fosfato pH 7,2 - 7,4 a 37 oC, na presena de lisozima. O PEG por ser hidrossolvel rapidamente dissolvido na soluo tampo, tornando os filmes mais porosos e aumentando a rea superficial para que o ataque pela enzima ocorra. Parra e colaboradores (2006) prepararam filmes com diferentes propores de P(3HB) e PEG. Estudos de anlise trmica evidenciaram a reduo da cristalinidade do P(3HB) nas blendas contendo 10 e 20% de PEG. A degradao foi avaliada aps exposio das amostras enzima -amilase, em tampo acetato pH 6,0. A incorporao do PEG aumentou a velocidade de degradao do filme e este aumento foi dependente da concentrao do aditivo. Santana e colaboradores (2004) prepararam filmes com diferentes propores de P(3HB) e PLA. Os polmeros mostraram-se imiscveis em todas as composies estudadas e a degradao em condies fisiolgicas (tampo fosfato pH 7,4 e temperatura de 37oC) ocorreu de forma desigual: apenas o PLA mostrou sinais de degradao.

2.2.5 Toxicidade e biocompatibilidade dos polihidroxialcanoatos O potencial de utilizao dos PHAs em sistemas de liberao de frmacos ou em outras aplicaes biomdicas no depende somente das propriedades de

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biodegradao dos polmeros, mas tambm de sua biocompatibilidade (POUTON, AKHTAR, 1996). A degradao do P(3HB) conduz a formao do monmero cido D-(-)-3-hidroxibutrico. Este cido um constituinte normal do sangue e, juntamente, com o acetoacetato e a acetona, uma das trs cetonas que so produzidas endogenamente pelo processo de cetognese (POUTON, AKHTAR, 1996; ZINN, WITHOLT, EGLI, 2001). Adicionalmente, PHAs de baixo peso molecular so encontrados nas clulas biolgicas, complexados a outras macromolculas (SUDESH, ABE, DOI, 2000). A complexao modifica as propriedades fsicas e qumicas dos PHAs, permitindo que este atravesse tanto regies aquosas quanto lipdicas da clula, fazendo com que possam ser encontrados no citoplasma e fluidos intracelulares, assim como nas membranas e lipoprotenas (CHEN, WU, 2005). Estas observaes indicam que o P(3HB), seus oligmeros e monmeros no so txicos s clulas (LEE, 1996). Propriedades nutricionais ou teraputicas tm sido obtidas com o aumento das cetonas corporais, na forma de oligmeros lineares ou cclicos e/ou derivados de hidroxicidos, constitudos principalmente de 3-hidroxibutirato, 3hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato e 3-hidroxiheptanoato. Tais substncias podem ser administradas oralmente, na forma de suplementos alimentares, ou por via parenteral e so teis no controle de ataques epilpticos, doenas metablicas, reduo do catabolismo de protenas, na supresso do apetite e no aumento da eficincia cardaca, entre outras aplicaes. Da mesma forma, os oligmeros poli-4hidroxibutirato e o monmero 4-hidroxibutrico tambm tm sido utilizados no tratamento de pacientes com narcolepsia, esquizofrenia crnica, psorase atpica, neurose, alcoolismo, e muitas outras enfermidades. Baseado no exposto, acreditase que alm dos PHAs, seus oligmeros e monmeros no serem txicos s clulas, podem ainda fornecer alguns benefcios nutricionais e teraputicos (CHEN, WU, 2005). Estudos de biocompatibilidade de microesferas de P(3HB) e P(3HB-co3HV) apresentando dimetro entre 20 e 40 m foram realizadas em ratos Wistar machos, por meio do monitoramento da resposta inflamatria aguda e crnica. Embora uma resposta inflamatria aguda tenha sido observada aps a administrao intramuscular das microesferas, a inflamao crnica no foi detectada pelo mtodo enzimtico. Quando microesferas de maior dimetro (100

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m) foram administradas pela mesma via, resultados semelhantes foram obtidos. A inflamao aguda observada nos estudos in vivo tem sido atribuda ao trauma ocorrido na implantao ou injeo, indicando que estes materiais so biocompatveis (POUTON & AKHTAR, 1996).

2.2.6 Aplicaes do PHA em sistemas de liberao A maior parte dos estudos realizados com os PHAs na rea de liberao de frmacos refere-se obteno de micropartculas de liberao prolongada. Devido s suas caractersticas de solubilidade, as micropartculas so preparadas por meio de tcnicas que envolvem a emulsificao de uma soluo orgnica do polmero, seguida da evaporao do solvente. O controle da liberao uma caracterstica desejvel e esperada, mas so muitos os fatores que a afetam, envolvendo a estrutura da matriz onde o frmaco est inserido e as propriedades fsicas e qumicas de ambos polmero e frmaco (DONNELL & MCGINITY, 1997). Assim, diversos estudos tm sido realizados na tentativa de compreender quais dos fatores so passveis de serem alterados na busca da modulao da velocidade de liberao de frmacos a partir de matrizes de PHAs (Tabela 1). Um dos primeiros estudos relatados sobre a utilizao dos PHAs para a obteno de microesferas foi realizado por Juni e colaboradores (1986). Microesferas de P(3HB) contendo aclarubicina, um antitumoral antracclico, foram preparadas pelo mtodo da emulso/evaporao do solvente. A velocidade de liberao do frmaco demonstrou ser muito lenta, ou seja, unicamente 10% do frmaco foram liberados em 120 horas, mas esta pde ser modulada pela adio de cidos graxos e seus steres formando blendas para compor a matriz. Particularmente, os steres etila e butila de cidos graxos, com mais de 12 e 10 carbonos na cadeia acila, respectivamente, aumentaram a velocidade de liberao da aclarubicina. A progesterona tambm foi encapsulada em microesferas de P(3HB) e P(3HB-co-3HV) usando a tcnica de emulso/evaporao do solvente (GRANGADE & PRICE, 1991). Segundo os autores, a menor velocidade de liberao do frmaco foi obtida com a utilizao do copolmero apresentando 9% de HV, e este resultado

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TABELA 1: Fatores que demonstraram afetar a velocidade de liberao de frmacos a partir de micropartculas de PHAs, preparadas pela tcnica de emulso evaporao do solvente.
Fator
Emprego de blendas

Frmaco
Aclarubicina Ftalocianinas Indometacina e Diclofenaco de Sodio Ibuprofeno

Polmero
P(3HB) e cidos graxos e seus steres P(3HB-co-3HV) (9,8 mol% de 3HV) e PCL P(3HB-co-3HV) e PCL P(3HB) e steres de glicerila P(3HB) ; P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-3HV) (330kD; 10,8 mol% HV) P(3HB) (65, 135 e 450 kD)

Referncia
Juni et al. (1986) Vaccari et al. (2005) Polleto et al. (2007) Bidone; LemosSenna (2007) Grangade; Price (1991) Penna et al. (2005) Atkins; Peacock (1997) Kawagushi et al. (1992)

Porosidade

Progesterona Progesterona Albumina srica bovina

Grau de lipofilia do frmaco

Pr-frmacos do 2-3diacil-5-fluoro-2deoxiuridina Pr-frmacos do 2-3diacil-5-fluoro-2deoxiuridina 5-Fluorouracila Diazepam Levonorgestrol

Peso molecular do polmero Mtodo de preparao

P(3HB) (65, 135 e 450 kD)

Kawagushi et al. (1992)

P(3HB-co-3HV) (15 mol% HV) P(3HB-co-3HV) (21 mol% HV, 630 kD) P(3HB) (230kD) P(3HB)

Khang et al. (2001) Chen; Davis (2002) Lu et al. (2001) Bazzo et al. (2005)

Velocidade de remoo do volume da fase interna Teor de HV no copolmero Emprego de Compsitos

Piroxicam

Tetraciclina

P(3HB-co-3HV) (7, 14 e 22% HV) 400 a 750 kD P(3HB-co-3HV) (3mol% HV; 300 kD) e volastonita P(3HB-co-3HV) (3mol% HV; 300 kD) e hidroxiapatita P(3HB) (300 kD) P(3HB-co-3HV) (680 kD, 5 mol% de 3HV)

Sendil et al. (1999) Li; Chang (2005) Wang et al. (2007)

Gentamicina

Gentamicina Ibuprofeno Cristalinidade

Carmingnan (2006)

Fonte: CARMINGNAN, BIDONE, LEMOS-SENNA, 2008.

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foi relacionado com a obteno de partculas menos porosas. A elevada porosidade das microesferas de P(3HB-co-3HV) tambm foi responsvel pela rpida liberao da progesterona, na qual alcanou 90% nas duas primeiras horas de ensaio (PENNA, PEREIRA, R, 2005). A porosidade de matrizes esfricas compostas de P(3HB-co-3HV) (330 kD; 10,8 mol% de 3HV) e 20% de PCL tambm foi o fator predominante que afetou o tempo de liberao in vitro da albumina srica bovina (BSA) (ATKINS & PEACOCK, 1997). No entanto, estudos demonstraram que a porosidade das micropartculas de P(3HB) e P(3HB-co-3HV), preparadas pela tcnica de dupla emulso, pode ser controlada pela alterao das condies de preparao tal como massa molar do polmero, teor de HV, temperatura de evaporao do solvente e adio de policaprolactona para a formao de blendas, bem como pela quantidade de frmaco encapsulada (EMBLETON & TIGHE, 1992; EMBLETON & TIGHE, 1993; EMBLETON & TIGHE, 2002). A velocidade de liberao tambm tem demonstrado ser afetada pelo grau de lipofilia do frmaco e pela massa molar do polmero, conforme estudos de encapsulao dos pr-frmacos 2-3-diacil-5-fluoro-2-deoxiuridina em microesferas de P(3HB) de diferentes massas molares (65, 135 e 450 kD). Pr-farmacos apresentando diferentes propriedades fsico-qumicas foram obtidos por meio da esterificao da 5-fluoro-2-deoxiuridina com os cidos propinico, n-butrico e npentanico. A velocidade de liberao do pr-frmaco decresceu com o aumento da cadeia aliftica do ster, independentemente do polmero empregado, mas foi mais rpida com o emprego do polmero de baixa massa molar, para o mesmo frmaco (KAWAGUSHI et al., 1992). O efeito do mtodo de preparao de microesferas de P(3HB-co-3HV) (15 mol% 3HV) sobre a eficincia de encapsulao e velocidade de liberao da 5fluorouracila foi avaliado por Khang e colaboradores (2001). A preparao das microesferas foi realizada pelas tcnicas de emulso/evaporao do solvente leo em gua (o/a) e leo em leo (o/o), e a tcnica de dupla emulso (a/o/a). A eficincia de encapsulao da fluorouracila foi maior que 80% quando a tcnica o/o foi empregada, sendo significativamente superior aos 7% obtidos para as microesferas preparadas pela tcnica o/a e ao 1% obtido para as microesferas

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preparadas pela tcnica de dupla emulso. Por outro lado, o perfil de liberao mais desejvel foi alcanado quando a tcnica o/a foi usada. Diferentes variantes da tcnica de emulso/evaporao do solvente tambm foram testadas para a encapsulao do diazepam em microesferas de P(3HB-co-3HV) (21 mol% de HV). Quando uma emulso simples o/a foi utilizada, o diazepam foi liberado das partculas seguindo um perfil trifsico, sendo que a quantidade liberada acumulada aumentou com o aumento do teor de frmaco. A gelatina foi usada como estratgia para modular o perfil de liberao do diazepam. Para isto, uma disperso do frmaco em gelatina foi usada na preparao de microesferas de P(3HB-co-3HV) pela tcnica de dupla emulso (a/o/a). Este procedimento levou reduo do efeito burst de 40% para 25%, mas o perfil de liberao do frmaco foi igualmente trifsico. Um outro mtodo empregando uma emulso o/a/o foi igualmente testado para a obteno de microcpsulas, mas, neste caso, as partculas foram recobertas com uma camada de gelatina reticulada com glutaraldedo. A camada de gelatina permitiu o controle do efeito burst, levando obteno de uma cintica de liberao de ordem zero por um perodo de 30 dias (CHEN & DAVIS, 2002). O processo de encapsulao modifica algumas das propriedades do P(3HB), e este efeito foi mais pronunciado quando a tcnica de emulso a/o/a foi empregada. A morfologia interna das partculas foi mais irregular quando a dupla emulso foi usada na preparao das microesferas, em comparao ao emprego da emulso simples o/a. Entretanto, a aparncia externa rugosa das micropartculas foi originada pela elevada cristalinidade do polmero e, em menor extenso, pelos parmetros de processamento (MARTIN et al., 2000), embora a concentrao de tensoativo tenha demonstrado afetar o tamanho das partculas (MAIA, SANTANA, R, 2004). Por outro lado, a encapsulao do hormnio folculo estimulante nas microesferas de P(3HB) foi obtida com sucesso, quando a tcnica de emulso a/o/a foi usada, mesmo na ausncia de um tensoativo comercial, visto que o peptdeo age tambm reduzindo a tenso interfacial da emulso primria (MARTIN et al., 2000). Uma tcnica denominada secagem em lquido (in-liquid drying method) foi empregada para encapsular o contraceptivo levonorgestrol em microesferas de P(3HB). A tcnica consistiu na obteno de uma emulso o/a, seguida da sua

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diluio em um grande volume de gua com a finalidade de acelerar a remoo do solvente orgnico voltil da fase interna. O procedimento foi empregado com o intuito de evitar a formao de cristais de frmaco na superfcie das partculas, os quais tm sido considerados responsveis pelo pronunciado efeito burst, durante a liberao. A liberao do levonorgestrol foi ento prolongada em 1,8 vezes em relao ao frmaco livre, aumentando o tempo de contracepo em camundongos em at 60 dias (LU, WANG, YANG, 2001). A administrao de antiinflamatrios no-esteroidais (AINES) pela via intra-articular tem sido estudada como forma alternativa utilizao de corticosterides no tratamento localizado da artrite, os quais so responsveis por inmeros efeitos adversos indesejveis. O prolongamento da liberao e a manuteno das concentraes teraputicas no local de ao poderiam ser obtidos mediante a incorporao do frmaco em matrizes polimricas biodegradveis, conduzindo reduo dos efeitos colaterais sistmicos e adeso ao tratamento e melhoria da qualidade de vida do paciente. Com este propsito, o piroxicam foi encapsulado em microesferas de P(3HB) pela tcnica de emulso o/a seguida da evaporao do solvente, usando diferentes variveis de formulao. Enquanto a reduo do volume da fase interna levou formao de partculas de formato irregular e liberao total do frmaco em 7 horas, a adio de lcool isoproplico emulso formada permitiu a rpida remoo do solvente da fase interna e obteno de partculas esfricas cuja liberao total do frmaco ocorreu em 54 horas (BAZZO, LEMOS-SENNA, PIRES, 2005). O tramadol um analgsico que atua no sistema nervoso central que apresenta curta durao de ao, necessitando da administrao de doses repetidas ou infuso contnua para obteno de um efeito prolongado. Assim, Salman e colaboradores (2003) propuseram a encapsulao do tramadol em microesferas de P(3HB) como forma de controlar a sua liberao, aps administrao pela via epidural. A liberao in vitro do tramadol, em tampo fosfato pH 7,4 a 37 foi C, observada por mais de 6 dias, entretanto, cerca de 12,8% e 58% do tramadol encapsulado foi liberado na primeira hora e aps 24 horas, respectivamente. A atividade analgsica in vivo das microesferas foi avaliada usando ensaio de reatividade ao estmulo trmico, pela medida da retirada rpida da cauda (tail-flick) da gua a 52,5o C, antes e at 30 horas aps a injeo. Embora o estudo in vitro

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tenha demonstrado a liberao do frmaco por mais de uma semana, a atividade in vivo no ocorreu em um perodo similar devido reduo da velocidade de liberao com o tempo, no permitindo a manuteno da concentrao plasmtica em nveis teraputicos. Entretanto, o efeito analgsico das microesferas de P(3HB) contendo tramadol foi observado por 21 horas, enquanto uma dose equivalente de tramadol livre foi efetiva por menos de 5 horas. Os autores consideraram que a administrao das microesferas pode ser uma forma alternativa para a administrao do tramadol, particularmente no tratamento da dor ps-operatria. Por outro lado, a eliminao do polmero do espao epidural e o aparecimento de possveis efeitos, tal como a formao de adeso tecidual, permaneceram desconhecidos pelos autores. Alguns dos estudos realizados com os PHAs enfocam a liberao de antibiticos no local da infeco, uma vez que ainda ela considerada um dos problemas mais graves na cirurgia de implantes. A utilizao de sistemas carreadores de antibiticos em procedimentos cirrgicos ofereceria, alm dos benefcios teraputicos, a reduo da utilizao da antibioticoterapia sistmica. Neste contexto, a preparao de microcpsulas de tetraciclina a partir do P(3HB-co3HV) contendo diferentes teores de 3HV (7, 14 e 22%, PM 400 750 kD) foi realizada, visando o implante em bolsas periodontais, para o tratamento localizado da gengivite e periodontite. As microcpsulas foram preparadas por meio da tcnica da dupla emulso a/o/a e caracterizadas quanto eficincia de encapsulao, perfil de liberao e morfologia. Fatores, como tipo de emulsificante e forma qumica do frmaco, afetaram a eficincia de encapsulao. Aps 100 horas, a liberao de tetraciclina foi cerca de 90%, 42% e 50% para as microcpsulas preparadas a partir do P(3HB-co-3HV) contendo 22%, 14% e 7% de HV, respectivamente. Os dados de liberao foram melhores expressos pela equao de Higuchi, indicando que o frmaco liberado por um mecanismo de difuso. A liberao foi total antes que sinais de degradao do polmero tivessem sido observados (SENDIL et al., 1999). Microesferas de P(3HB) contendo rifampicina foram preparadas pela tcnica de emulso/evaporao do solvente, com o objetivo de obter agentes para a quimioembolizao. A rpida liberao do frmaco foi observada, atingindo cerca de 90% nas primeiras 24 horas. Entretanto, tamanho de partcula e teor de frmaco demonstraram ser fatores passveis de otimizao, permitindo o controle da velocidade de liberao. Angiogramas renais e anlises histopatolgicas, obtidas

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aps administrao das microesferas em ces, demonstraram a viabilidade de utilizao destes sistemas como agentes de quimioembolizao (KASSAB et al., 1997; KASSAB et al., 1999). Formulaes de microesferas constitudas de compsitos de P(3HB-co3HV) (3 mol% 3HV, PM 300,000) e volastonita foram propostas para a liberao da gentamicina durante o processo de reparo sseo, no somente para promover o crescimento tecidual, mas tambm para minimizar o risco de infeces. As microesferas foram preparadas por meio da formao de uma disperso slido em leo em gua (s/o/a) seguida da evaporao do solvente, e a gentamicina foi incorporada por imerso das partculas numa soluo do frmaco em tampo fosfato pH 7,4. A anlise morfolgica das partculas e os estudos de liberao em tampo fosfato e meio fisiolgico simulado revelaram a formao de uma camada microporosa de apatita na superfcie das microesferas, a qual permitiu o controle da liberao da gentamicina durante 22 dias, um perodo cerca de trs vezes maior quando as microesferas foram preparadas unicamente a partir do polister biodegradvel (LI & CHANG, 2005). Com a mesma finalidade teraputica, a tcnica de disperso slido em leo em gua (s/o/a) foi igualmente empregada para encapsular a gentamicina em microesferas constitudas de compsitos de P(3HB-co3HV) e hidroxiapatita (HA), esta ltima na forma de nanopartculas contendo o frmaco. Neste caso, a liberao do frmaco ocorreu num perodo de 10 semanas por um mecanismo de difuso, expressa pelo modelo matemtico de Higuchi (WANG et al., 2007). Recentemente, blendas de P(3HB-co-3HV) (9,8% 3HV) e policaprolactona (PCL) foram testadas na preparao de microesferas, com o intuito de encapsular um frmaco da classe das ftalocianinas, para uso na terapia fotodinmica, no tratamento do cncer. Tais frmacos, quando ativados por uma luz visvel de comprimento de onda apropriado, produzem espcies reativas de oxignio que levam destruio irreversvel dos tecidos tratados. Neste caso, o controle da liberao a partir de um sistema de liberao indispensvel para maximizar a ao do frmaco. Assim, para determinar a composio polimrica e peso molecular do PCL ideais, diferentes blendas foram empregadas na preparao das microesferas e a cintica de liberao do frmaco foi ento avaliada em plasma humano. O menor efeito burst foi obtido com a utilizao de PCL de menor peso molecular. Entretanto,

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com a utilizao de PCL de mesmo peso molecular, o aumento da proporo deste polmero na blenda conduziu a obteno de perfis de liberao mais aceitveis, alcanando o mximo em 24 horas (VACCARI et al., 2005). O emprego de blendas de P(3HB-co-3HV) (9,8% 3HV) e PCL tambm conduziu alterao da morfologia das micropartculas. Neste estudo, a velocidade de liberao da indometacina e do diclofenaco de sdio foi aumentada com o aumento da proporo de PCL na blenda e os resultados foram relacionados com a tortuosidade do sistema (POLETTO et al., 2007). Por outro lado, apesar das partculas de P(3HB) e P(3HB-co-3HV) serem mais rugosas e porosas do que partculas de PLAGA, preparadas nas mesmas condies, outros fatores tm sido relacionados rpida liberao do frmaco encapsulado. A maneira pela qual o frmaco encontra-se distribudo nas microesferas tambm tem demonstrado afetar o perfil de liberao. A localizao preferencial do frmaco na superfcie ou nas camadas mais externas das partculas tem conduzido obteno de velocidades de liberao muito rpidas, podendo ser associado elevada cristalinidade das microesferas obtidas a partir destes polmeros. De modo geral, partculas amorfas liberam o frmaco mais lentamente que partculas cristalinas, devido melhor disperso do frmaco no sistema e a maior interao frmaco-polmero (CARMINGNAN, 2006; FREIBERG & ZHU, 2004). Poucos estudos relatam a utilizao dos polihidroxialcanoatos na preparao de nanopartculas. Enzimas, precisamente a L-asparaginase, a catalase e a glicose oxidase, e a albumina srica bovina foram incorporadas em nanocpsulas de P(3HB-co-3HV) (8 mol% de HV) pela tcnica de dupla emulso a/o/a, com ou sem o tratamento prvio do polmero com borohidreto de sdio, para a reduo do seu peso molecular. Embora a quantidade de protena encapsulada no tenha aumentado, o tamanho da partcula diminuiu e a atividade enzimtica aumentou com o uso de um P(3HB-co-3HV) de baixo peso molecular, indicando que estas nanocpsulas apresentam uma maior permeabilidade, em decorrncia da diminuio da barreira polimrica difusional (BARAN, OZER, HASIRCH, 2002). Com o intuito de preparar conjugados de nanopartculas e frmacos e obter sistemas de liberao stio-especficos, copolmeros do poli(3-hidroxioctanoato) contendo grupamentos carboxlicos nas cadeias carbonadas laterais foram preparados por modificao qumica. Igualmente, copolmeros de PHAs de cadeia mdia, ligados

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covalentemente com unidades de PEG e PLA, foram sintetizados. Em ambos casos, as nanopartculas foram obtidas pela tcnica de deslocamento do solvente, com e sem a adio de estabilizantes. A presena dos grupamentos carboxlicos, assim como de unidades de PEG na superfcie das partculas proporcionou melhorias na estabilidade das mesmas frente agregao (KURTH et al., 2002; RENARD et al., 2003). Outros tipos de sistemas carreadores de frmacos tm sido preparados empregando os PHAs. Visando o tratamento da osteomielite, implantes de Sulperazone (sulfabactama e cefoperazona, 1:1, Pfizer) foram preparados a partir do P(3HB-co-3HV) apresentando diferentes propores de 3HV (7, 14 e 22 mol%). A liberao do frmaco a partir das microesferas foi significativamente maior quando o copolmero contendo 22 mol% de 3HV foi empregado. Este resultado foi relacionado com a reduo da cristalinidade do polmero contendo maior teor de 3HV que permitiu a mais rpida penetrao de gua na partcula, aumentando a velocidade de dissoluo dos cristais de frmaco e, conseqentemente, a velocidade de liberao do mesmo a partir da matriz polimrica. Por outro lado, a matriz polimrica permaneceu intacta no perodo testado, indicando que a liberao ocorre essencialmente por um mecanismo de difuso (GURSEL et al., 2002). O carreador constitudo de P(3HB-co-3HV) (22 mol% HV) contendo os frmacos foi implantado no sitio da infeco, previamente induzida pela inoculao de Staphylococcus aureus na tbia de coelhos. A efetividade do sistema foi verificada por mtodos macroscpicos, radiogrficos, bacteriolgicos e histolgicos. A infeco subsidiu e a remisso foi completa com o tratamento empregado, indicando que o sistema biodegradvel desenvolvido pode ser usado com sucesso no tratamento de infeces sseas severas (YAGMURLU et al., 1999; GURSEL et al., 2001). Como meio de prevenir a adeso de bactrias, discos ortopdicos revestidos com um complexo de gentamicina e P(3HB-co-3HV) (8 ou 12mol% de 3HV) foram implantados em pacientes com articulaes comprometidas. O aumento do teor de 3HV levou ao aumento da velocidade de liberao da gentamicina. A reduo significativa do nmero de S. aureus aderido aos discos, aps 48 horas de exposio em cultura de clulas, demonstrou a eficcia deste sistema. Alm disso, a alterao da hemodinmica de amostras de sangue no foi observada, confirmando a biocompatibilidade dos implantes (ROSSI, AZGHANI, OMRI, 2004).

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Recentes estudos tm demonstrado o interesse da utilizao de PHAs na obteno de sistemas de liberao transdrmicos. Adesivos transdrmicos preparados a partir de PHAs de cadeia mdia (8 mol% de 3HHx e 92 mol% de 3hidroxioctanoato) foram testados in vitro, usando a tansulosina como frmaco modelo. O cloridrato de tansulosina uma sulfonamida que apresenta atividade antagonista -adrenoreceptora, atualmente usada na clnica para o alvio dos sinais e sintomas da obstruo uretral causada pela hiperplasia prosttica benigna. Sua caracterstica de apresentar carga impede sua permeao atravs do estrato crneo. Por esta razo, o efeito promotor de absoro do frmaco pelo tratamento prvio da pele com dendrmeros foi avaliado pelos autores. Por meio da utilizao de dendrmeros, a matriz de PHA proporcionou a permeao de quantidades clinicamente requeridas de tansulmosina. Em decorrncia destes resultados promissores, adesivos transdrmicos a base de PHAs tambm foram testados na liberao de clonidina e cetoprofeno. O conjunto dos resultados indicou que estes biopolmeros ainda so aplicveis para a liberao transdrmica de frmacos (WANG et al., 2003; WANG et al., 2003). Finalmente, um sistema de liberao controlada foi obtido pela tcnica de compresso, usando P(3HB) como material de revestimento (KORSATTOWABNEGG, 1990). O revestimento dos ncleos contendo o frmaco com uma matriz de P(3HB) e um agente de formao de canais, tal como o cloreto de sdio, nitrato de potssio ou lactose, conduziu obteno de cinticas de liberao de ordem zero. Tais sistemas poderiam ser aplicveis tanto para a administrao oral como parenteral. Alm disso, complexos formados entre P(3HB) e PEG demonstraram modificar o perfil de dissoluo da teofilina a partir de comprimidos, retardando a liberao do frmaco com o aumento do teor de PEG 4000 no complexo (RODRIGUES et al., 2007). Como pode ser observado com o exposto, nenhum trabalho foi encontrado utilizando os polihidroxialcanoatos no preparo de uma forma farmacutica visando administrao intraarticular. Mesmo quando so aplicados outros polmeros, tais como o PLAGA (TUNAY et al., 2000; BOZDAG et al., 2001; HORISAWA et al., 2002; FERNNDEZ-CARBALLIDO et al., 2004) e polifosfazeno modificado (ZHANG et al., 2006), os estudos com esta via de administrao so escassos.

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2.3 Artrite Reumatide A deficincia de produo das clulas imunes ou uma funo defeituosa dessas clulas pode gerar um amplo espectro de doenas de imunodeficincia. A atividade excessiva de vrios componentes do sistema imune conduz ao surgimento de doenas alrgicas ou auto-imunes (FAUCI & HAYNES, 1998). Neste contexto, a artrite reumatide (AR) uma doena sistmica, crnica, inflamatria e auto-imune, de causa desconhecida, e caracterizada por uma tpica sinovite persistente que compromete as articulaes perifricas, embora haja uma variedade de manifestaes sistmicas (LIPSKY, 1998). No Brasil, estudo multicntrico verificou prevalncia de AR do adulto variando de 0,2 a 1% da populao, o que significa cerca de 1,8 milhes de brasileiros acometidos pela doena (MARQUES, 2005; LOUZADA-JUNIOR, 2007). Apesar do seu potencial destrutivo, a evoluo da AR pode ser muito varivel. A doena comea lenta e insidiosamente em mais da metade dos pacientes. A princpio, existem mal-estar, fadiga e dor musculoesqueltica generalizada, e somente aps algumas semanas a meses as articulaes so afetadas, s vezes com acometimento monoarticular, outras vezes oligoarticular e, em algumas circunstncias, poliarticular (em geral, simetricamente). As articulaes afetadas ficam tumefeitas, quentes, dolorosas e particularmente rgidas ao despertar ou aps inatividade. Aproximadamente 20% dos pacientes conseguem perodos de remisso parcial ou completa, mas os sintomas retornam inevitavelmente e acometem articulaes que ainda no haviam sido afetadas. O padro do acometimento articular varia, mas em geral as pequenas articulaes so afetadas antes das maiores. Os sintomas manifestam-se nas pequenas articulaes das mos (articulaes metacarpofalangianas e interfalangianas proximais) e nos ps, seguidas pelos pulsos, tornozelos, cotovelos e joelhos. Em mdia, a expectativa de vida reduzida de trs a sete anos. As fatalidades so devidas habitualmente s complicaes da AR assim como aos efeitos iatrognicos da terapia, como, por exemplo, sangramento gastrinstestinal relacionado com o uso a longo prazo de cido acetil saliclico e infeces associadas com o uso a longo prazo de esterides (COTRAN, KUMAR, ROBBINS, 1996; LIPSKY, 1998).

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A incidncia mxima de incio da artrite reumatide situa-se entre a quarta e a sexta dcadas de vida; entretanto, a AR pode surgir em qualquer poca, desde a infncia at a velhice. As mulheres tm duas a trs vezes mais probabilidades de serem acometidas do que os homens (ARNETT, 2001). Apesar de ainda existirem muitas incertezas, admite-se que a AR seja desencadeada pela exposio de um hospedeiro imunogeneticamente susceptvel a um antgeno microbiano artritognico. Dessa forma iniciada uma artrite aguda, mas que constitui uma reao auto-imune persistente em que as clulas T desempenham um papel central com a liberao local de mediadores inflamatrios e citocinas lticas que acabam destruindo a articulao. Portanto os fatores causais envolvidos so: (1) susceptibilidade gentica, (2) exposio a um antgeno artritognio exgeno primrio, (3) uma reao auto-imune dentro das membranas sinoviais e (4) presena de mediadores do dano articular (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1996). Uma hiptese constante sugere uma origem infecciosa para a AR. Foram propostos diversos candidatos bacterianos e virais. Verificou-se que certas infeces virais, como a rubola, vrus de Ross River e parvovrus B19, produzem poliartrite aguda, porm no existem evidncias que possam desencadear a AR crnica. O vrus Epstein-Barr (EBV) permanece sendo um candidato vivel, mas no-comprovado, ao qual se atribui um papel patognico, visto que so encontradas vrias respostas imunes incomuns contra esse vrus em pacientes com AR. Foi, tambm, constatado que uma protena do EBV compartilha os mesmos cinco aminocidos das molculas HLA-DR4 (Dw 14) e HLA-DR1, implicadas na suscetibilidade AR, levantando, assim, a possibilidade de mimetismo molecular como mecanismo. Observou-se, igualmente, uma homologia semelhante com a protena do choque trmico da Escherichia coli (ARNETT, 2001). As alteraes histopatolgicas da AR evoluem ao longo da durao desta doena crnica. O primeiro evento parece ser uma resposta inflamatria inespecfica iniciada por um estmulo desconhecido. Subseqentemente, uma resposta inicial, e talvez especfica, das clulas T CD4+ induzida, a qual amplifica e perpetua a inflamao. A presena de clulas T ativadas pode induzir estimulao policlonal das clulas B e a produo local de fator reumatide. medida que a leso tecidual ocorre, auto-antgenos adicionais so revelados e a natureza da resposta das clulas T amplia-se quando clones adicionais de clulas T CD4+ so recrutados para o local inflamatrio. Finalmente, em conseqncia da exposio persistente ao

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meio inflamatrio, a funo dos fibroblastos sinoviais alterada e eles podem adquirir um potencial destrutivo que no exige mais estimulao pelas clulas T ou macrfagos (LIPSKY, 1998). O diagnstico da AR primeiramente clnico. A tpica apresentao poliarticular, com dor, rigidez e inchao de mltiplas articulaes com padro simtrico (MAJITHIA & GERACI, 2007). A AR no tem cura e os objetivos do tratamento incluem: alvio da dor e rigidez, reduo dos efeitos colaterais indesejveis dos frmacos, manuteno da fora muscular e funo articular e, conseqentemente, da qualidade de vida do paciente. O programa inicial bsico que leva concretizao desses objetivos, na grande maioria dos pacientes, consiste em repouso absoluto, terapia antiinflamatria apropriada, medidas fsicas para manter a funo articular e a alterao da evoluo da doena por meio de terapia farmacolgica agressiva e precoce. A terapia antiinflamatria de suma importncia para o programa bsico, entretanto, todos os pacientes devem ser monitorizados devido possvel ocorrncia de nveis txicos. Freqentemente, os antiinflamatrios no-esteroidais (AINEs) administrados por via oral causam sangramento gastrointestinal, devendo assim, serem evitados ou prescritos com extrema cautela em pacientes com comprometimento da funo renal. Para o paciente, a interferncia funcional nas atividades dirias que determina o impacto do distrbio. Estudos mostraram que os pacientes com AR possuem uma probabilidade dez vezes maior de incapacidade no trabalho em comparao com a populao geral (ARNETT, 2001). O tratamento da AR um processo contnuo e o paciente precisa ser periodicamente reavaliado (MAJITHIA & GERACI, 2007). O tratamento farmacolgico da AR geralmente ocorre em trs frentes: administrao por via oral de baixas doses de AINES, injees intra-articulares de glicocorticides e utilizao de frmacos modificadores da doena (Figura 3) e, ainda, deve-se considerar modificadores da resposta biolgica. Os AINEs reduzem a dor e o inchao das articulaes, no entanto no alteram o curso da doena (MAJITHIA & GERACI, 2007). O uso prolongado de AINEs conduz a graves complicaes gastriintestinais e, alm disso, a administrao local de esterides gera srios efeitos adversos, tais como degenerao da cartilagem, sndrome de Cushing e risco de reao anafiltica (FERNNDEZ-CARBALLIDO et al., 2004). Dentre os AINEs utilizados no tratamento da artrite encontra-se o ibuprofeno.

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Uma alternativa de tratamento, com finalidade de reduzir os efeitos adversos e aumentar a adeso do paciente, seria a utilizao de injees localizadas, ou seja, intraarticulares, de microesferas polimricas contendo antiinflamatrios no esteroidais. Com este tipo de administrao possvel obter uma liberao controlada do frmaco, evitar o efeito do metabolismo de primeira passagem, reduzir os efeitos colaterais indesejveis, tornando a administrao mais cmoda e sendo uma alternativa administrao oral de medicamento (MORCILLO, 1993).

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FIGURA 3: Esquema do tratamento da artrite reumatide (Adaptado de LIPSKY, 1998).

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2.4 Ibuprofeno O ibuprofeno (cido 2-(4-isobutilfenil) propinico) um AINE pertencente ao subgrupo dos derivados do cido propinico, que apresenta atividade antiinflamatria, antipirtica e analgsica. provavelmente a molcula mais estudada clinicamente entre todos os AINEs (BEJARANO, 2006). O ibuprofeno se apresenta na forma de um slido cristalino, branco, com um leve odor e sabor caracterstico. Possui apenas um carbono assimtrico, existindo como ismero (S)(+) dextro ou (R)-(-) levo (Figura 4). O ibuprofeno comercial composto por uma mistura racmica, apesar de unicamente o enantimero S (-) ser ativo (HIGTON, 1999). Entretanto, o enantiomro R(-) sofre uma inverso metablica de configurao para formar a forma ativa (CARVALHO et al., 2006). Em outras palavras, quando o frmaco administrado na forma de racemato, o distmero convertido in vivo em eutmero, enquanto o ltimo no afetado.

FIGURA 4: Estrutura qumica do ibuprofeno.

O ibuprofeno um AINE pertencente classe II do Sistema de Classificao Biofarmacutica (BSC) (KOCBEK, BAUMGARTNER, KRISTL, 2006), a qual inclui frmacos com baixa solubilidade aquosa e alta permeabilidade (PARK & CHOI, 2006). praticamente insolvel em gua destilada, pouco solvel em hexano e bastante solvel em etanol, octanol, dimetil sulfxido e clorofrmio (Tabela 2). A solubilidade do ibuprofeno aumenta com pH, sendo o frmaco bastante insolvel a baixos pH. A determinao potenciomtrica da constante de dissociao do

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ibuprofeno fornece um valor de pKa de 4,54. Estudos tm demonstrado, tambm, que o ibuprofeno no possui polimorfismo e no higroscpio (HIGTON, 1999).

TABELA 2: Solubilidade aproximada do ibuprofeno em temperatura ambiente (HIGTON, 1999). SOLVENTE Acetona Etanol Octanol Hexano gua destilada SOLUBILIDADE (% p/v) >10 >10 33,0 3,3 <0,1

O sistema enzimtico das ciclooxigenases (COX) catalisa a converso de cido araquidnico em prostaglandinas (PGs) biologicamente ativas, dentro de mltiplos processos homeostsicos, em quase todos os rgos do corpo (proteo gastrintestinal, homeostase renal, funes uterinas, regulao da temperatura e do ritmo circadiano, entre outras). As prostaglandinas e outras citocinas regulam os processos reparativos correspondentes resposta inflamatria perifrica e conseqente sensibilizao neuronal e dor. Os AINES so empregados na teraputica por inibir a COX e regular a produo de PGs, diminuindo a inflamao e a hiperalgesia inflamatria e regulando as respostas neuronais basais, assim como os processos de transmisso neuronal nociceptiva no sistema nervoso central. A variabilidade entre os efeitos alcanados com o uso de determinado AINE depende, em primeiro lugar, do rgo onde encontra-se a enzima e, em segundo, de sua capacidade estrutural de adaptao a vrias funes (polimorfismo). As COXs so um famlia de isoenzimas, sendo conhecidas at o momento a COX1, COX2 e COX3. O ibuprofeno inibe as trs isoenzimas de modo eficaz (BEJARANO, 2006). A analgesia do ibuprofeno tem sido avaliada extensamente e apresenta uma relao dose resposta de comportamento linear que facilita seu uso clnico. No

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entanto, seus efeitos adversos se comportam na mesma forma de dose-resposta. As complicaes graves (hemorragia, perfurao, morte) representam a maior ameaa, especialmente para as populaes de risco (maiores de 75 anos, histrico de lceras, hemorragia gastrointestinal prvia). A administrao oral do ibuprofeno, assim como a dos demais AINEs, pode levar a eroses gstricas, lceras, sangramentos e morte por hemorragia gastrintestinal (BEJARANO, 2006) A metabolizao do ibuprofeno ocorre principalmente pelo fgado, onde convertido a 2-hidroxiibuprofeno e 2-carboxi ibuprofeno. Efeitos adversos pela utilizao de AINES so freqentes devido ao grande uso deste frmaco (AL-NASSER, 1999). O ibuprofeno rapidamente absorvido por via oral. Estudos demonstram que aps a administrao oral de 400 mg, concentraes plasmticas de 20-40 g/mL so observadas. O pico de concentrao ocorre entre 1-2 horas e diminui a 5 g/mL aps seis horas. A administrao de doses mltiplas de 400 mg de 8 em 8 horas (1200 mg/dia) durante dois dias, em 15 pacientes com artrite, conduziram obteno de concentraes plasmticas mdias de 20 g/mL e sinoviais de 7,5 g/L. A administrao tpica, quando em doses repetidas, pode proporcionar concentraes de frmaco 4-7 vezes maiores nos meniscos e cartilagens, comparada administrao oral. Por esta razo, a administrao tpica resulta em concentraes no soro e no lquido sinovial inferiores quelas alcanadas por administrao oral, o que explica a ausncia de efeitos adversos por esta via (BEJARANO, 2006). As propriedades farmacolgicas do ibuprofeno tornam-o um modelo de frmaco ideal para aplicaes em inmeros sistemas de liberao sustentada. O tmax na ordem de 1,5 h e a meia-vida no organismo de 2 h. Algumas tecnologias tm sido reportadas na literatura no intuito de prolongar a durao da ao do frmaco, ao retardar a sua liberao. Estas envolvem, geralmente, o recobrimento direto do frmaco, de grnulos, pellets, ou da forma farmacutica final, ou ainda, a incorporao deste em uma matriz que, in vivo, libera lentamente o frmaco por meio de processos envolvendo a eroso e/ou difuso do mesmo (HIGTON, 1999). Microesferas de PLA ou PLAGA contendo ibuprofeno tm sido preparadas e avaliadas quanto capacidade de prolongar a velocidade de liberao do frmaco. Leo e colaboradores (2000) observaram que parte do ibuprofeno apresenta-se no estado amorfo na superfcie de microesferas de PLA, quando estas so preparadas

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pela tcnica de emulso/evaporao do solvente. Esta camada superficial de frmaco leva obteno de um efeito burst pronunciado, sendo mais marcante a partir de microesferas com dimetro reduzido, devido maior rea superficial total. A remoo desta camada mais externa e amorfa de ibuprofeno, pela lavagem com soluo de carbonato de sdio, reduziu, quase que completamente, o efeito de liberao inicial. Quando a mesma tcnica foi usada para a preparao de microesferas, a prvia solubilizao do ibuprofeno no etanol provocou o deslocamento do frmaco em direo superfcie das partculas, acelerando ainda mais a velocidade de liberao, apesar do aumento da proporo do polmero na formulao ter causado um efeito contrrio (PERUMAL, 2001). Em outro estudo, a adio de Labrafil, um derivado do PEG, em microesferas de PLAGA, visando administrao intra-articular, modificou os perfis de liberao do ibuprofeno, controlando a velocidade de liberao e reduzindo o efeito burst. A formulao contendo 10% de Labrafil proporcionou concentraes in vitro prximas as calculadas como teraputicas (8 m/mL), durante 8 dias. A liberao do ibuprofeno a partir das microesferas sem aditivo alcanou 63-82% em apenas 24h, no satisfazendo a concentrao teraputica aps este perodo (FERNNDEZ-CARBALLIDO et al., 2004). Uma rpida liberao do ibuprofeno utilizando microesferas de PLAGA tambm foi obtida por Klose e colaboradores (2008), e foi atribuda a caracterstica cida do frmaco, que impossibilita sua interao com o polmero ou com os produtos de degradao deste, igualmente, cidos. A utilizao de novos polmeros para encapsulao de ibuprofeno, sintetizados a partir de -pentadecalactona, adipato de divinila e propano-1,3-diol (SH-L509) ou glicerol (SH-L510), tem, da mesma forma, demonstrado resultados interessantes. A velocidade de liberao encontrada com microesferas foi maior quando o polmero SH-L510 foi empregado, devido, provavelmente, a sua maior hidrofilicidade, facilitando a entrada do meio nas partculas (THOMPSON et al., 2007).

__________________________________3.

MATERIAIS E MTODOS

62

3.1 MATERIAIS 3.1.1 Matrias-primas * lcool polivinlico P.S. (Vetec, Brasil); * Gelatina farmacutica-262 (YOD, Brasil); * Ibuprofeno (lote 63602203, origem ndia, Fraccionata Distribuidora de Matriasprimas LTDA, Brasil); * Poli (D-L-cido ltico)-co-polietilenoglicol (PLA-PEG 66 kDa, 20% PEG 5000 kDa) (Alkermes Inc., EUA); * Poli-(3-hidroxibutirato) (Biocycle 1000 FE 117, Mn= 312,800 g mol-1, Industrial S.A., Brasil); * Trimiristato de glicerila (Dynasan114, Sasol, Alemanha). PHB

3.1.2 Reagentes e solventes Todos os solventes utilizados possuam grau de pureza para anlise (p.a). * cido fosfrico 85% (Vetec); * lcool etlico (Vetec); * lcool isoproplico (F. Maia Indstria e Comrcio); * Clorofrmio (99,5%) (Synth); * Diclorometano (Cromato Produtos Qumicos LTDA); * Fosfato monobsico de potssio (Vetec); * Hidrxido de sdio (Vetec); * Metanol (F. Maia Indstria e Comrcio);

3.1.3. Equipamentos * Agitadores ARE (Velp Scientfica); * Balana analtica (Ohaus Corporation AS200);

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* Banho Dubnoff CT 232 (Cientec); * Calormetro diferencial de varredura, detector tipo DSC-50 (Shimadzu); * Centrfuga 4K15 (Sigma); * Difratmetro de Raios-X marca SIEMENS modelo D5000; * Dissolutor Modelo 299 (Nova tica); * Espectrofotmetro UV/Vis (Perkin Elmer Lamba 10); * Evaporador rotativo Q-344B (Quimis ); * Granulmetro a laser Cilas, modelo 1064; * Liofilizador Micromodulyo E-C (Shimadzu); * Manta aquecedora (Fisatom); * Microscpio eletrnico de varredura Philips XL 30; * Mufla MQBEP2000MP (Microqumica); * pHmtro Acor Series (Oakton); * Ultra som, Ultrasonic clear USC 700 (Unique); * Viscosmetro Cannon Fenske AS 350 (Schott); * Vortex Mixer KMC-1300V (Vision Scientific CO. LTD).

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3.2 MTODOS

PARTE I Avaliao do efeito da adio de trimiristato de glicerila sobre a liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli-(3-hidroxibutirato)

3.2.1 Preparao e caracterizao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir de blendas de poli-(3-hidroxibutirato) e trimiristato de glicerila 3.2.1.1 Preparao das microesferas A preparao das microesferas foi realizada pelo mtodo de

emulso/evaporao do solvente, conforme descrito por Watts e colaboradores (1990), e sob os parmetros e concentraes utilizados por Carmingnan (2006). Brevemente, uma soluo contendo o P(3HB) puro ou uma mistura de P(3HB) e trimiristato de glicerila (TMG) em clorofrmio ou diclorometano foram adicionados, lentamente, numa soluo aquosa de lcool polivinlico 1% (p/v) ajustada a pH 5,0, sob agitao magntica de 800 rpm. A emulso formada foi mantida sob agitao em temperatura ambiente at completa evaporao do solvente orgnico. Aps repouso das formulaes por 24 h, o sobrenadante foi descartado e as microesferas foram lavadas com gua destilada, centrifugadas a 1000 rpm durante 3 minutos, e liofilizadas por 48 horas sob presso de 5 Pascal e temperatura de -50 oC. Estes procedimentos conduziram a um rendimento mdio em partculas de (86,68 + 7,46)%. A solubilizao do P(3HB) no solvente orgnico foi realizada aps a modificao de sua cristalinidade por um tratamento trmico, que consistiu no aquecimento do polmero at fuso (180oC), seguido de resfriamento abrupto em banho de gelo. Diferentes propores de P(3HB) e TMG foram testadas: 9:1, 4:1, 3:1 e 1:1 e 1:0. Quando diclorometano foi utilizado como solvente, lcool isoproplico foi adicionado fase externa, aps a formao da emulso o/a. Para a preparao das microesferas contendo ibuprofeno (IBF), o frmaco foi adicionado na fase orgnica das formulaes, numa proporo frmaco:P(3HB) ou frmaco:blenda de 1:4. Todas as formulaes foram preparadas em triplicata. Um esquema ilustrativo da

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preparao das microesferas apresentado na Figura 5. A composio das formulaes testadas encontra-se demonstrada na Tabela 3.

FASE INTERNA P(3HB) ou blendas de P(3HB)/TMG, IBF clorofrmio/ diclorometano

FASE EXTERNA Fase aquosa contendo 1% (p/v) de PVA

Agitao magntica a 800 rpm, Tamb

Evaporao do solvente

Repouso 24 h; Centrifugao, 1000 rpm, 3 min; Lavagem com gua destilada; Liofilizao.

emulso o/a

microesferas

FIGURA 5: Esquema ilustrativo da preparao das microesferas pelo mtodo de emulso/evaporao do solvente.

3.2.1.2 Avaliao da viscosidade cinemtica da fase interna A avaliao da viscosidade cinemtica da soluo de P(3HB) ou de P(3HB) e TMG em clorofrmio, utilizadas como fase interna, foi realizada em um viscosmetro Cannon-Fenske automtico, equipado com um capilar de 0,44 mm de dimetro, termostatizado a 25 oC. As anlises foram conduzidas em triplicata e as viscosidades foram determinadas a partir do tempo requerido pela soluo para percorrer determinada regio do capilar (fluxo), por meio da seguinte equao:

V = k . (t - )

V = viscosidade cinemtica em cSt k = constante do capilar utilizado (cSt/s) t = tempo de corrida (s) = fator de correo da energia cintica (s)

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TABELA 3: Composio das microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e TMG.

Formulao 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fase orgnica P(3HB)1 (mg) TMG (mg) IBF2 (mg) Clorofrmio qsp (mL) Diclorometano qsp (mL) Fase aquosa Soluo de PVA 1% 100 (p/V) pH 5,0 (mL) lcool isoproplico (mL) Proporo P(3HB):TMG
1 2

200 50 20 -

180 20 50 20 -

160 40 50 20 -

150 50 50 20 -

100 100 50 20 -

600 150 60

540 60 150 60

480 120 150 60

450 150 150 60

300 300 150 60

100 -

100 -

100 -

100 -

300 10

300 10

300 10

300 10

300 10

1:0

9:1

4:1

3:1

1:1

1:0

9:1

4:1

3:1

1:1

Foi utilizada uma soluo do polmero 1% (p/v) em clorofrmio ou diclorometano. Para a preparao das microesferas contendo frmaco.

3.2.1.3 Caracterizao das microesferas 3.2.1.3.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas 3.2.1.3.1.1 Curva de calibrao do IBF em metanol Para a construo da curva de calibrao 500 mg de IBF, exatamente pesados, foram dissolvidos em metanol e o volume completado at 50,0 mL, em balo volumtrico. Esta soluo foi ento diluda de modo a obter solues metanlicas de IBF em concentraes variando entre 200,0 e 650,0 g/mL. As solues foram preparadas em triplicata e analisadas por espectrofotometria de absoro no ultravioleta no comprimento de onda de 265 nm, contra o mesmo

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solvente. A curva de calibrao foi construda a partir das mdias das absorbncias de cada concentrao, e a equao da reta e o coeficiente de correlao foram calculados pela anlise de regresso linear.

3.2.1.3.1.2 Determinao da eficincia de encapsulao e do teor de ibuprofeno Cerca de 60 mg de microesferas foram pesadas em um balo volumtrico de 25,0 mL e o volume completado com metanol. A mistura foi submetida agitao magntica por 4 horas a temperatura ambiente. Este tempo foi estipulado atravs da avaliao de dois perodos diferentes de extrao, 2 e 4 horas. Aps as 4 horas, alquotas do sobrenadante foram coletadas e analisadas em espectrofotmetro a 265 nm. A concentrao de IBF foi determinada por meio da comparao da absoro da amostra com aquela obtida por uma soluo padro de IBF 400 g/mL em metanol, analisada nas mesmas condies. A eficincia de encapsulao (E.E.%) e o teor de frmaco (mg IBF/100 mg de microesferas) foram calculados conforme as equaes demonstradas abaixo: E .E = Cibf 25 100 Qi

Teor =

Cibf 25 100 Qp

onde: Cibf = concentrao de ibuprofeno na soluo analisada (mg/mL); Qi = massa de frmaco adicionado nas formulaes (mg); Qp= massa de microesferas pesadas (mg).

Os resultados foram expressos pela mdia de trs determinaes e os valores de teor de ibuprofeno nas microesferas foram analisados e comparados por meio da ANOVA. Quando diferena significativa entre as mdias foi detectada, a determinao de onde esta diferena ocorreu foi realizada pela aplicao do teste t, onde a diferena mnima significativa calculada empregando-se a seguinte equao:

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1 1 d .m.s. = t + QMR n1 n2

onde: QMR o quadrado mdio do resduo da anlise de varincia, n o nmero de repeties de cada um dos tratamentos, t o valor dado na tabela ao nvel de significncia escolhido (p<0,05). Assim, duas mdias so estatisticamente diferentes toda vez que o valor absoluto da diferena entre elas for igual ou maior que a d.m.s.

3.2.1.3.2 Avaliao da morfologia das microesferas A morfologia das microesferas foi avaliada por microscopia eletrnica de varredura (MEV) em microscpio Philips XL 30. As amostras foram fixadas com fita dupla-face em suportes de alumnio e recobertas com uma fina camada de ouro de 350 de espessura, em aparelho a vcuo Polaren E 500. As fotomicrografias foram obtidas nos aumentos de 250 e 1000 vezes.

3.2.1.3.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) Microesferas brancas e contendo IBF, obtidas a partir do P(3HB) e P(3HB):TMG 3:1, assim como os compostos puros e suas misturas fsicas, foram analisados por calorimetria exploratria diferencial (DSC) em um equipamento DSC50 (Shimadzu). Cerca de 3-14 mg de microesferas foram pesadas em cpsulas de alumnio, as quais foram lacradas, resfriadas a -50oC, e em seguida aquecidas at 250oC, numa velocidade de 10oC/min, sob atmosfera de nitrognio. As temperaturas de transio vtrea (Tg) e de fuso (Tf) foram ento obtidas a partir dos termogramas.

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3.2.1.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas 3.2.1.4.1 Curva de calibrao do IBF em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 Para a construo da curva de calibrao, uma soluo metanlica de IBF foi preparada na concentrao de 10,0 mg/mL. Esta soluo foi diluda em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 a fim de obter solues nas concentraes: 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 800 e 1000 g/mL. As solues foram preparadas em triplicata e analisadas em espectrofotmetro a 265 nm. A curva de calibrao foi construda a partir das mdias das absorbncias de cada concentrao, e a equao da reta e o coeficiente de correlao foram calculados pela anlise de regresso linear.

3.2.1.4.2 Determinao da solubilidade do IBF no meio de liberao Cerca de 1 g de IBF foi colocado em 20 mL de tampo fosfato 0,02M pH 7,4 e a mistura foi mantida sob agitao magntica a 800 rpm por 48 horas, em temperatura ambiente. Uma alquota da mistura foi coletada, centrifugada a 5000 rpm durante 5 minutos e diluda cinco vezes com a soluo tampo. A soluo resultante foi analisada em espectrofotmetro a 265 nm. As amostras foram preparadas em triplicata e a concentrao de IBF foi determinada pela comparao da absorbncia das amostras com aquela obtida com uma soluo padro de IBF, analisada nas mesmas condies.

3.2.1.4.3 Avaliao do perfil de liberao do IBF em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 Para o ensaio de liberao, 100 mg de microesferas foram pesadas em frascos mbar e colocadas em 20 mL de tampo fosfato 0,02 M pH 7,4. Os frascos foram fechados e colocados em banho a 37 oC, sob agitao mecnica constante. Alquotas de 2,0 mL foram coletadas aps 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 e 168 horas, e analisadas em espectrofotmetro a 265 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata e, aps cada coleta, o volume do meio foi reposto. A concentrao de IBF no meio de liberao foi determinada pela comparao das absorbncias das amostras com aquela obtida a partir de uma soluo padro de IBF 400 g/mL, analisada nas mesmas condies.

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A partir dos resultados, curvas de liberao de IBF, expressas em porcentagens (%) de frmaco liberado versus tempo (h), foram construdas.

3.2.2 Preparao e avaliao da morfologia de filmes obtidos a partir de blendas de poli (3-hidroxibutirato) e trimiristato de glicerila 3.2.2.1 Preparao dos filmes Filmes de P(3HB) e P(3HB):TMG nas propores 9:1, 4:1, 3:1 e 1:1, foram preparados, utilizando clorofrmio ou diclorometano como solvente. Para tal, 30 mL das solues orgnicas contendo o polmero ou uma mistura de polmero e TMG foram vertidas em placas de Petri, posteriormente acondicionadas em dessecador para evaporao do solvente, em temperatura ambiente. Aps a completa evaporao do solvente, os filmes foram removidos cuidadosamente das placas.

3.2.2.2 Avaliao da morfologia dos filmes As superfcies superiores dos filmes e as suas respectivas superfcies de fratura foram avaliadas por microscopia eletrnica de varredura, conforme procedimentos descritos em 3.2.1.3.2. As fotomicrografias foram obtidas nos aumentos de 500 e 1000 vezes.

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PARTE II Efeito da adio de poli (D-L-cido ltico)-b-poli(etilenoglicol) (PLAPEG) e gelatina (GEL) sobre as propriedades fsico-qumicas das partculas e sobre o perfil de liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli-(3hidroxibutirato) 3.2.3 Preparao e caracterizao das microesferas 3.2.3.1 Preparao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG As microesferas foram preparadas conforme descrito em 3.2.1.1, empregando o diclorometano como solvente orgnico da fase interna. Diferentes propores de P(3HB) e PLA-PEG foram testadas: 1:0, 3:1 e 1:1. lcool isoproplico foi adicionado fase externa aps a formao da emulso o/a, em uma proporo de 1 mL para cada 30 mL de soluo de lcool polvinlico 1%. Estas microesferas foram denominadas de brancas e aquelas contendo IBF foram obtidas pela adio de IBF na proporo frmaco:P(3HB) ou frmaco:blenda de 1:4, na fase interna das formulaes. A composio das formulaes pode ser visualizada na Tabela 4. TABELA 4: Composio das microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG. Proporo P(3HB):PLA-PEG 1:0 Fase orgnica P(3HB)1 (mg) PLA-PEG (mg) IBF2 (mg) Diclorometano qsp (mL) Fase aquosa Soluo de PVA 1% (p/V) pH 5,0 (mL) lcool isoproplico (mL)
1 2

3:1

1:1

600 150 60

450 150 150 60

300 300 150 60

300 10

300 10

300 10

Foi utilizada uma soluo do polmero 1% (p/v). Para a preparao das microesferas contendo frmaco.

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3.2.3.2 Preparao das microesferas brancas e contendo ibuprofeno a partir do P(3HB) e gelatina Microesferas de P(3HB) e gelatina (GEL) foram preparadas pelo mtodo de dupla emulso/ evaporao do solvente, descrita por Watts (1990). Neste caso, uma soluo aquosa de gelatina 1% pH 6,5, contendo ou no etanol, foi adicionada em uma soluo de P(3HB) em diclorometano, sob agitao magntica a 1200 rpm. Em seguida, a emulso a/o formada foi adicionada em 300 mL de uma soluo de PVA 1% pH 5,0, tambm sob agitao magntica a 1200 rpm. A dupla emulso formada foi mantida sob agitao em temperatura ambiente at completa evaporao do solvente orgnico. Aps repouso das formulaes por 24 h, o sobrenadante foi descartado e as microesferas foram lavadas com gua destilada, centrifugadas a 1000 rpm durante 3 minutos, e liofilizadas. As formulaes contendo etanol foram previamente submetidas evaporao sob presso reduzida para remoo do solvente. Estas microesferas foram denominadas de brancas e aquelas contendo IBF foram obtidas pela disperso prvia do frmaco na soluo aquosa de gelatina 1%, na proporo frmaco:P(3HB) de 1:4. A composio das formulaes pode ser visualizada na Tabela 5. Um esquema ilustrativo da preparao das microesferas encontra-se demonstrado na Figura 6.

Soluo de gelatina 1% pH 6,5; IBF; etanol

Sol. P(3HB) 10 mg/mL agitao 1200 rpm

evaporao do solvente Repouso por 24 horas; Centrifugao a 1000 rpm por 3 min; Lavagem com gua destilada; Liofilizao. microesferas

Soluo PVA Emulso a/o 1% pH 5,0; agitao 1200 rpm

Emulso a/o/a

FIGURA 6: Esquema ilustrativo da preparao de microesferas de P(3HB) e gelatina.

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TABELA 5: Composio das formulaes de microesferas preparadas a partir do P(3HB) e gelatina 10:1. Formulao 1 Fase aquosa 1 Gelatina1 (mg) Etanol (mL) IBF2 (mg) gua (mL) Fase orgnica P(3HB)3 (mg) Diclorometano qsp (mL) Fase aquosa 2 Soluo de PVA 1% (p/V) pH 5,0 (mL)
1 2

60 150 6

60 1 150 6

600 60

600 60

300

300

Foi utilizada uma soluo de gelatina 1% (p/v). Para a preparao das microesferas contendo frmaco (p/v). 3 Foi utilizada uma soluo do polmero 1%.

3.2.3.3 Caracterizao fsico-qumica das microesferas 3.2.3.3.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas A determinao da eficincia de encapsulao e do teor de frmaco foi realizada conforme metodologia descrita em 3.2.1.3.1.

3.2.3.3.2 Avaliao da morfologia das microesferas A superfcie e morfologia das microesferas, antes e aps o ensaio de liberao, foram avaliadas por microscopia eletrnica de varredura, conforme descrito em 3.2.1.3.2. As fotomicrografias foram obtidas nos aumentos de 250 e 1000 vezes.

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3.2.3.3.3 Determinao do dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas O dimetro mdio e a distribuio granulomtrica das microesferas foram determinados por granulometria a laser em equipamento Cilas modelo 1064 (0,04 500 m), aps disperso das partculas em gua, com auxlio de ultrasom.

3.2.3.3.4 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) As propriedades trmicas das microesferas brancas e contendo IBF, obtidas a partir do P(3HB), P(3HB):PLA-PEG 3:1 e P(3HB):GEL 10:1, assim como os compostos puros e suas misturas fsicas, foram avaliadas por calorimetria exploratria diferencial (DSC), conforme descrito em 3.2.1.3.3.

3.2.3.3.5 Difrao de Raios-X Os modelos de difrao de raios-X das microesferas brancas e contendo IBF, obtidas a partir do P(3HB), P(3HB):PLA-PEG 3:1, P(3HB):PLA-PEG 1:1 e P(3HB):GEL 10:1, assim como os compostos puros e suas misturas fsicas, foram obtidos utilizando um difratmetro marca SIEMENS modelo BRUKER-AXES D5000 equipado com gonimetro - . Na emisso de raios-X foi utilizado nodo de cobre radiao CuK, = 1,54 , voltagem de 40kV e intensidade de corrente de 25 mA. As fendas foram de 1o e 1o (divergente e de antiespalhamento) e de 2 mm no monocromador de grafite. As anlises foram realizadas em uma faixa de 2 a 75 em temperatura ambiente de 25 oC.

3.2.3.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas O perfil de liberao das microesferas contendo IBF foi avaliado pelo mtodo da dilise, usando um aparelho de dissoluo (Dissolutor modelo 299, Nova tica, Brasil). Neste mtodo, cerca de 300 mg de microesferas foram pesadas e transferidas para o interior de um saco de dilise (Spectra/Por CE MIUCO 10000) e ressuspensas com 1,0 mL de tampo fosfato 0,02 M pH 7,4. Aps o fechamento, o

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saco de dilise foi colocado em 300 mL de tampo fosfato 0,02 M pH 7,4 a 37 oC, mantido sob agitao de 70 rpm. Alquotas de 2 mL do meio foram coletadas aps 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 33, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 h de ensaio, e analisadas em espectrofotmetro a 265 nm. O ensaio foi conduzido em triplicata e, aps cada coleta, o volume removido foi reposto para o meio de liberao. A concentrao de IBF no meio foi obtida por meio da comparao das absorbncias das amostras analisadas com aquela obtida para uma soluo padro de IBF 400 g/mL, analisada nas mesmas condies. A partir dos resultados, curvas de liberao de IBF, expressas em porcentagens (%) de frmaco liberado versus tempo (h), foram construdas. Os perfis de liberao obtidos com as diferentes formulaes foram analisados e comparados estatisticamente pela ANOVA, empregando-se como variveis o percentual de frmaco liberado aps 1 hora e as reas sob as curvas de liberao (ASC), calculadas pelo mtodo trapeizodal, nos demais perodos do ensaio. A comparao entre as mdias foi realizada mediante aplicao do teste t. O valor de diferena mnima significativa entre duas mdias foi calculado empregandose a seguinte equao:

1 1 d .m.s. = t + QMR n1 n2
onde: QMR o quadrado mdio do resduo da anlise de varincia, n o nmero de repeties de cada um dos tratamentos, q o valor dado na tabela ao nvel de significncia escolhido (p<0,05).

3.2.3.5. Preparao e avaliao da morfologia de filmes obtidos a partir de blendas de poli-(3-hidroxibutirato) e poli-(D,L-cido ltico)-b-poli(etilenoglicol) 3.2.3.5.1 Preparao dos filmes Filme de P(3HB) e P(3HB):PLA-PEG na proporo de 3:1 foi preparado, utilizando diclorometano como solvente, conforme descrito em 3.2.2.1.

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3.2.3.5.2 Avaliao da morfologia dos filmes As superfcies superiores dos filmes e as suas respectivas superfcies de fratura foram avaliadas por microscopia eletrnica de varredura, conforme procedimentos descritos em 3.2.1.3.2. As fotomicrografias foram obtidas nos aumentos de 500 e 1000 vezes.

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PARTE III Avaliao preliminar da eficcia teraputica in vivo do ibuprofeno liberado a partir das microesferas em modelo de artrite crnica induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA)

3.2.4 Animais Os experimentos foram realizados com ratos fmeas Wistar com idade aproximada de trs meses, pesando entre 200 e 300 g. Os animais foram criados at o desmame pelo Biotrio Central da Universidade Federal de Santa Catarina e mantidos no Biotrio Setorial do Departamento de Farmacologia at o incio dos experimentos, onde foram deslocados ao Biotrio do Laboratrio de Neurobiologia da Nocicepo. Os animais foram mantidos sob condies controladas de temperatura (22 1C) e luz (ciclo de claro/escuro de 12 horas) e com acesso gua e comida ad libitum. No dia do experimento, os animais foram removidos do biotrio cerca de 1 hora antes para ambientao. Os ensaios in vivo foram conduzidos aps prvia aprovao do protocolo de pesquisa pelo Comit de tica para o Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina (Protocolo PP00075).

3.2.5 Protocolos Experimentais 3.2.5.1 Induo da artrite crnica pelo Adjuvante Completo de Freund (CFA) A estimulao da artrite crnica pelo CFA (suspenso de Mycobacterium butyricum morto em leo mineral, 1mg/mL, Difco) e a incapacitao articular foram conduzidas em duas etapas, conforme descrito por Gomes (2007). Na primeira etapa, 50 L de CFA foram injetados na base da cauda dos animais. Esta injeo intra-drmica (i.d.) foi realizada com auxlio de uma seringa de 1 mL e agulha 13 x 4,5 mm e contitui-se no primeiro estmulo artritognico recebido pelos animais. Aps 21 dias, a incapacitao articular foi obtida pela injeo intraarticular (i.a.), no joelho posterior direito, do mesmo volume de CFA (reestimulao). A injeo intraarticular foi realizada na articulao tbio-femural atravs do ligamento suprapatelar, para o interior da cavidade sinovial e os stios de injeo foram previamente depilados e

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submetidos anti-sepsia com soluo de lcool iodado. Todos os tratamentos foram conduzidos aps 24 horas da reestimulo com CFA.

3.2.5.2 Avaliao da incapacitao articular Para avaliar o grau de incapacitao motora do membro que recebeu o estmulo nociceptivo, foi utilizado o modelo de incapacitao articular em ratos, descrito por Tonussi e Ferreira (1992). Este modelo consiste na determinao do tempo de elevao da pata (TEP) de animais submetidos a caminhada forada por 60 segundos. A caminhada realizada em um cilindro de ao inox (30 cm de largura e 30 cm de dimetro), coberto com tela de arame de trama fina de ao inoxidvel, com rotao contnua de 3 rpm. A superfcie do cilindro dividida em trs trilhos iguais, o que permite a avaliao de trs animais simultaneamente. Em ambas as patas posteriores do animal so ajustadas sapatilhas metlicas e a sapatilha colocada na pata direita conectada porta de dados do computador (Figura 7). O tempo total que a pata posterior direita dos animais fica sem tocar a superfcie do cilindro durante este perodo registrado pelo programa Ratlimb (Tonussi e Ferreira, 1992). Neste modelo, o TEP dos animais sem estimulao articular varia em torno de 10 segundos enquanto a injeo intraarticular de substncias alognicas causa elevao deste valor, indicando o desenvolvimento de incapacitao articular. Os animais foram treinados na roda antes da realizao dos experimentos.

FIGURA 7: (A) Ratas com as sapatilhas metlicas e (B) cilindro de ao inox utilizado na determinao da incapacitao articular atravs da medida do tempo de elevao da pata (TEP,s).

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3.2.5.3 Avaliao do edema articular A avaliao do edema articular induzido por CFA foi realizada por meio da medida do dimetro articular, imediatamente aps cada medida da incapacitao articular. Para isso, os animais foram gentilmente imobilizados dentro de um cone de polietileno e a medida do dimetro da articulao tbio-femural do joelho posterior direito foi obtida com auxlio de um paqumetro no digital (Figura 8). Os dados foram expressos como sendo a diferena mdia entre o valor obtido antes da reestimulao com CFA e os valores obtidos aps o tratamento (variao do dimetro articular, DA, cm).

FIGURA 8: Medida do dimetro articular com auxlio de um paqumetro no-digital.

3.2.5.4 Leucograma do fluido sinovial Ao trmino do perodo de sete dias de cada tratamento, os animais foram sacrificados por injeo de hidrato de cloral (15%, 3 mL/animal) seguida de desclocamento cervical. Aps eutansia e exposio da cpsula articular, a retirada do lquido sinovial da articulao do joelho posterior direito e a lavagem da cavidade articular com 100 L salina heparinizada foram realizadas. Este lavado foi utilizado para a contagem total de leuccitos com auxlio de uma cmera de Neubauer e microscpio ptico, com aumento de 40x.

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3.2.6 Avaliao da resposta teraputica do ibuprofeno aps administrao i.a. das microesferas Para avaliar a resposta teraputica alcanada com o ibuprofeno liberado a partir das microesferas, a formulao que demonstrou o melhor desempenho in vitro foi selecionada e o delineamento do experimento foi conduzido conforme exposto na Tabela 6. A dose de ibuprofeno selecionada para administao intraarticular foi de 50 g, com base em concentraes teraputicas tericas descritas na literatura (FERNANDZ-CARBALLIDO, 2004). As microesferas foram pesadas considerando o teor de frmaco encapsulado, sendo as microesferas brancas pesadas na mesma proporo. O frmaco livre e as microesferas contendo ibuprofeno foram ressuspendidos em 50 L de salina com 5% de tween 80 e o stio de injeo foi previamente depilado e submetido anti-sepsia com soluo de lcool iodado. A avaliao da incapacitao e do edema articular ocorreu 24 horas antes da reestimulao, 1, 24, 48, 72, 96, 120 e 168 h aps o tratamento. Cada grupo contituiu-se de seis animais.

TABELA 6: Delineamento dos grupos de animais utilizados para avaliar a resposta teraputica com ibuprofeno liberado a partir das microesferas.
Grupos Controle positivo Grupo A Via de administrao i.a. Tratamento CFA/salina + 5% tween 80 i.a. CFA/IBF livre/ salina + 5% tween 80 Grupo B i.a CFA/Microesferas brancas/ salina + 5% tween 80 Grupo C i.a. CFA/Microesferas com IBF/ salina + 5% tween 80 50 50 Dose IBF (g) -

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3.2.7 Anlise estatstica dos resultados Os resultados foram apresentados como mdia erro padro da mdia de seis animais. A anlise estatstica dos dados foi realizada no programa Graph Pad Prism 3.0, atravs da anlise de varincia (ANOVA) de uma via ou para medidas repetidas, seguida pelo teste de Tukey (p < 0,05).

_____________________________4.

RESULTADOS E DISCUSSO

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PARTE I Efeito da adio de trimiristato de glicerila sobre a liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli-(3-hidroxibutirato) 4.1 Preparao e caracterizao das microesferas Em decorrncia da elevada cristalinidade e elevada massa molar (312,800 g mol-1), os polihidroxialcanoatos so polmeros que perdem massa muito lentamente quando comparados a outros polisteres alifticos como o poli-(D,Lcido ltico). A liberao de molculas ativas de reduzida massa molar a partir de matrizes de PHAs ocorre por meio da penetrao de gua e formao de poros, numa velocidade substancialmente maior que a degradao do polmero. Conseqentemente, microesferas preparadas a partir destes materiais tendem a se acumular no organismo aps implantao. Portanto, aplicaes dos PHAs em sistemas de liberao dependem, na maioria das vezes, da formao de blendas adequadas com outros materiais biocompatveis, uma vez que estas permitem controlar a cristalinidade, porosidade e velocidade de eroso das partculas e, por conseguinte, a capacidade de incorporao e de liberao dos frmacos (CHEN, WU, 2005). O efeito da formao de blendas de P(3HB) e trimiristato de glicerila (TMG) (Figura 9) sobre as caracterticas fsico-quimicas e sobre a velocidade de liberao do IBF a partir das microesferas foi avaliado na primeira parte deste trabalho. Os steres de triglicerdeos so matrias-primas amplamente empregadas na preparao de formulaes lipdicas de uso parenteral, tendo sido utilizados por outros autores na preparao de microesferas. Blendas de diferentes propores de P(3HB) e TMG foram testadas. Como o ibuprofeno um frmaco pouco solvel em gua, mas solvel em clorofrmio e diclorometano, era esperado que este antiinflamatrio fosse facilmente incorporado nas microesferas pelo emprego da tcnica de emulso o/a, seguida pela evaporao do solvente. A velocidade de eliminao do solvente pode influenciar as propriedades finais das partculas (RADWAN et al., 1995) e, portanto, foi uma das condies consideradas no delineamento dos experimentos. Assim, o uso de clorofrmio e diclorometano como solventes da fase interna e a adio de lcool isoproplico na fase externa foram igualmente testados. As demais condies empregadas no preparo das

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microesferas, descritas em 3.2.1.1., foram aquelas estipuladas por Carmingnan (2006).

FIGURA 9: Estrutura qumica do trimiristato de glicerila.

4.1.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas Conforme exposto em 3.2.1.3.1.2, a espectrofotometria de absoro no ultravioleta foi empregada para determinao da eficincia de encapsulao e do teor do IBF. Para isto, uma curva de calibrao do IBF foi construda aps anlise de solues metanlicas do frmaco com concentraes variando entre 200 e 650 g/mL. Na Figura 10 encontra-se demonstrada a curva de concentrao de ibuprofeno versus absorbncia, assim como a equao da reta e o coeficiente de correlao, obtidos aps anlise da regresso linear. Na faixa de concentrao testada, o mtodo usado demonstrou um comportamento linear significativo. A ausncia de erro sistemtico constante tambm foi verificada, uma vez que os valores do intervalo de confiana do intercepto incluram o valor zero (Tabela 7).

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FIGURA 10: Curva de calibrao do ibuprofeno em metanol obtida por espectrofotometria de absoro no ultravioleta.

TABELA 7: Anlise dos dados da regresso obtidos a partir da curva de calibrao do ibuprofeno por espectrofotometria de absoro no ultravioleta. Parmetros de regresso Intercepto (intervalo de confiana) Inclinao (intervalo de confiana) R2 Valores -0,0079 (-0,49066 a 0,47486) 0,0013 (-0,00769 a 0,01029) 0,9994

Os valores de eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno obtidos aps extrao e determinao do frmaco por espectrofometria de absoro no ultravioleta esto demonstrados na Tabela 8.

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TABELA 8: Valores de eficincia de encapsulao e de teor de ibuprofeno nas microesferas (n=3).

E.E. + d.p. (%) Formulaes P(3HB) P(3HB):TMG 9:1 P(3HB):TMG 4:1 P(3HB):TMG 3:1 P(3HB):TMG 1:1
1

Teor de frmaco + d. p. (mg IBF/100mg microesferas) Clorofrmio Diclorometano1 16,26 + 0,95 14,69 + 0,92 16,38 0,76 12,48 + 2,75 13,31 + 0,43 16,26 + 0,04 15,46 + 0,03 15,83 + 0,27 16,28 + 0,21 13,70 + 0,31

Clorofrmio Diclorometano1 81,98 + 4,97 81,22 + 0,33 77,33 + 0,13 79,13 + 1,34 81,39 + 1,01 68,49 + 1,55

73,89 + 4,59 81,05 + 4,65 62,55 + 13,67 66,58+ 2,13

Com adio de lcool isoproplico na fase externa, aps formao da emulso.

Como pode ser visualizado, elevados valores de eficincia de encapsulao foram obtidos, mas pareceram reduzir com o aumento da proporo de TMG nas microesferas. Os valores de teor de frmaco, estimados a partir dos resultados de eficincia de encapsulao, foram submetidos anlise da varincia (ANOVA). A anlise estatstica indicou que o teor de IBF nas microesferas foi afetado pelas condies de preparao (Fcal > Fcrit, = 0,05) (Tabela 9). Para verificar onde ocorreu esta diferena, as mdias dos valores de teor de frmaco foram comparadas por meio da aplicao do teste t. Pode-se observar que nenhum dos valores referentes diferena entre as mdias foi igual ou maior que a d.m.s., 4,14. Desta forma, verifica-se que, neste caso, o teste t no foi capaz de identificar a diferena entre as mdias indicada pela ANOVA, provavelmente porque o F, embora significativo, esteja prximo da no significncia (Tabela 10). Com isso, pode-se inferir que a alterao do solvente orgnico da fase interna e a adio de lcool isoproplico na fase externa no afetaram a associao do frmaco. Alm disso, o aumento da proporo de TMG na blenda no reduziu significativamente o teor de ibuprofeno nas partculas.

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Outra observao importante a ser realizada a respeito dos valores obtidos para eficincia de encapsulao e teor de frmaco o aumento da homogeneidade das partculas, em relao a estes parmetros, quando o solvente orgnico empregado na fase interna o diclorometano.

TABELA 9: Anlise da varincia obtida a partir dos valores de teor de frmaco.

Fonte de variao Tratamento Resduo Total = 0,05 SQ 97,30 58,00 155,30 GL 9 35 44 MQ 10,81 1,66 F 6,52 Fcrtico 2,16

TABELA 10: Valores da diferena entre as mdias dos teores de IBF (mg/ 100mg microesferas) para as formulaes. Diferena entre as mdias dos teores de IBF
Clorofrmio Formulaes
P(3HB): TMG Teor

Diclorometano

9:1
14,69 1,57

4:1
16,38 -0,12 -1,69

3:1
12,48 3,78 2,21 3,90

1:1
13,31 2,95 1,38 3,07 -0,83

1:0
16,26 0 -1,57 0,12

9:1
15,46 0,80 -0,77 0,92

4:1
15,83 0,43 -1,14 0,55 -3,35 -2,52 0,43 -0,37

3:1

1:1

16,28 13,70 -0,02 -1,59 0,10 -3,80 2,56 0,99 2,68 -1,22

1:0
Clorofrmio

16,26 14,69 16,38 12,48 13,31 16,26 15,46 15,83 16,28

9:1 4:1 3:1 1:1 1:0 9:1 4:1

o

-3,78 -2,98 -2,95 -2,15 0,80

-2,97 -0,39 -0,02 -0,82 -0,45 2,56 1,76 2,13 2,58

Diclorometano

3:1

* diferena significativa, = 0,05, dms teste t=4,14

88

4.1.2 Caracterizao fsico-qumica 4.1.2.1 Avaliao da morfologia das microesferas Quando a tcnica de emulso/evaporao do solvente empregada, as caractersticas de superfcie e a porosidade das partculas resultantes tm sido correlacionadas com a cristalinidade e velocidade de precipitao do polmero. Tendo em vista que a evaporao ocorre na interface ar-gua, qualquer parmetro de formulao que altere a solubilidade do solvente na fase externa afeta a sua velocidade de remoo da fase interna. Em geral, quanto mais rpida a eliminao do solvente, mais rpida a precipitao do polmero e mais porosa a superfcie das partculas (MARTIN et al., 2000). As micrografias obtidas das microesferas preparadas a partir das blendas de P(3HB) e TMG, nas diferentes propores, e utilizando clorofrmio como solvente orgnico da fase interna, podem ser visualizadas na Figura 11. Partculas esfricas, apresentando dimetro em torno de 50 m, foram obtidas para todas as formulaes testadas. Entretanto, as micrografias claramente demonstram a reduo da porosidade e rugosidade das partculas com o aumento da proporo de TMG na blenda. Visto que outros fatores que poderiam afetar a velocidade de remoo do solvente foram mantidos constantes, as diferenas observadas na aparncia da superfcie das partculas podem ser relacionadas unicamente adio de TMG para a formao da matriz. Zanetti-Ramos e colaboradores (2006) descreveram que o aumento da viscosidade da fase interna da emulso, causado pelo uso de polmero de maior massa molar, reduziu a velocidade de difuso do solvente para a fase externa, levando formao de partculas de acetobutirato de celulose menos porosas. Portanto, com o intuito de verificar se a adio de TMG influencia a viscosidade da fase interna a ponto de alterar as caractersticas de superfcie das partculas, medidas de viscosidade cinemtica das solues de P(3HB):TMG em clorofrmio foram realizadas e os resultados podem ser visualizados na Tabela 11. Como pode ser observado, o aumento da proporo de TMG na blenda conduziu reduo da viscosidade da soluo de clorofrmio. Tendo em vista que um efeito contrrio seria esperado, a menor porosidade das partculas no pode ser explicada pelo efeito da viscosidade sobre a velocidade de eliminao do solvente.

89

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

FIGURA 11: Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo frmaco IBF preparadas com solvente clorofrmio a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes.

90

TABELA 11: Viscosidade cinemtica de solues de P(3HB) e trimiristato de glicerila em clorofrmio. Formulao P(3HB) P(3HB):TMG 9:1 P(3HB):TMG 4:1 P(3HB):TMG 3:1 P(3HB):TMG 1:1 Viscosidade cinemtica (cSt) 1,027 + 0,002 0,953 + 0,001 0,879 + 0,002 0,860 + 0,004 0,662 + 0,002

Uma estratgia que tem sido considerada por pesquisadores para alterao da velocidade de remoo do solvente consiste no uso de misturas binrias de solventes orgnicos na fase interna, um imiscvel e outro miscvel em gua como, por exemplo, clorofrmio e acetona (MURAKAMI et al., 1999; MAIA, SANTANA, R, 2004), ou ainda a adio de solventes hidromiscveis na fase externa, aps a formao da emulso (MENG et al., 2004). Considerando que a magnitude e a velocidade de transferncia do solvente da fase interna para a fase aquosa dependem da solubilidade, o clorofrmio foi substitudo pelo diclorometano e lcool isoproplico foi adicionado fase externa da emulso. A presena do lcool provocaria a remoo mais rpida do diclorometano de dentro das gotculas de emulso, formando uma ponte de afinidade entre a soluo aquosa e o solvente orgnico. Quando as micrografias das microesferas contendo IBF preparadas unicamente com P(3HB) so comparadas (Figura 11a e 13a), possvel observar que a substituio do clorofrmio pelo diclorometano provoca alteraes significativas na morfologia das partculas. A utilizao do diclorometano pareceu no somente conduzir reduo do dimetro de partcula, mas tambm levou a uma reduo considervel na rugosidade das mesmas. Este efeito sobre a morfologia de partculas, causado pela substituio do clorofrmio para o diclorometano, tambm foi observado por outros autores (GRANGADE & PRICE, 1991; MARTIN et al., 2000). Aparentemente, a alterao do solvente da fase interna da emulso altera o modo de cristalizao do polmero. Esta pode tambm ser uma possvel explicao

91

elevada homogeneidade dos valores de eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno descritos anteriormente, obtidos a partir de partculas preparadas utilizando-se o diclorometano como solvente orgnico. Por outro lado, quando o diclorometano empregado, o aumento da proporo de TMG na blenda conduziu obteno de partculas altamente porosas (Figura 12), sugerindo a formao de canais pelo ster de triglicerdeo, conforme descrito por outros autores (KUBOTA et al., 1987; URATA, ARIMORI, NAKANO, 1999; SCHAEFER, SINGH, 2000). No entanto, a presena do ibuprofeno nestas partculas parece preencher estes canais, tornando a partcula visivelmente mais compacta (Figura 13). Apesar do lcool isoproplico ter sido adicionado fase externa com a inteno de acelerar o processo de remoo do solvente orgnico, a comparao das micrografias obtidas a partir das microesferas no demonstra alteraes visveis na superfcie das partculas preparadas com e sem a adio deste lcool, indicando que a morfologia das partculas afetada principalmente pelo tipo de solvente orgnico empregado na fase interna da emulso (Figura 14).

92

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

FIGURA 12: Micrografias obtidas por MEV das microesferas brancas preparadas com solvente diclorometano a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes.

93

(a)

(b)

(c)

(d)

(d)

FIGURA 13: Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo frmaco IBF preparadas com solvente diclorometano a partir de (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, em aumento de 1000 vezes.

94

(a)

(b)

FIGURA 14: Micrografias obtidas por MEV das microesferas de P(3HB):TMG 3:1 brancas preparadas utilizando diclorometano como solvente e (a) com e (b) sem adio de lcool isoproplico na fase externa da emulso, em aumento de 1000 vezes.

95

4.1.2.2 Avaliao da morfologia dos filmes A miscibilidade uma importante caracterstica das blendas que depende da natureza dos polmeros empregados e influencia o modo de cristalizao, as propriedades fsico-qumicas, a velocidade de degradao da matriz e, por conseguinte, a forma de associao e a velocidade de liberao de frmacos a partir de sistemas matriciais (YU, DEAN, LI, 2006). Quando uma mistura de dois polmeros aparece como uma nica fase, a blenda considerada miscvel (homognea), mas caso a existncia de duas fases seja perceptvel, a blenda considerada imiscvel (heterognea). Geralmente, a existncia de ligaes de hidrognio um fator importante na promoo da miscibilidade dos materiais que constituem a blenda, afetando a morfologia e melhorando as propriedades mecnicas desta, em relao aos polmeros puros (CHEN, DONG, YU, 2006). Alm disso, mesmo quando o aditivo miscvel com o polmero semicristalino, a sua incorporao na fase cristalina do polmero dificilmente ocorre e a presena deste na fase amorfa conduz ao aumento da mobilidade das molculas, atuando como plastificante (YOSHIE et al., 2000). Assim, com o intuito de verificar a miscibilidade entre P(3HB) e TMG, filmes foram obtidos a partir do polmero puro e das blendas, em clorofrmio e diclorometano, e analisados por microscopia eletrnica de varredura. As fotomicrografias obtidas evidenciaram a imiscibilidade entre os dois materiais (Figuras 15 e 16). O filme obtido unicamente a partir do P(3HB) em clorofrmio apresentou uma estrutura compacta e rugosa (Figura 15a), enquanto que com o aumento da proporo de TMG na blenda, regies distintas de polmero e lipdeo foram observadas. Este efeito tambm foi verificado com a alterao do solvente orgnico, entretanto, filmes preparados a partir do P(3HB) puro e diclorometano apresentaram uma superfcie menos rugosa, conforme verificado nas microesferas, confirmando que o tipo de solvente empregado afeta o modo de cristalizao do polmero.

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(a)

(b)

(c)

(d)

(e) FIGURA 15: Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes obtidos a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):TMG 9:1, (c) P(3HB):TMG 4:1, (d) P(3HB):TMG 3:1 e (e) P(3HB):TMG 1:1, usando clorofrmio como solvente.

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(a)

(b) FIGURA 16: Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes preparados a partir do (a) P(3HB) e (b) P(3HB):TMG 3:1, usando diclorometano como solvente.

4.1.2.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) O grau de cristalinidade um dos mais importantes parmetros utilizados para caracterizar polmeros semicristalinos. Esta caracterstica afeta praticamente todas as propriedades do material polimrico, incluindo as propriedades mecnicas, fsicas, termodinmicas e pticas. Do ponto de vista farmacutico, as caractersticas finais das microesferas podem ser fortemente influenciadas pela cristalinidade do polmero utilizado no seu preparo, incluindo a taxa e o mecanismo de degradao, afinidade e localizao do frmaco na partcula, e velocidade e mecanismo de liberao (POUTON & AKHTAR, 1996; HUANG et al., 2006). Assim, com intuito de avaliar o efeito da formao de blendas sobre o grau de cristalinidade do polmero e verificar a presena de interaes do frmaco com a matriz polimrica, as microesferas preparadas com P(3HB) e TMG 3:1, usando diclorometano como solvente, foram analisadas por calorimetria exploratria diferencial. As curvas de DSC obtidas para o ibuprofeno, P(3HB) e trimiristato de glicerila, assim como para a mistura fsica dos componentes e para as microesferas brancas e com frmaco, encontram-se demonstradas na Figura 17.

98

(a) (b)

(c) (d)

Endo

(e) (f)

(g)

(h)

Temperatura oC

FIGURA 17: Termogramas obtidos por DSC aps anlise do (a) IBF, (b) P(3HB), (c) TMG, (d) Microesferas P(3HB) brancas, (e) Microesferas P(3HB) com IBF, (f) Mistura fsica de P(3HB), TMG e IBF, (g) Microesferas P(3HB):TMG 3:1 brancas e (h) Microesferas P(3HB): TMG 3:1 com IBF.

99

P(3HB), IBF e TMG apresentaram eventos endotrmicos correspondentes fuso em 175 oC, 77 oC e 58 oC, respectivamente, estando de acordo com aqueles descritos na literatura (POUTON & AKHTAR, 1996; WILLIANS et al., 2005). Para o P(3HB), um segundo pico de fuso a 165
o

C foi observado, decorrente,

provavelmente, de um processo de fuso/recristalizao ocorrido durante a anlise de DSC (YOSHIE et al., 2000). Nas microesferas brancas obtidas a partir do P(3HB) puro e da blenda P(3HB):TMG, temperaturas de fuso semelhantes as dos componentes puros foram obtidas para ambos polmero e lipdeo (Figura 17d e 17g). Entretanto, uma pequena reduo na tempertura de fuso do P(3HB) foi observada com a presena do frmaco, tanto na mistura fsica como nas microesferas (Figura 17e, 17f e 17h). A existncia de interaes entre IBF e a matriz polimrica no pode ser inteiramente descartada. No entanto, neste caso, como o deslocamento da temperatura de fuso do P(3HB) tambm observado na mistura fsica, deve-se considerar a possibilidade de uma interferncia momentnea do IBF fundido no processo de fuso do P(3HB). Por outro lado, o evento endotrmico correspondente fuso do lipdeo no parece ter sido alterado nestas mesmas amostras. A tcnica de DSC pode ser usada para avaliar o grau de cristalinidade relativo (Xc%) dos materiais, uma vez que uma mudana da mesma caracterizada pela reduo da entalpia de fuso (Hexp), em relao ao composto puro (Hpuro), Assim, o grau de cristalinidade pde ser estimado por meio da equao demonstrada abaixo, adaptada de El-Taweel e colaboradores, onde f corresponde a frao do frmaco ou polmero que constitui a microesfera (2004):

Xc(%) =

H exp H teor f

A entalpia de fuso (H) referente ao P(3HB) 100% cristalino de 146 J/g (EL-TAWEEL et al., 2004). Para o IBF, admitiu-se que o frmaco puro encontrava-se em uma forma completamente cristalina, exibindo (H) igual a 131,93 J/g. Os valores de temperatura e entalpia de fuso (Hexp) e o grau de cristalinidade (Xc%) encontrados para o P(3HB) e o IBF, nas diferentes amostras analisadas, podem ser visualizados na Tabela 12. Com base nos resultados obtidos, verifica-se que a

100

tcnica de emulso evaporao do solvente no afeta o grau de cristalinidade do P(3HB), o qual pode ser considerado elevado nas microesferas brancas preparadas unicamente com o polmero. Entretanto, a presena de TMG nas partculas pareceu diminuir a cristalinidade do P(3HB). Esta reduo da cristalinidade no pde ser observada quando as microesferas contendo IBF foram analisadas. Adicionalmente, os resultados obtidos mostram a significativa reduo da cristalinidade do ibuprofeno nas microesferas de P(3HB) e, sobretudo, nas de P(3HB):TMG 3:1, indicando que grande parte do frmaco encontra-se no estado amorfo ou associado s partculas na sua forma molecular.

TABELA 12: Resultados da anlise por calorimetria exploratria diferencial.

Polmero Formulaes
Tg( C) Tm(C )
o o

IBF
Tm(C )
o

Matriaprima

IBF P(3HB) P(3HB) + TMG + IBF

-5 1

175 166

77 76

131,93 50,65

107,12 73,37 134,97 -

Mistura fsica

Microesferas brancas

P(3HB) P(3HB):TMG 3:1

3 -2

174 172

102,8 73,8

70,41 50,55

Microesferas com IBF

P(3HB) P(3HB):TMG 3:1

2 11

162 162

93,7 128,7

64,18 88,15

75 75

4.1.3 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas O perfil de liberao do IBF a partir das microesferas foi avaliado aps determinao da concentrao do frmaco no meio de liberao por espectrofotometria de absoro no ultravioleta. Para isto se fez necessrio a

Hexp Xc(%) (J/g)

Hexp (J/g)

Xc(%)

100 -

77,79 3,99

58,96 3,02

101

construo de uma curva de calibrao de ibuprofeno em tampo fosfato 0,02 M pH 7,4, na faixa de concentrao entre 10 e 1000 g/mL. O grfico de concentrao de IBF versus absorbncia, assim como a equao da reta e o coeficiente de correlao, obtidos aps anlise da regresso linear, encontram-se demonstrados na Figura 18. Na faixa de concentrao testada, o mtodo usado demonstrou um comportamento linear significativo. A ausncia de erro sistemtico constante tambm foi verificada, uma vez que os valores do intervalo de confiana do intercepto incluram o valor zero (Tabela 13).

FIGURA 18: Curva de calibrao do ibuprofeno em tampo fosfato 0,02M pH 7,4, obtida por espectrometria de absoro no ultravioleta.

TABELA 13: Anlise dos dados da regresso obtidos a partir da curva de calibrao do ibuprofeno por espectrofotometria de absoro no ultravioleta. Parmetros de regresso Intercepto (intervalo de confiana) Inclinao (intervalo de confiana) R2 Valores 0,0093 (-0,00244 a 0,02104) 0,0018 (0,00176 a 0,00184) 0,9994

102

O processo de transferncia de frmacos pode tanto ocorrer a partir das microesferas em direo fase contnua, como no sentido contrrio, se a concentrao no meio de liberao for suficientemente alta. Nestas condies, o equilbrio natural do fenmeno de difuso ser atingido e, para evit-lo, o emprego de condies sink torna-se desejvel. Tem-se preconizado que a concentrao mxima do frmaco no deva exceder 20% da sua concentrao na saturao para a obteno destas condies. Assim, para garantir que o ensaio de liberao fosse realizado em condies sink, a solubilidade do ibuprofeno em tampo fosfato 0,02M a pH 7,4 foi determinada, conforme descrito em 3.2.1.4.2, e foi igual a 3,667 + 0,226 mg/mL. A partir deste resultado, a quantidade de 100 mg de microesferas para 20 mL de meio de liberao foi estipulada. As coletas do meio de liberao foram realizadas durante sete dias, em tempos pr-determinados, conforme citado em 3.2.1.4.3. Contudo, devido ausncia de alteraes no percentual de frmaco liberado, os perfis de liberao foram demonstrados somente at 24 horas de ensaio (Figura 19). Como pode ser observado, o efeito de liberao inicial do IBF, conhecido como efeito burst, foi elevado em todas as formulaes testadas. Cerca de 80% do frmaco encapsulado foi liberado a partir das microesferas de P(3HB) em apenas uma hora de ensaio, independente do solvente empregado na fase interna da emulso. Os valores obtidos na primeira hora de ensaio, a partir das microesferas preparadas com blendas de P(3HB) e TMG, no foram muito diferentes, variando entre 74 e 86%. As elevadas taxas de liberao de frmacos a partir de microesferas preparadas com polmeros cristalinos so bastante descritas na literatura. Assim como ocorre com o poli-(L-cido ltico), a cristalizao do polmero pode conduzir formao de espaos vazios nas partculas, que passam a funcionar como canais para penetrao da gua, facilitando a liberao (URATA, ARIMORI, NAKANO, 1999; GUSE, 2006). Ao contrrio do que se esperava, a reduo na porosidade e da cristalinidade das partculas pela adio de trimiristato de glicerila, conforme observado nas micrografias obtidas por MEV e nos resultados de DSC, no afetou a cintica de liberao. Este fato pode estar relacionado com a localizao preferencial do frmaco na superfcie ou nas proximidades da superfcie das microesferas, sendo liberado principalmente por um processo de dessoro. Alm disso, taxas elevadas de liberao tm sido descritas quando steres de cidos

103

graxos so empregados no preparo de microesferas, em blendas com PLA, PLAGA ou P(3HB) (JUNI et al., 1985; KUBOTA et al., 1987; URATA, ARIMORI, NAKANO, 1999; SCHAEFER, SINGH, 2000). Aps 7 dias de ensaio, as microesferas mantiveram sua estrutura esfrica e nenhum sinal de eroso da matriz foi visualizado (Figura 20). Portanto, a adio de TMG para a obteno das microesferas no permitiu o controle da liberao do IBF.

(a)

(b)

FIGURA 19: Perfis de liberao obtidos a partir das microesferas preparadas usando (a) clorofrmio e (b) diclorometano como solvente da fase interna. ( ) P(3HB) puro, ( ) P(3HB):TMG 9:1, ( ) P(3HB):TMG 4:1, ( ) P(3HB):TMG 3:1 e (X) P(3HB):TMG 1:1

104

(a)

(b)

(C)

FIGURA 20: Micrografias obtidas por MEV das microesferas obtidas a partir de (a) P(3HB) e (b) P(3HB):TMG 3:1 em clorofrmio e (c) P(3HB):TMG 3:1 em diclorometano, aps sete dias do incio do ensaio de liberao.

105

PARTE II Efeito da adio de poli-(D,L-cido lctico)-b-poli(etilenoglicol) (PLAPEG) e gelatina (GEL) sobre as propriedades fsico-qumicas e sobre o perfil de liberao do ibuprofeno a partir de microesferas de poli-(3-hidroxibutirato) 4.2 Preparao e caracterizao das microesferas a partir de blendas de P(3HB) e PLA-PEG Com o intuito de obter formulaes de microesferas que permitissem o controle da liberao do IBF, duas estratgias foram testadas. A primeira consistiu em formar blendas de P(3HB) e PLA-PEG e a segunda em formar uma partcula composta P(3HB) e gelatina (GEL), onde o frmaco pudesse se difundir de forma controlada. O poli-(D,L-cido ltico)-b-poli (etilenoglicol) (PLA-PEG) (Figura 21) um polmero obtido pela modificao qumica do PLA com poli(etilenoglicol). Esta modificao resulta na obteno de um copolmero anfiflico, o qual mais susceptvel degradao por hidrlise, sofre menor adsoro por protenas, clulas, e/ou tecidos sendo, portanto, menos propcio a desencadear reaes adversas. Alm disso, este copolmero tambm apresenta propriedade auto-associativa em meio aquoso, ou seja, formao de suspenses coloidais termodinamicamente metaestveis (DRUMOND, WANG, MOTH, 2004). Poucos trabalhos relatam a obteno de blendas de P(3HB) e PLA-PEG e em nenhum deles descreve a liberao de frmacos a partir de matrizes constitudas por estes materiais. Por outro lado, a gelatina um polmero natural derivado do colgeno, tambm bastante utilizado em aplicaes mdicas/farmacuticas por ser biodegradvel e biocompatvel em meio fisiolgico. Oferece importante segurana tanto como expansor plasmtico, quanto como componente de formulaes farmacuticas ou prteses vasculares (YOUNG et al., 2005). As microesferas de P(3HB), assim como aquelas constitudas de blendas de P(3HB) e PLA-PEG foram preparadas pela tcnica de emulso simples, seguida da evaporao do solvente, tendo em vista que ambos polmeros so solveis em diclorometano. No entanto, as microesferas contendo gelatina, as quais podem ser denominadas de partculas compostas, foram obtidas pelo procedimento de dupla emulso, onde uma disperso aquosa de gelatina contendo IBF constituiu a fase interna da emulso primria a/o. Este mtodo de preparo tem demonstrado ser adequado para encapsular frmacos hidrossolveis, tais como peptdeos e protenas

106

(JAIN, 2000). Como o IBF praticamente insolvel em gua, o pH da disperso aquosa de gelatina foi ajustado a 6,5 com o intuito de aumentar a solubilidade do frmaco (GOSH et al., 1998). Alm disso, em uma das formulaes foi adicionado lcool etlico na fase aquosa da emulso primria visando tambm aumentar a solubilidade do ibuprofeno, e conseqentemente, a eficincia de encapsulao.

FIGURA 21: Estrutura qumica do PLA-PEG. n= unidades de etileno glicol, m= unidades de cido ltico (LU, LI, WANG, 2008).

4.2.1 Determinao da eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno nas microesferas Os resultados obtidos para eficincia de encapsulao e teor de frmaco nas microesferas esto demonstrados na Tabela 14. A anlise da varincia indicou que o teor de IBF variou significativamente nas formulaes testadas (Fcal > Fcrit, = 0,05) (Tabela 15). Para verificar onde ocorreu esta diferena, as mdias dos valores de teor de frmaco foram comparadas por meio da aplicao do teste t. Neste caso, a diferena entre os valores mdios de teor de frmaco considerada significativa quando este valor for maior que 0,972 (Tabela 16). Assim, como pode ser observado, o teor de ibuprofeno foi significativamente reduzido nas microesferas compostas P(3HB):GEL, em relao quelas preparadas com P(3HB) puro. Neste caso, a menor quantidade de ibuprofeno encapsulada pode ter sido decorrente do mtodo de preparao escolhido. Como o frmaco pouco solvel em meio aquoso, este permanece disperso na soluo de gelatina, e tende a se deslocar para fora das gotculas em direo fase orgnica, durante a formao da primeira emulso. Por outro lado, a formao de uma blenda de P(3HB):PLA-PEG 3:1 no afetou o teor de frmaco, mas uma reduo significativa foi observada quando a blenda P(3HB):PLA-PEG 1:1 foi testada.

107

TABELA 14: Valores eficincia de encapsulao e de teor de ibuprofeno nas microesferas. Formulao E.E. + d.p. (%) Teor de frmaco + d. p. (mg IBF/100mg micros) 16,26 + 0,04 15,49 + 0,14 14,95 + 0,17 12,35 + 0,44 13,24 + 0,46

P(3HB) P(3HB): PLA-PEG 3:1 P(3HB):PLA-PEG 1:1 P(3HB): gelatina 10:1 P(3HB):gelatina 10:1 etanol

81,22 + 0,33 77,46 + 0,72 74,75 + 0,41 66,73 + 2,37 71,55 + 2,50

TABELA 15: Anlise da varincia obtida a partir dos valores de teor de frmaco.
Fonte de variao Tratamento Resduo Total *GL= 4,13; = 0,05 SQ 40,16 1,66 41,83 GL 4 13 MQ 10,04 0,13 F 78,52 Fcrtico 3,18

108

TABELA 16: Valores da diferena entre as mdias dos teores de IBF (mg/ 100 mg microesferas) obtidas para as formulaes.
Diferena entre as mdias dos teores Formulaes P(3HB):GEL P(3HB)GEL 10:1 (etanol) 10:1 12,35 P(3HB) P(3HB):GEL 10:1 P(3HB):GEL10:1 et. PLA:PEG 3:1 16,26 12,35 13,24 15,49 3,91* 13,24 3,02* -0,89 PLA:PEG 3:1 15,49 0,77 -3,14* -2,25* PLA:PEG 1:1 14,95 1,31* -2,60* -1,71* 0,54

* diferena significativa, = 0,05, dms teste t=0,972

4.2.2 Caracterizao fsico-qumica 4.2.2.1 Avaliao da morfologia das partculas Nas Figuras 22 e 23 encontram-se demonstradas, respectivamente, as microesferas brancas e contendo IBF, obtidas a partir do P(3HB), P(3HB):PLA-PEG e P(3HB):GEL. Conforme pode ser observado, partculas esfricas apresentando alguns poros pequenos foram obtidas para todas as formulaes testadas. Entretanto, partculas mais rugosas foram obtidas quando blendas de P(3HB) e PLAPEG foram empregadas. O elevado grau de hidratao das cadeias de PEG no copolmero tem sido usado para explicar esta caracterstica. Aparentemente, a grande interao entre o PLA-PEG e o meio aquoso durante a emulsificao, favorece a m formao das partculas (HUANG, CHUNG, 2001). Por outro lado, a presena do IBF nas microesferas parece reduzir este efeito, formando partculas com superfcie mais lisa, mas igualmente porosa.

109

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

FIGURA 22: Micrografias obtidas por MEV das microesferas brancas preparadas a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):PLA-PEG 3:1, (c) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (d) P(3HB):gelatina, (e) P(3HB):gelatina (etanol).

110

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

FIGURA 23: Micrografias obtidas por MEV das microesferas contendo IBF preparadas a partir do (a) P(3HB), (b) P(3HB):PLA-PEG 3:1, (c) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (d) P(3HB):gelatina e (e) P(3HB):gelatina (etanol).

111

4.2.2.2 Avaliao da morfologia de filmes de P(3HB) e de blendas Para a verificao da miscibilidade entre o P(3HB) e o PLA-PEG, filmes do polmero puro e da blenda foram preparados conforme descrito em 3.2.2.1 e visualizados por MEV. A visualizao das fotomicrografias obtidas da superfcie e fratura dos filmes (Figura 24) indicou a formao de uma estrutura compacta e homognea. A utilizao do PLA-PEG como compatibilizador em blendas de PLA e P(3HB) tem sido descrita. Estudos de anlise trmica tm demonstrado apenas uma Tg para estas blendas, maior que a Tg encontrada para o P(3HB) puro, e a reduo desta Tg com o aumento da proporo de PEG no copolmero, sugerindo que as cadeias de PEG penetram na regio amorfa do P(3HB) (YOON et al., 2000).

FIGURA 24: Micrografias obtidas por MEV da superfcie e da fratura de filmes de P(3HB):PLA-PEG 3:1.

4.2.2.3 Anlise por calorimetria exploratria diferencial (DSC) Os termogramas obtidos a partir das matrias-primas puras, misturas fsicas e microesferas brancas e contendo IBF esto apresentados nas Figuras 25 e 26. Os valores de temperatura e entalpia de fuso (Hexp) e o grau de cristalinidade (Xc%) encontrados para o P(3HB) e o IBF, nas diferentes amostras analisadas, so demonstrados nas Tabelas 17 e 18. Conforme pode ser visualizado, P(3HB) e IBF apresentaram eventos endotrmicos correspondentes fuso destes materiais em 175
o

C e 77

C,

respectivamente, sendo que o P(3HB) apresentou um segundo pico de fuso em 165oC, conforme descrito anteriormente. O PLA-PEG, um polmero em bloco de

112

caracterstica amorfa, mostrou uma transio vtrea na temperatura de 20 oC e um evento endotrmico a 40 oC, referente fuso do bloco PEG (Figura 25c).

(a) (b)

(c) (d)
Endo

(e)

(f)

(g)

(h)

Temperatura oC

FIGURA 25: Termogramas obtidos por DSC para (a) IBF, (b) P(3HB), (c) PLA-PEG, (d) Mistura fsica de P(3HB), PLA-PEG e IBF, (e) Microesferas P(3HB) brancas, (f) Microesferas P(3HB):PLA-PEG 3:1 brancas , (g) Microesferas P(3HB) com IBF, (h) Microesferas P(3HB): PLA-PEG 3:1 com IBF.

113

Quando as microesferas brancas obtidas a partir do P(3HB) e da blenda P(3HB):PLA-PEG 3:1 foram analisadas (Figura 25e e 25f), o evento trmico referente fuso do P(3HB) ocorreu em valores prximos a do polmero puro. Entretanto, uma pequena reduo na tempertura de fuso do P(3HB) foi observada com a presena do frmaco, tanto na mistura fsica como nas microesferas, evidenciando uma possvel interferncia do IBF fundido no processo de fuso do P(3HB), de modo semelhante ao ocorrido quando o TMG foi usado para a obteno da blenda (Figura 25d, 25g e 25h).

TABELA 17: Resultados obtidos por anlise de calorimetria exploratria diferencial das microesferas e das matrias primas utilizadas.
P(3HB) Formulaes
o o o

IBF

Matriaprima

IBF P(3HB)

-5

175

107,1

73,37

77 -

Mistura fsica

P(3HB )+PLAPEG+IBF P(3HB) P(3HB):PLA-PEG 3:1

-7

164

121,8

76

Microesferas brancas

3 -6

174 173

102,8 101,2

70,41 69,32

Microesferas com IBF

P(3HB) P(3HB):PLA-PEG 3:1

2 -1

162 163

93,70 107,5

64,18 73,63

75 73

Como pode ser verificado na Tabela 17, tanto a adio de PLA-PEG, para a formao da blenda, como a presena de ibuprofeno no provocou reduo significativa da cristalinidade do P(3HB). Entretanto, o grau de cristalinidade do frmaco foi reduzido durante o processo de microencapsulao, indicando que o IBF encontra-se apenas parcialmente disperso na sua forma cristalina.

Tg( C) Tm(C )

Hexp Xc(%) (J/g)

Tm(C )

Hexp (J/g)

Xc(%)

131,93 -

100 -

79,50

77,79 42,64

58,96 32,32

114

Devido ao possvel efeito plastificante causado pela umidade excessiva da gelatina, duas varreduras foram necessrias nas anlises de DSC para as microesferas compostas de P(3HB) e GEL (PORTO, 2007). Na segunda varredura da GEL pura, o evento correspondente a transio vtrea foi verificado em 209o C (FIGURA 26c), no entanto, a anlise da mistura fsica e das microesferas no revelou esta Tg. TABELA 18: Resultados obtidos por anlise de calorimetria exploratria diferencial das microesferas e das matrias primas utilizadas.
Polmero Formulaes
o o o

IBF

Matriaprima

IBF P(3HB)

-5 -8

175 170

107,1 133,2

73,37 -

77 76

131,93 46,49

Mistura fsica

PHB +gelatina +IBF

Microesferas brancas

P(3HB) P(3HB):gelatina 10:1

3 -

174 175

102,8 106,0

70,41 72,60

Microesferas com IBF

P(3HB) P(3HB):gelatina 10:1

2 -

162 162

93,7 97,9

64,18 67,05

75 76

Martin e colaboradores (2000) verificaram maiores valores de temperatura de fuso do P(3HB) nas microesferas obtidas pelo mtodo de emulso o/a seguido da evaporao do solvente, quando comparado com aquelas obtidas pelo mtodo de dupla emulso. No entanto, este resultado no foi observado nestes experimentos, visto que as partculas brancas demonstraram valores semelhantes aqueles obtidos para as matrias-primas (Figura 26b e 26e). De modo semelhante ao ocorrido nas microesferas preparadas a partir da blenda de P(3HB):PLA-PEG, o

Tg( C) Tm(C )

Hexp Xc(%) (J/g)

Tm(C )

Hexp (J/g)

Xc(%)

100 -

77,79 76,36

58,96 57,88

115

ibuprofeno encontra-se apenas parcialmente disperso em sua forma cristalina nas microesferas compostas de P(3HB) e GEL (Tabela 18).
(a)

(b)

(c)
Endo

(d)

(e)

(f)

Temperatura oC

FIGURA 26: Termogramas obtidos por DSC para (a) IBF, (b) P(3HB), (c) Gelatina; (d) Mistura fsica de P(3HB), gelatina e IBF, (e) Microesferas P(3HB):gelatina 10:1 brancas e (f) Microesferas P(3HB): gelatina 10:1 com IBF.

4.2.2.4 Difrao de Raios-X A difrao de raios-x uma tcnica complementar calorimetria exploratria diferencial e permite avaliar as caractersticas de cristalinidade dos materiais que podem afetar a velocidade de liberao do frmaco e de degradao das microesferas. Os difratogramas obtidos para os componentes puros, e

116

microesferas brancas e contendo IBF encontram-se demonstrados nas figuras 27, 28 e 29. Os valores das intensidades dos picos (%) referentes ao IBF e P(3HB), nas diferentes formulaes, encontram-se dispostos na Tabela 19.

(a)
0,0
Intensidade

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

(b)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(c)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

(d)

FIGURA 27: Difratogramas obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) microesferas de P(3HB) brancas e (d) microesferas de P(3HB) contendo IBF.

117

(a)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(b)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(c)
0,0
Intensidade

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

(d)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(e)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(f )
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(g)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

2 FIGURA 28: Espectros obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) PLAPEG, (d) microesferas P(3HB):PLA-PEG 3:1 brancas, (e) microesferas P(3HB):PLAPEG 1:1 brancas, (f) microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 com IBF e (g) microesferas P(3HB):PLA-PEG 1:1 com IBF.

118

O difratograma obtido aps anlise do IBF tpico de uma estrutura cristalina (FERNANDEZ-CARBALLIDO, 2004). Este difratograma apresenta picos de difrao caractersticos do ibuprofeno em 2 igual a 6,18o, 12,26, 16,68o, 20,14 e 22,40o (NOVOA et al., 2005) (Figuras 27a, 28a e 29a). Picos de elevada difrao podem ser observados nos difratogramas obtidos a partir do P(3HB) puro em 2 de 13,48o, 16,88o, 21,72o, 21,84, 22,64o e 25,64o, caracterizando a estrutura semicristalina do polmero, segundo descrito por Galego e colaboradores (2000) (Figuras 27b, 28b e 29b). A natureza amorfa do PLA-PEG pode ser visualizada no difratograma obtido a partir deste polmero (Figura 28 c).

(a)
Intensidade
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(b)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(c)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

(d)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

2 FIGURA 29: Difratogramas obtidos aps anlise do (a) ibuprofeno, (b) P(3HB), (c) microesferas P(3HB): gelatina 10:1 brancas e (d) microesferas de P(3HB):gelatina 10:1 com IBF.

119

O modelo de difrao de raios-x do P(3HB) foi observado nos difratogramas obtidos a partir das microesferas preparadas a partir do P(3HB) puro, da blenda de P(3HB) e PLA-PEG e das microesferas compostas P(3HB) e GEL. Entretanto, a intensidade dos picos de difrao do P(3HB) pareceu bastante reduzida no difratograma obtidos a partir das microesferas de P(3HB):PLA-PEG 1:1, indicando uma possvel reduo da cristalinidade da matriz. A reduo dos picos de difrao do IBF tambm foi visualizada em todos os difratogramas obtidos a partir das microesferas contendo frmaco (Figura 27d, 28f, 28g, 29d). Este resultado est de acordo com aqueles verificados na analise calorimtrica, confirmando que apenas uma frao do IBF encontra-se cristalizada nas partculas.

TABELA 19: Intensidade dos picos de difrao de raios-X obtidos a partir dos difratogramas do frmaco, P(3HB), PLA-PEG e microesferas brancas e contendo IBF.
INTENSIDADE (%)
P(3HB): P(3HB): 3:1mf P(3HB): 1:1m P(3HB): 1:1mf P(3HB): Gelm P(3HB): Gelmf

2
6,18 12,26 13,48 16,68 16,88 20,14 21,72 21,84 22,40 25,38

IBF

P(3HB)

P(3HB)m

P(3HB)mf

PLA-PEG PLA-PEG PLA-PEG PLA-PEG 3:1m

100,00 30,52 35,32 14,46 37,18 -

100,00 82,38 46,34 44,72 37,40

100,00 78,79 45,33 47,66 38,72

30,75 17,85 100,00 59,14 92,90 47,10 48,39 55,05 62,80 40,86

100,00 87,98 47,31 51,15 42,20

35,54 17,02 100,00 84,63 82,81 30,58 40,99 42,15 39,01 35,54

100,00 91,77 51,00 46,79 40,96

100,00 33,76 57,96 36,94 57,32 43,63 41,40 39,49 60,51 34,71

100,00 78,12 49,28 52,40 42,54

29,58 15,84 100,00 56,34 81,34 57,39 53,52 50,00 58,45 67,93

(-) no detectado

120

4.2.3 Determinao do dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas Quando a tcnica de emulso/evaporao do solvente empregada, a granulometria das partculas resultante de uma complexa contribuio de diferentes fatores, como tipo e proporo do solvente orgnico da fase interna, concentrao de polmero, tipo e concentrao do estabilizante da emulso, temperatura, velocidade de agitao, entre outros. Trata-se de um parmetro importante na caracterizao destes sistemas, pois afeta grandemente a velocidade de liberao dos frmacos encapsulados. Supondo uma distribuio homognea do frmaco no interior das partculas, espera-se que quanto maior o dimetro, mais lenta seja a velocidade de liberao (FREIBERG & ZHU, 2004). Alm disso, o dimetro da partcula condicionado ao modo de administrao. Quando a via parenteral almejada, a obteno de partculas com at 100 m requerida, para evitar inconvenientes como o entupimento da agulha para injeo (VILA-JATO, 1997). O dimetro mdio e a distribuio granulomtrica das diferentes formulaes podem ser visualizados na Tabela 20 e Figura 30. Aparentemente, a tcnica de dupla emulso, utilizada para a obteno de partculas compostas de P(3HB):GEL, levou obteno de partculas de maior dimetro. A pequena reduo do tamanho demonstrada por P(3HB): gelatina 10:1 (etanol) pode ser atribuda presena do lcool etlico durante o processo de preparo, considerando que demais condies foram mantidas constantes. Alm disso, as microesferas preparadas a partir do P(3HB) e GEL 10:1 exibiram maior polidispersidade. As microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 exibiram dimetro mdio e distribuio granulomtrica semelhante s obtidas unicamente a partir do P(3HB). Entretanto, o aumento da proporo de PLA-PEG nas microesferas conduziu ao aumento do dimetro mdio das partculas. Este efeito pode estar relacionado com a interao do PLA-PEG com a fase aquosa durante o processo de evaporao do solvente.

121

TABELA 20: Resultados obtidos por difrao a laser para dimetro mdio e distribuio granulomtrica das microesferas.
Formulao Dimetro 10% (m) Dimetro 50% (m) Dimetro 90% (m) Dimetro mdio (m)

P(3HB) P(3HB): GEL 10:1 P(3HB):GEL 10:1 (etanol) P(3HB): PLA-PEG 3:1 P(3HB):PLA-PEG 1:1

11,70 20,18 18,67 12,26 18,12

22,43 51,91 37,53 23,81 37,17

31,71 98,84 71,55 32,62 68,51

21,93 56,17 41,55 23,12 40,39

FIGURA 30: Histograma da distribuio granulomtrica das microesferas obtidas a partir de ( ) P(3HB), ( ) P(3HB):gelatina 10:1, ( ) P(3HB):gelatina 10:1 (etanol), ( ) P(3HB):PLA-PEG 3:1 e ( ) P(3HB):PLA-PEG 1:1.

4.2.4 Avaliao do perfil de liberao do IBF a partir das microesferas Os perfis de liberao do ibuprofeno a partir das microesferas, obtidos pelo mtodo da dilise, podem ser visualizados na Figura 29. Ao contrrio do que ocorre com as formulaes de liberao controlada destinadas administrao oral, no existem tcnicas de liberao in vitro regulamentadas para sistemas microparticulados que visam administrao parenteral. Entretanto, o mtodo da

122

dilise atrativo quando a forma farmacutica em questo constituir um depsito de frmaco restrito ao local de administrao, como ocorre nas administraes intramuscular, subcutnea e intra-articular (DSOUZA, DELUCA, 2006) sendo, portanto, utilizado na segunda parte deste trabalho. Contudo, diferenas foram encontradas nos perfis de liberao do IBF a partir das microesferas de P(3HB) puro, quando os mtodos do banho e da dilise foram empregados, decorrentes provavelmente de parmetros como volume do meio e tipo e velocidade de agitao. O pequeno volume utilizado no banho difcil de ser mantido exato, devido s diversas coletas e reposies que so realizadas, mas apresenta como vantagem a agitao mecnica horizontal que permite a ressuspenso das microesferas. Na dilise, alm do maior volume envolvido, as partculas ficam separadas do meio por uma membrana, facilitando as coletas. No entanto, possui como desvantagem o lento equilbrio da concentrao de frmaco entre membrana e meio, devido pequena rea de superfcie da mesma. Isto pode limitar a anlise precisa dos percentuais iniciais de liberao a partir de formulaes que possuam alto efeito burst (DSOUZA, DELUCA, 2006). Neste contexto, algumas concluses foram obtidas ao comparar os perfis de liberao das diferentes formulaes testadas. Para verificar o efeito da membrana de dilise sobre a velocidade de liberao do IBF, o frmaco puro foi testado nas mesmas condies. Conforme pode ser observado (Figura 31), o percentual de ibuprofeno liberado a partir das microesferas preparadas unicamente com o P(3HB), aps 1 hora de ensaio, foi cerca de 21,63%. Para as partculas compostas de P(3HB):gelatina 10:1, sem e com a adio de etanol na fase interna, 17,66% e 25,89% de ibuprofeno foram liberados na primeira hora de ensaio e para as microesferas preparadas a partir das blendas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 e 1:1, a liberao foi de 28,89% e 9,64%, respectivamente. No mesmo perodo, 29% do IBF puro atravessaram a membrana. A liberao total do frmaco ocorreu aps 33, 96, 24, 168 e 120 horas de ensaio a partir das microesferas de P(3HB), P(3HB):GEL 10:1, P(3HB):GEL 10:1 (etanol), P(3HB):PLA-PEG 3:1 e P(3HB):PLA-PEG 1:1, respectivamente. A completa difuso do IBF atravs da membrana para o meio de liberao transcorreu em 8 horas de ensaio. A comparao estatstica dos perfis de liberao foi realizada pela ANOVA, empregando-se como varivel o percentual de frmaco liberado aps 1

123

hora (efeito burst) e a rea sob a curva (ASC) obtida aps 96 horas de ensaio. A comparao entre os percentuais mdios de liberao aps 1 hora, assim como para as ASC mdias, foi realizada mediante aplicao do teste t.

(a)

(b)

FIGURA 31: Perfis de liberao obtidos a partir de microesferas ( ) P(3HB) puro , ( ) P(3HB):gelatina 10:1, ( ) P(3HB):gelatina 10:1 (etanol), ( X ) P(3HB):PLA-PEG 3:1, ( X ) P(3HB):PLA-PEG 1:1e ( horas de ensaio.

) ibuprofeno livre, aps (a) 168 horas e (b) 24

TABELA 21: Anlise da varincia referente aos valores de percentagem obtidos na primeira hora de ensaio de liberao.
Fonte de variao Tratamento Resduo Total GL=5,10; = 0,05 SQ 671,65 79,41 751,06 GL 5 10 MQ 134,33 7,94 F 16,92 Fcrtico* 3,33

A anlise da varincia realizada a partir dos percentuais de liberao do IBF na primeira hora de ensaio demonstrou que o efeito burst variou significativamente em funo da formulao testada (Fcal> Ftab, =0,05) (Tabela

124

21). Entretanto, unicamente a utilizao da blenda de P(3HB):PLA-PEG 1:1 conduziu reduo significativa do efeito burst, quando comparado com a liberao obtida partir das microesferas de P(3HB) puro (Tabela 22) .

TABELA 22: Valores de diferena entre as mdias do percentual de IBF liberado aps uma hora.
Diferena entre as mdias
Formulaes P(3HB):GEL 10:1 17,66 21,63 17,66 25,89 3,97 P(3HB)GEL 10:1 (etanol) 25,89 -4,26 -8,23 PLA:PEG 3:1 28,89 -7,26 -11,23* -3,00 PLA:PEG 1:1 9,64 11,99* 8,02 16,25* IBF 29,01 -7,38 -11,35* -3,12

P(3HB) P(3HB):GEL 10:1 P(3HB):GEL10:1 (etanol)

P(3HB):PLA:PEG 3:1 28,89 P(3HB):PLA:PEG 1:1 9,64

19,25*

-0,12 -19,37*

* diferena significativa, = 0,05, dms teste t=9,60

A anlise da varincia realizada a partir dos valores de rea sob a curva indicou que a velocidade de liberao do IBF a partir das microesferas varia significativamente em funo da formulao testada (Fcal> Ftab, =0,05) (Tabela 23). Quando as reas sob as curvas mdias foram comparadas, verificou-se que a velocidade de liberao do IBF a partir das microesferas compostas de P(3HB):GEL no diferiu significativamente daquela obtida a partir das microesferas de P(3HB) puro (Tabela 24), apesar da adio de etanol ter causado um aumento na velocidade de liberao do frmaco. A maior velocidade de liberao demonstrada pela formulao P(3HB):GEL 10:1, preparada com adio de etanol, pode ser decorrente da localizao mais externa do frmaco, causada pelo seu arraste para a interface da emulso. Por outro lado, a formao de blendas de P(3HB) e PLA-PEG conduziu reduo significativa da velocidade de liberao do IBF, quando comparada com a

125

liberao do IBF a partir das microesferas de P(3HB) puro. Esta reduo foi dependente da proporo de PLA-PEG na blenda. A compatibilidade existente entre os polmeros, levando formao de uma matriz polimrica homognea e com estrutura mais amorfa, pode justificar o maior controle da liberao com o uso do PLA-PEG. Todavia, a elevada interao existente entre o copolmero e a fase aquosa da emulso tem levado formao de canais durante o processo de emulso/evaporao do solvente (HUANG, CHUNG, TZENG, 1999; HUANG, CHUNG, 2001). Este dado pode ser usado para explicar o aumento da velocidade de liberao do IBF com o aumento da proporo de PLA-PEG na blenda.

TABELA 23: Anlise da varincia obtida a partir dos valores de AUC dos perfis de liberao, obtidas aps 96 horas de ensaio.
Fonte de variao Tratamento Resduo Total = 0,05 SQ 15925904 600506,6 16526411 GL 4 8 12 MQ 3981476 75063,33 F 53,04 Fcrtico 3,84

TABELA 24: Valores da diferena entre as mdias das reas sob as curvas dos perfis obtidos aps 96 horas.
Diferena entre as AUCs mdias Formulaes P(3HB):GEL P(3HB)GEL 10:1 10:1 (etanol) 8263,24 9661,56 9060,77 8263,24 9661,56 6424,05 797,53 -600,79 -1398,32* PLA:PEG 3:1 6424,05 2636,72* 1839,19* 3237,51* PLA:PEG 1:1 7591,26 1469,51* 671,98 2070,3* -1167,21*

P(3HB) P(3HB):GEL 10:1 P(3HB):GEL10:1 et. PLA:PEG 3:1

* diferena significativa, = 0,05, dms teste t=893,49

126

No desenvolvimento de sistemas de liberao controlada, a aplicao de modelos matemticos representa uma importante ferramenta para o entendimento dos mecanismos envolvidos, alm de fornecer dados que podem ser usados para simular o efeito dos parmetros estudados sobre a cintica de liberao. Os mecanismos mais descritos incluem a difuso fickniana, intumescimento e eroso/degradao da matriz polimrica (NARASIMHAN, 2001). A escolha do modelo baseada nas caractersticas do frmaco e da matriz. Considerando que a maior parte do frmaco foi liberada aps 72 h de ensaio, a eroso/degradao da matriz no perodo avaliado , provavelmente, negligencivel. Desta maneira, o modelo matemtico de Baker-Lonsdale, desenvolvido a partir do modelo de Higuchi, foi aplicado para descrever os perfis de liberao. Este modelo descreve o controle da liberao de matrizes esfricas e no homogneas, e uma correlao linear pode ser estabelecida aps a construo de um grfico de frao liberada versus tempo, usando a seguinte equao:

f = 3/2 [ 1 (1 - Mt/ M)2/3 ] - Mt/ M = k t

Onde Mt a taxa de frmaco liberado no tempo t , M a taxa de frmaco liberado no infinito, e k corresponde inclinao da reta obtida aps linearizao (COSTA, LOBO, 2001). Na Figura 32 encontram-se demonstrados os perfis de liberao do ibuprofeno a partir das diferentes formulaes, aps aplicao do modelo de BakerLonsdale. Os dados de regresso esto demonstrados na Tabela 25.

127

FIGURA 32: Grfico obtido aps aplicao do modelo Baker-Lonsdale nos perfis de liberao do IBF a aprtir das microesferas de ( ) P(3HB), ( ) P(3HB):GEL 10:1, ( ) P(3HB): GEL 10:1(etanol), ( ) P(3HB):PLA-PEG 3:1 e ( ) P(3HB):PLA-PEG 1:1.

TABELA 25: Dados de regresso obtidos aps aplicao do modelo de BakerLonsdale nos perfis de liberao do ibuprofeno a partir das microesferas.
Formulao (n=3) P(3HB) P(3HB):GEL 10:1 P(3HB):GEL 10:1 (etanol) P(3HB):PLA-PEG 3:1 P(3HB):PLA-PEG 1:1 Coeficiente de correlao (R2) 0,985 0,936 0,876 0,959 0,895 Inclinao da reta Intercepto

0,015 0,005 0,014 0,002 0,002

-0,004 0,038 0,025 0,015 0,041

Os altos coeficientes de correlao obtidos aps linearizao dos perfis de liberao indicam que o frmaco liberado principalmente por um processo de difuso. Este resultado foi confirmado pela anlise das fotomicrografias obtidas a

128

partir das microesferas, aps sete dias de ensaio de liberao (Figura 33). Como pode ser observado, a forma esfrica das microesferas foi mantida, porm ocorreu um aumento da porosidade, resultante provavelmente da sada do frmaco e da formao de canais nas partculas. Quando PLA-PEG foi empregado para a obteno da blenda, um maior aumento da porosidade foi observado, decorrente, provavelmente, da maior hidrofilia das cadeias de polietilenoglicol. Esta hidrofilia promove a penetrao da gua na partcula, facilitando a liberao. Os grandes espaos vazios observados nas microesferas compostas P(3HB):GEL so decorrentes, possivelmente, da solubilizao e remoo da gelatina aps entrada do meio de liberao no interior das partculas.

(a)

(b)

(c)

(d)

FIGURA 33: Micrografias obtidas por MEV das microesferas de (a) P(3HB):PLAPEG 3:1, (b) P(3HB):PLA-PEG 1:1, (c) P(3HB):GEL e (d) PHB:GEL(etanol), aps sete dias do incio do ensaio de liberao.

129

PARTE III Avaliao preliminar da eficcia teraputica in vivo do ibuprofeno liberado a partir das microesferas em modelo de artrite crnica induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA)

O uso do adjuvante completo de Freund (CFA) como indutor de doenas auto-imunes est descrito em diversos protocolos de modelos experimentais. No entanto, o modo de ao do CFA ainda no completamente conhecido. O CFA composto por leo mineral, mono-oleato de manitol, como surfactante, e uma micobactria morta. sugerido que a doena seja desencadeada pela resposta imune a um eptopo da protena hsp65 (heat shock protein de 65 kDa) do mycobacterium. Anticorpos e clulas T especficas, produzidos contra este eptopo, levariam a uma reao-cruzada com os eptopos da protena HSP do hospedeiro (BILLIAU, MATTHYS, 2001). Outros investigadores acreditam que o gatilho artritognico seja determinado tanto pela natureza do leo utilizado no preparo do adjuvante, quanto pelas peptidoglicanas presentes nas paredes celulares das bactrias (WHITEHOUSE, 2007).

4.3 Avaliao da eficcia teraputica do ibuprofeno liberado a partir das microesferas Devido s caractersticas das microesferas demonstradas nos ensaios in vitro, como alto teor de ibuprofeno encapsulado e maior controle da liberao, a formulao de microesferas utilizadas no ensaio in vivo foi preparada a partir de P(3HB):PLA-PEG 3:1. Os resultados obtidos para incapacitao articular, edema articular e contagem de clulas, aps administrao de IBF livre e microesferas, esto apresentados como grficos nas Figuras 34, 35 e 36, respectivamente.

130

50 40

Salina IBF Micro Micro-IBF

TEP (s)

30 20 10

Tempo (dias) Dias

FIGURA 34: Avaliao da resposta antinociceptiva de microesferas contendo ibuprofeno atravs da medida de incapacitao articular. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey).

Atravs dos resultados demonstrados na Figura 34, pode-se observar que os grupos tratados com IBF livre, microesferas brancas e microesferas com o frmaco, no apresentaram diferena significativa (p > 0,05) em relao ao grupo salina. Entretanto, ao se avaliar o edema articular (Figura 35), os animais que receberam as microesferas contendo ibuprofeno demonstraram menor aumento do dimetro articular (p < 0,05) quando comparados ao grupo que recebeu IBF livre ou aos grupos controles (salina e microesferas brancas). Alm disso, no grupo tratado com microesferas contendo o frmaco, a migrao de leuccitos (Figura 36) foi reduzida de forma significativa (p < 0,05).

131

0.5 0.4

DA (cm)

0.3 0.2 0.1 0.0

Controle IBF Micro Micro-IBF

*** ##
0 1 2 3 4 5 6

Tempo (dias) Dias

FIGURA 35: Avaliao do aumento do dimetro articular de microesferas contendo ibuprofeno. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey). *** e ## indicam diferena estatstica entre os grupos tratados com micropartculas de ibuprofeno e salina (p<0.001) e os grupos tratados com micropartculas de ibuprofeno e ibuprofeno livre (p<0.01).

A reduzida estimulao celular causada pela matriz polimrica que compe as microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 pode ser decorrente das caractersticas de hidrofilicidade e de no-imunogenicidade do PEG. A modificao qumica do PLA com poli(etilenoglicol), PEG, conduz formao de um copolmero anfiflico, o qual menos susceptvel adsoro de protenas, clulas, e/ou tecidos, e, conseqentemente, menos propcio a ativar o sistema complemento e desencadear reaes adversas (LUCKE et al., 2000; DRUMOND & WANG, 2004). Este efeito tem sido atribudo barreira estrica que se forma ao redor das partculas preparadas a partir de PLA-PEG, decorrente da hidratao das cadeias de PEG (MOSQUEIRA et al., 2001).

132

5000 4000
Controle IBF Micro Micro IBF

Cells/mm3

3000 2000 1000 0

FIGURA 36: Avaliao da migrao celular de microesferas contendo ibuprofeno. Os resultados esto expressos como mdia e erro padro da mdia (M E.P.M) de 6 ratos por grupo. Anlise estatstica (ANOVA de uma via seguida de post-hoc de Tukey). A relativa melhora no quadro artrtico alcanada com o ibuprofeno encapsulado nas microesferas, verificada atravs da reduo do edema articular e da migrao de leuccitos, torna necessrio o estudo de doses mais elevadas de ibuprofeno. importante avaliar se estas doses aumentam a resposta teraputica ao frmaco, tendo em vista que o ibuprofeno livre no reduziu os parmetros inflamatrios avaliados no estudo. Experimentos com este ajuste de dose de ibuprofeno, encapsulado ou no, j esto sendo realizados, juntamente com a avaliao histopatolgica e radiogrfica dos animais. Estes resultados sero publicados em breve por nosso grupo. necessrio verificar tambm se a utilizao de tween 80 para facilitar a solubilizao do ibuprofeno no provocou o aceleramento da liberao do frmaco a partir das partculas de P(3HB): PLA-PEG 3:1. Ressalta-se ainda que a maioria dos estudos encontrados na literatura tem avaliado a resposta anti-artritognica de frmacos antiinflamatrios, veiculados em micro e nanopartculas, aps a administrao sistmica. Neste estudo, temos avaliado a resposta teraputica do ibuprofeno local, o que poderia diminuir possveis efeitos adversos j conhecidos no tratamento com antiinflamatrios no-esteroidais.

_____________________________5.

CONCLUSES

134

Todas as formulaes avaliadas apresentaram altos valores de eficincia de encapsulao e teor de ibuprofeno. Entretanto, os valores de teor de frmaco foram significativamente reduzidos pela adio de PLA-PEG para formar uma blenda e quando microesferas compostas de P(3HB) e GEL foram preparadas. As microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e trimiristato de glicerila apresentaram forma esfrica e superfcie rugosa. O aumento da proporo de TMG reduziu a porosidade das partculas, quando clorofrmio foi utilizado como solvente orgnico. A substituio do clorofrmio por diclorometano/lcool isoproplico no preparo das microesferas de P(3HB) e TMG reduziu o dimetro e atenuou a rugosidade das microesferas. Neste caso, o aumento da proporo de TMG na blenda conduziu obteno de partculas altamente porosas. Esta rugosidade pareceu ser reduzida com a adio do frmaco. A rugosidade da superfcie das partculas tambm foi afetada pela adio de PLA-PEG, em decorrncia da maior hidratao das microesferas proporcionada pela presena das cadeias de poli(etilenoglicol) na superfcie das mesmas. A avaliao da morfologia de filmes preparados com P(3HB) e TMG mostrou uma ntida separao de fases, caracterizando imiscibilidade entre os componentes. Quando a morfologia dos filmes de P(3HB) e PLA-PEG foi avaliada uma estrutura compacta e homognea foi visualizada. Os estudos de calorimetria exploratria diferencial (DSC) indicaram que a adio de TMG nas microesferas no altera o grau de cristalinidade do P(3HB). Por outro lado, as anlises de DSC, em conjunto com a difrao de raios-x, demonstraram a reduo da cristalinidade do P(3HB), unicamente quando PLA-PEG adicionado na proporo de 50% da matriz. Para todas as formulaes estudadas, as anlises de DSC e difrao de raios-x demonstraram que o frmaco encontra-se parcialmente disperso na sua forma amorfa ou molecular na matriz.

135

Partculas de dimetro mdio variando entre 21,3 e 56,17 m foram obtidas, sendo os maiores valores observados para as microesferas compostas de P(3HB):GEL. A formulao P(3HB):GEL 10:1 tambm apresentou a maior heterogeneidade de tamanhos. A velocidade de liberao do IBF foi significativamente afetada pela composio ou procedimento empregado para preparao das microesferas. As microesferas preparadas a partir de blendas de P(3HB) e TMG no permitiram o controle da liberao do ibuprofeno, a qual foi bastante pronunciada na primeira hora. Este fato decorreu, provavelmente, da localizao superficial do frmaco nas partculas e da formao de canais durante a formao das microesferas. Elevados valores de efeito burst foram observados nas microesferas preparadas a partir de P(3HB) e PLA-PEG 3:1 ou P(3HB):GEL 10:1, com e sem adio de etanol. A adio de etanol pareceu provocar ainda o deslocamento do frmaco para a superfcie das microesferas, e, conseqentemente, o aceleramento da liberao do IBF. Apesar da reduo da cristalinidade do P(3HB) verificada nas microesferas de P(3HB):PLA-PEG 1:1, o maior controle da liberao foi obtido quando as microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 foram testadas. Este resultado pode estar associado ao maior grau de hidratao da matriz, ocasionada pela maior proporo de PLA-PEG. Os resultados obtidos no ensaio in vivo demonstraram a maior eficcia das microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 contendo ibuprofeno, em relao ao frmaco livre, no que diz respeito reduo do edema articular e migrao de leuccitos. A ausncia de alterao no quadro de incapacitao articular denota a importncia de novos estudos com doses maiores de microesferas, sem, no entanto, subestimar os resultados promissores obtidos com esta formulao.

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