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4. O controle da expresso gnica

Como dissemos anteriormente, as necessidades de um microrganismo como a bactria Escherichia coli so muito variadas e mudam constantemente. Para cada situao determinada a bactria precisa lanar mo de uma bateria de enzimas e protenas, que no estavam disponveis momentos antes e que provavelmente no sero mais necessrias minutos depois. Como consegue o organismo ligar e desligar genes, que comandaro a sntese de mRNAs, que daro origem por fim s protenas necessrias? A este processo chamamos controle da expresso gnica.

O operon lac

H muitos diferentes mecanismos de controle da expresso gnica, mesmo se considerarmos apenas a bactria E. coli. Por isso procuraremos nos concentrar na anlise de um deles, que tem muita aplicao em engenharia gentica. Este mecanismo foi elucidado pelos franceses Franois Jacob e Jacques Monod, que receberam por isso o Prmio Nobel em Medicina, em 1965, juntamente com Andre Lwoff (as Palestras Nobel esto disponveis no site de downloads). Eles estudaram os genes que codificam as enzimas responsveis pela degradao da lactose em E. coli. O modelo que discutimos a seguir j incorpora as modificaes subseqentes, fruto das contribuies de grupos de pesquisa no mundo todo, e exemplifica de forma didtica um mecanismo que comum a muitos outros microrganismos e observado na regulao de muitos genes. Atravs de experimentos em gentica clssica (empregando mutantes e plasmdeos que transportavam genes e stios reguladores para a bactria hospedeira, criando assim diplides parciais) Jacob e Monod criaram um modelo no qual o stio promotor, associado a um outro stio chamado operador, controlava a expresso de todos os genes imediatamente

abaixo, isto , 3, do promotor. A este conjunto chamaram operon. Como os genes que estudavam eram os responsveis pela sntese das protenas que degradavam lactose, chamaram a este arranjo de genes operon lac. O diagrama bsico do operon lac est representado nas figuras a seguir.

Figura 1: Distribuio dos genes e mdulos de controle do operon lac. O gene i, para o repressor lac, expresso constitutivamente, est situado prximo ao conjunto dos genes induzveis lacZ, lacY e lacA, responsveis pela sntese das protenas b-galactosidase, permease e transacetilase. O promotor plac controlado pelo operador olac, onde se ligam duas molculas do repressor.

O stio operador uma regio do DNA logo abaixo do stio promotor. Na verdade, os dois stios esto parcialmente embricados (superpostos), pois o promotor se estende da base -45 at a base +5, enquanto o stio operador vai da base -8 at a +12. Desta forma, se tivermos uma protena ligada ao stio operador, ela vai impedir que este seja ligado pela RNApol. Uma analogia razovel seria comparar o promotor com uma bota, em cujo bico est o stio operador. Quando o bico da bota est ocupado com uma pedra, no se pode calar a bota. Analogamente, quando o operador est ocupado pelo represssor lac (produto do gene i, que se liga ao operador na forma de um dmero), a RNA polimerase no pode se ligar ao promotor. O repressor lac, por sua vez, o produto de um gene que est prximo ao operon, porm no faz parte integral dele (na verdade, este gene poderia estar muito distante no genoma de E. coli). Na ausncia de lactose, as poucas molculas de repressor presentes no citosol da bactria (menos de 10 por clula!) so suficientes para silenciar a expresso do operon, ligandose ao stio operador. Todos estes eventos esto representados na figura 2a, a seguir.

Figura 2a: Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis pelo uso da lactose em E. coli. O repressor, produto do gene i, liga-se ao operador (em verdade, duas molculas), impedindo a ligao da RNApol ao stio promotor Plac e bloqueando a transcrio. O repressor est representado por elipses vermelhas.

Na presena de lactose, contudo, o repressor inativado pela ligao de um produto do metabolismo da lactose, a alolactose. Inicia-se, ento, a transcrio dos genes lacZ, lacY e lacA, formando-se um mRNA policistrnico. Este mRNA imediatamente traduzido para formar trs enzimas da via de degradao da lactose: a b-galactosidase (b-gal), a permease e a transacetilase. A -gal degrada a lactose a galactose e glicose e a permease aumenta muitas vezes a permeabilidade da clula lactose. Com isto a lactose do meio de cultura rapidamente assimilada e utilizada pela clula. Quando a concentrao de lactose reduz-se muito, at as molculas que esto ligadas ao repressor acabaro sendo clivadas pela gal. A consequncia disto a ligao dos repressores, agora ativos, ao stio operador, provocando a parada da transcrio dos genes lacZ, lacY e lacA. Estes eventos esto representados na figura 2b a seguir.

Figura 2a: Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis pelo uso da lactose em E. coli. A lactose no citosol bacteriano (rigorosamente, a alolactose, produto obtido pela transformao da lactose no interior da bactria) liga-se ao repressor, inativando-o e liberando o promotor para ser ligado pela RNApol. O processo de transcrio estar liberado at que a concentrao citoslica de lactose seja insuficiente para garantir a inativao das molculas do repressor. Os produtos dos genes lacZ, lacY e lacA, b-galactosidase, permease transacetilase, respectivamente, esto representados por elipses azuis, em trs tonalidades. O repressor est representado por elipses vermelhas.

Este o exemplo clssico de um operon que funciona por represso. H muitos outros semelhantes, que controlam em geral a sntese de enzimas responsveis pela degradao de um determinado produto nem sempre disponvel no ambiente. H tambm genes operons que esto sempre ligados e que devem ser silenciados em determinadas situaes. So em geral os genes para biossntese de algum produto que a bactria pode obter do ambiente. Somente quando falta este produto no meio de cultura que a bactria ativa a transcrio dos genes que iro produzir as enzimas necessrias biossntese do produto em falta.

Um ponto que fica obscuro na explicao acima : como a lactose entrou na clula, se a permease no estava presente na membrana para transport-la do exterior para o citosol? A razo a seguinte: h sempre um pouco de permease na membrana, porque o operon "vaza", isto , um pouco dos trs produtos gnicos sempre produzido. E vaza porque os repressores se desligam por breve momento do operador, j que a ligao de molculas uma s outras por foras fracas no eterna. No instante em que o operador estiver livre uma RNA polimerase pode transcrever o operon, o que de fato acontece. O vazamento observado em todos os genes e operons bacterianos e, em grau muito menor, na maioria dos genes dos demais organismos. Pode parecer um gasto de energia desnecessrio, mas o vazamento inevitvel. Por outro lado, sem ele a maior parte dos operons no funcionaria, porque no teria como ser disparado.

Alm destes dois sistemas h ainda outros, bastante mais complexos, que modulam de forma fina a expresso de genes nos procariotos. H mesmo operons que so controlados por represso e ativao simultaneamente. Vale ressaltar que o prprio operon lac tem uma particularidade, descoberta muitos anos depois de sua elucidao por Jacob e Monod: o controle da sua expresso exercido por uma protena chamada CAP (catabolite gene activator protein), uma protena dimrica como o repressor lac, com aprox. 45.000 Da. A protena CAP no tem qualquer influncia na expresso do operon enquanto no estiver ligada ao AMP cclico. Entretanto, uma vez ligada, ela se associa a um stio acima (5) do promotor, o que permite uma ligao muito mais rpida e efetiva da RNApol ao stio promotor. Na analogia da bota que fizemos acima, o complexo CAP-cAMP funcionaria como uma caladeira: na ausncia de pedra na ponta da bota (repressor) a caladeira (CAP-cAMP) facilitaria muito a entrada do p (RNApol) na bota (promotor). Este curioso mecanismo de controle positivo do operon lac tambm foi observado em diversos outros operons bacterianos. Qual seu objetivo, afinal? A explicao simples: quando a bactria no tem glicose para degradar, ela passa por um processo de fome celular, com conseqente aumento dos nveis de cAMP celulares. Este cAMP se liga protena CAP, permitindo uma expresso aumentada de todos os operons que so responsveis pela degradao de acares e outros produtos energticos. A figura a seguir ilustra e comenta o fenmeno da "induo" da expresso pelo consumo da glicose.

P.: Quando se adicional lactose ao meio de cultura da bactria E. coli, h um aumento da produo de -galactosidase, mas de apenas 10X. Somente depois de alguns minutos que a produo de -gal dispara para 100.000 X o valor final. Como se explica isso, que est representado no grfico abaixo?

R: O fenmeno pode ser explicado pela converso do promotor lac de fraco em forte. Na natureza, o promotor deste operon em E. coli fraco, isto , mesmo quando liberado, ele no ser sempre reconhecido pela RNApol. Consequentemente, a expresso dos genes do operon vai ser discreta. Assim que adicionamos lactose ao meio de cultura (que tinha uma pequena frao de glicose, sem que os experimentadores se dessem conta disso), o promotor liberado, pois os repressores que estavam ligados ao operador so retirados. Mas sendo o promotor fraco, o aumento de expresso de apenas 10X. Aps um intervalo de tempo ( t) a glicose residual presente no meio de cultura degradada, o que faz com que a concentrao do cAMP da clula comece a aumentar (indicando a fome celular). O cAMP se liga a uma protena citoslica denominada CAP, e o complexo CAP-cAMP vai ligar-se ao DNA bacteriano um pouco acima do promotor lac (em torno da posio -45). Assim que isso ocorre, o promotor converte-se de fraco em forte, obrigando a toda RNApol que passar por ele a transcrever uma fita de RNA. O resultado a produo explosiva de -galactosidase, que vai ser usada para degradar e aproveitar rapidamente a lactose do meio, "matando a fome" da bactria. Enfim, o grfico demonstra a converso de um promotor fraco num promotor forte e a predileo da E. coli pela glicose como fonte de energia.

Figura 4: Controle do operon lac pela protena CAP

Novo! Veja mais sobre a maneira como o complexo CAP-cAMP controla a transcrio dos genes lacZ. lacY e lacA no link

Que importncia tem o operon lac na gentica molecular? Muitos dos vetores de expresso, sejam eles fagos ou plasmdeos, empregados em engenharia gentica, tm o gene clonado sob o controle de um promotor/operador lac. Este sistema propicia o controle da expresso do gene clonado atravs da adio de um anlogo da lactose, o IPTG (isopropiltiogalactosdeo). Este produto muitas vezes mais efetivo que a lactose na induo da expresso do operon lac, alm de no ser degradado. Veremos mais adiante como podemos tirar vantagem destas construes artificiais de genes para a produo de protenas recombinantes.

O operon triptofano (operon tryp)

A biossntese de aminocidos um processo muito caro em termos energticos. Por isso, quando h, por exemplo, triptofano disponvel no meio de cultura, a Escherichia coli imediatamente cessa de produzir as enzimas necessrias biossntese do aminocido. O processo alcanado pela ativao de um repressor solvel que, na ausncia de triptofano, inativo. A ativao feita, compreensivelmente, pelo prprio triptofano que assim, estando presente, bloqueia sua prpria sntese endgena. A figura abaixo representa este processo. Quando a concentrao de triptofano diminui muito, o complexo repressor-triptofano se desfaz e o operon ativado. A figura mostra de forma esquemtica que o operon tem uma regio que antecede os genes da via biossinttica propriamente ditos, trypE, trypD, trypC, trypB e trypA. Esta sequncia conhecida como sequncia lder e tem um papel fundamental no processo que ser discutido mais adiante,

chamado atenuao. Observe que cada gene inicia com um cdon ATG e termina com um cdon TGA (ou qualquer dos outros dois cdons de parada).

Figura 5: Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E. coli, no nvel de represso do operador. O repressor inativo logo aps sua sntese e necessita do triptofano para ativar-se. Quando isto ocorre, ele se liga ao operador , impedindo a ligao da RNApol ao stio promotor Ptryp e bloqueando a transcrio. O processo de transcrio de novo liberado quando a concentrao citoslica de triptofano insuficiente para garantir a ativao das molculas do repressor.

Pela primeira vez ao longo deste texto enfatizamos a presena de uma sequncia que antecede a regio a ser traduzida, representada na figura pela sigla SD. a sequncia de Shine-Delgarno, ou stio ligador de ribossomos (RBS) da E. coli. Os demais procariotos tm estruturas muito semelhantes e os eucariotos no so muito diferentes neste aspecto. A sub-unidade leve do ribossomo, ainda antes de agregar-se sub-unidade pesada, associa-se ao mRNA atravs desta sequncia e desliza no sentido 3 at alcanar o primeiro cdon AUG. De acordo com o conhecimento atual o tRNA para formil-metionina (nos procariotos) tambm se liga sub-unidade leve associada ao mRNA, ainda no RBS, e ele que determina a parada do complexo "sub-unidade leve-tRNA" no primeiro cdon AUG (que o anticdon do tRNA para metionina reconhece). frente de todo gene ou regio que ser traduzida (como a parte da sequncia lder do operon triptofano, da qual falaremos em breve, que d origem a um peptdeo lder) deve haver fatalmente um RBS, como mostrado na figura acima e nas demais abaixo, neste sub-item, sem o que no haver sntese protica. A existncia de um RBS entre genes de um mRNA policistrnico a forma pela qual a natureza garante a traduo do gene aps a liberao das duas sub-unidades do ribossomo quando termina a traduo do gene anterior. Uma vez liberado o operador, h a transcrio imediata do DNA. O RNA produzido inicia-se pelas 4 sequncias representadas em vermelho, que tm uma particularidade interessante: podem parear duas a duas, 1 com 2, 2 com 3 ou 3 com 4, formando sempre grampos. Apenas o grampo 3-4 um grampo de terminao, pois seguido de um poli-U. Por outro lado, apenas a primeira sequncia possui cdons para triptofano (dois seguidos, neste caso). Para que existe esta sequncia-lder frente dos genes da via biossinttica? Como veremos a seguir, ela serve para interromper precocemente a sntese de RNA caso ainda haja algum triptofano no citosol bacteriano, insuficiente para ativar o repressor mas suficiente para garantir a produo de protenas. O que a bactria mede com este sistema? A concentrao de tRNA carregado com triptofano, que exatamente o "precursor" deste amonocido necessrio cadeia polipeptdoca nascente. A figura a seguir mostra a situao em que a quantidade de triptofano na clula to reduzida que no h tRNA carregado com triptofano disponvel para a sntese protica.

Figura 6:Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E. coli, no nvel de atenuao. A parada dos ribossomos sobre a regio 1 (I) permite o pareamento das regies 2 e 3 (II) que, distantes do poli-U que sucede a regio 4, no configuram um grampo de terminao. A transcrio progride (III), dando ao final a sntese das 5 enzimas que formam a via biossinttica do triptofano.

A sntese do mRNA inicia-se assim que o operador liberado.O ribossomo se liga sequncia de Shine Delargno acima (5) da regio 1 e desliza at encontrar o primeiro AUG. Ao entrar na regio 1 o ribossoma vai encontrar dois cdons para triptofano. Na situao prevista nesta figura no h tRNA carregado com triptofano. A sntese protica pra. A sntese de RNA continua, pois independente destes fatores, transcrevendo as regies 2 e 3, que pareiam entre si, j que a regio 1 est protegida contra

pareamentos pelos ribossomos que a esto cobrindo. Em seguida a RNApol transcreve a regio 4 e a sequncia poli-A, dando origem a uma sequncia poli-U. Este poli-U est muito distante do grampo 2-3 formado anteriormente e no configura um grampo de terminao. A sntese de RNA, portanto, avana pela regio dos genes da biossntese do triptofano e termina por permitir a sntese das 5 enzimas da via biossinttica. Todo este processo faz sentido nesta situao, pois no h definitivamente triptofano suficiente para garantir a sntese das protenas pela bactria. Ao contrrio, quando h ainda um pouco de triptofano, insuficiente para ativar o repressor mas suficiente para garantir a sntese protica, o pareamento das sequncias que compes a sequncia-lder muda. A figura seguinte representa esta nova situao.

Figura 7: Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E. coli, no nvel de atenuao. A cobetura das regies 1 e 2 pelos ribossomos, na presena de tRNA carregado com triptofano no citosol bacteriano, permite o pareamento das regies 3 e 4 que, prximas do poli-U que sucede a regio 4, configuram agora um grampo de terminao. A transcrio encerrada precocemente, no dando origem sntese das 5 enzimas que formam a via biossinttica do triptofano.

Nesta nova situao a quantidade de triptofano muito pequena, porm suficiente para garantir a presena de tRNAs carregados com

triptofano no citosol. Com isto, os ribossomos no param sobre a regio 1 e progridem para a regio 2, quando a RNA polimerase est transcrevendo a regio 3. Antes que toda a traduo da regio 2 seja, feita a RNApol j transcreveu a regio 4 e formou o poli-U, o que d origem ao grampo de terminao mostrado na figura acima. ativado. bom relembrar que as regies 1 e 2 no podem parear pois esto recobertas e protegidas pelos ribossomos engajados na sntese do peptdeo lder. Quando este fenmeno acontece, a sntese de RNA encerrada antes da transcrio dos genes da via biossinttica, e nenhuma enzima da via ser produzida. De fato, a atenuao da transcrio economiza energia da bactria, que no precisa sintetizar enzimas para a produo de um aminocio que ela ainda dispe, embora em pequena quantidade. O mesmo mecanismo descrito para o triptofano empregado em outras vias biossntticas de aminocidos. A razo parece ser o alto custo energtico destas vias. A Natureza criou com este sistema uma forma de discriminar entre pouco e insuficiente, contornando a forma tosca com que o sistema repressor/operador controla a expresso gnica (lembre-se de que o repressor se desliga ocasionalmente do operador, dando origem ao vazamento, que importante para a expresso gnica, particularmente ao disparo de certos operons, como o lac). possvel que se um sistema de represso simples como o das bactrias fosse "regulado" para no ser aberto ou fechado seno em circunstncias extremas, ele jamais funcionaria, ficando sempre fechado ou sempre aberto, conforme o caso.

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