UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

LABORATORIO DE GENTICA CLNICA

EQ 5

CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBSERVACIN DE CARIOTIPO HUMANO.

ALARCN MANJARREZ CARLOS DOTOR BARRERA CRISTINA TOLEDANO TABLEROS JOS EDUARDO

02 DE SEPTIEMBRE DE 2011 | 1802

INTRODUCCIN
En la realizacin de esta prctica se tuvieron como objetivos conocer cmo se lleva a cabo experimentalmente el cultivo de linfocitos de sangre perifrica, los cuidados que se deben tener, as como la correcta obtencin de los cromosomas a partir de stos. Tambin, conocer el ciclo celular y cada una de sus fases, conocer las utilidades y la realizacin de un cariotipo, y con las preparaciones semipermanentes analizar las caractersticas de los cromosomas humanos, as como identificar alteraciones numricas o estructurales de los cromosomas. Para el cultivo de Linfocitos se extrajo una muestra de sangre perifrica, con heparina como anticoagulante. Se colocaron 400 L de la muestra en 4.5 mL de medio de cultivo celular RPMI 1640, en un tubo falcn de 15 mL, al cual se le agreg un mitgeno, que en este caso fueron 250 L de fitohemaglutinina, que estimular la divisin celular de los linfocitos. Se dej proliferar incubndolo por 72 horas a 37 C y a las 70 horas se agregaron 100 L colchicina, que detiene la divisin celular en la mitosis, y se dej dos horas para completar las 72 horas de incubacin. Para la cosecha de los linfocitos se centrifugaron los tubos falcn con el cultivo a 1500 rpm por 5 minutos, se desech el sobrenadante y se adicionaron al botn celular 8 mL de KCl 0.075 M con agitacin constante para realizar un choque hipotnico. Una vez terminado esto se incub por 20 min. a 37 C. Transcurrido ese tiempo, se centrifug 10 min. a 1500 rpm, se elimin despus el sobrenadante y se adicion al botn celular lentamente y agitando contantemente 7 mL de fijador siendo una mezcla de Metanol: cido Actico (3:1) , se dej la solucin en reposo por 20 minutos y se centrifug a 1500 rpm por 10 minutos Se elimin el sobrenadante y se agregaron 7 mL de fijador nuevamente y se dej reposar 15 minutos, se centrifug posteriormente a 1500 rpm por 10 minutos, se elimin el sobrenadante nuevamente y se agregaron 7 mL ms de fijador, dejando reposar ahora slo 10 min. y se centrifug de igual forma, 10 min a 1500 rpm. Por ltimo se desecha el sobrenadante y se resuspendi con 0.5 mL de fijador. Para su observacin se glasearon 10 portaobjetos limpios usando alcohol al 70 % y colocados en el congelador por 30 minutos. stos se colocaron juntos y con una pipeta pasteur se gote a una altura de 60 a 70 cm el botn celular resuspendido con los 0.5 mL de fijador. Se dej secar al aire libre las laminillas, y posteriormente se cubrieron las laminillas con colorante de Giemsa por 15 minutos, se elimin el exceso de colorante y una vez seco se observ a 40 X y 100 X y observando los cromosomas en la metafase para el armado del cariotipo. Los cultivos celulares son un conjunto de tcnicas que permiten la presencia de clulas in vitro, manteniendo las condiciones fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Existen diferentes tipos de cultivos que son Normales y Transformados. Los normales a su vez se dividen en los primarios y los secundarios, los primarios son tomados directamente del rgano, como los dela sangre perifrica, mientras que los secundarios son un subcultivo de los primarios. Mientras que los transformados son las lneas celulares.

MATERIALES Tubo vacutainer con heparina Tubos falcn de 15 mL Pipetas graduadas de 5 mL Centrifuga REACTIVOS Colchicina Medio de cultivo RPMI Fitohemaglutinina Vortex Pipetas Pasteur Portaobjetos

Cloruro de potasio Fijador metanol: cido actico (3:1) Colorante de Giemsa

MTODO

Cultivo de Linfocitos
Muestra de sangre con Heparina

Cultivo por 72 hrs

70 hrs Colchicina

Cosecha de Linfocitos
1Centrifugar 1500 rpm/ 5 min

2-Shock hipotnico con KCl

3Centrifugar a 1500 rpm/10 min

4- 7 mL de Fijador; CH3OH:CH3C OOH

5-Reposo de 20 min

6Centrifuga cin* 1500 rpm/10 min

7Resuspend er

Observacin
Glasear portaobjetos

Goteo a 70 cm

Tincin de Giemsa

Observar a 40X y 100X

* se repite 3 veces del paso 4 al 6

RESULTADOS

Fig 1. Cromosomas, por cultivo de linfocitos

ANLISIS DE RESULTADOS
Como se puede ver en los resultados obtenidos se aprecian los cromosomas de clulas blancas o linfocitos que fueron cultivados y cosechados con este propsito, adems de algunas preparaciones semipermanentes donde tambin se observaron los cromosomas. Se utilizaron linfocitos porque son clulas fciles de obtener, y de proliferar, sin embargo tambin pueden ser tiles clulas de cualquier tejido que tenga clulas en divisin como medula sea, fibroblastos, clulas suspendidas del lquido amnitico etc. En la imagen se observan los cromosomas amontonados, al ordenarlos por pares se arma un cariotipo en el cual se acomodan por pares homlogos siendo caracterstico de cada especie al igual que el nmero de cromosomas autosomas y el par gonosomico. Para ello se tuvo que obtener clulas en la metafase que es la fase de la mitosis cuando los cromosomas estn ms contrados y es posible su observacin individual. Para esto en el cultivo de linfocitos se agreg un mitogeno que va a estimular la proliferacin celular esto hace que el mitgeno que fue la hemaglutinina es reconocida como un Ag y estimula los linfocitos a liberar interleucinas como la IL2, que al ser un factor de crecimiento leucocitario estimula la divisin y sntesis de DNA provocando la divisin celular, y agregando la colchicina que inhibe el huso mittico detiene a las clulas en la metafase pudiendo as observar los cromosomas.

Lo que se seala con las flechas son los cromosomas los cuales se observan sin alguna alteracin estructural, sin embargo como no estn ordenados por pares no se puede asegurar que no haya alguna alteracin numrica. Se pueden apreciar cromosomas metacntricos grandes, medianos y pequeos, as como submetacentricos y acrocentricos. Los cromosomas estn constituidos por dos cromatides unidas por una constriccin llamada centrmero. De acuerdo con la ubicacin de estos es como se hace la clasificacin morfolgica siendo el metacntrico cuando el centrmero esta en medio y no se distingue diferencias longitudinales en los cromatides, en el submetacentrico el centrmero est ms cerca de algn extremo observando brazos largos y cortos, mientras que el acrocentrico tiene el centrmero casi en la orilla, y en los brazos cortos existen unas estructuras llamadas satlites que se considera son organizadores del nuclolo.

CONCLUSIONES
En conclusin se logr la obtencin de cromosomas humanos de linfocitos cultivados, as como la observacin de cromosomas de preparaciones semipermanentes para analizar sus caractersticas en la metafase. Es de suma importancia este tipo de anlisis citogenticos ya que con ello se logra identificar anomalas genticas numerales como aneuploidias o poliploidias, as como alteraciones estructurales como las translocaciones, deleciones con y sin formacin de anillos, inversiones, formacin de isocromosomas etc.

BIBLIOGRAFA
Salamanca F: Citogentica humana: fundamentos y aplicaciones clinicas. Mxico: Editorial Mdica Panamericana; 1990. Lisker R, Armendares S: Introduccin a la Gentica Humana. Mexico: Editorial El Manual Moderno; 2001 Passarge E: Gentica Texto y Atlas. Espaa: Panamericana;2010