Revista de Ciencias Agrarias y Tecnologa de los Alimentos Vol.

20 2002

Trabajo de Investigacin

EXTRACCIN DE LOS PRINCIPIOS EDULCORANTES DE LA STEVIA REBAUDIANA

Alicia Ester Soto1 y Susana Del Val2 RESUMEN: El objetivo de la experiencia descripta a continuacin fue evaluar los mtodos para aislar los glicsidos causantes del sabor dulce de las hojas de la Stevia rebaudiana con la intencin final de hallar un proceso econmicamente conveniente que pudiera ser implementado a escala industrial. Aunque el resultado fue positivo, el trabajo no fue publicado, limitndose su difusin a un informe interno. Considerando la tendencia actual al uso de productos naturales y el inters vigente por la Stevia rebaudiana hemos decidido la publicacin del trabajo completo. El mtodo propuesto produjo un rendimiento de alrededor de 5 % de glicsidos sobre la base del peso de hojas secas, el nico solvente usado fue alcohol etlico, siendo el proceso relativamente simple. Palabr as clave: Stevia rebaudiana , estevisido, esteviol, edulcorante, yerba dulce.

EXTRACTION OF THE SWEETENER CONSTITUENT OF STEVIA REBAUDIANA ABSTRACT: The objective of the experience described below was to evaluate the methods for the isolation of the glycosides which cause the sweet taste of leaves of Stevia rebaudiana . The final scope of this work was to find out an economically convenient process that could be implemented at industrial scale. Though the result was successful, the work was not published, being only diffussed as an internal report. Considering the present tendency to use natural products, and the interest for the Stevia rebaudiana , we decided to publish the complete work. The method proposed, yielded about 5 % of glycosides on dry leaves mass basis, the only solvent used was ethyl alcohol, being the process relatively simple. Key wor ds: Stevia rebaudiana , stevioside, steviol, sweetener, yerba dulce

Recibido: 14/10/02

Aceptado: 10/12/02

Dir eccin par a cor r espondencia: 1 Laboratorio de Qumica Orgnica. Departamento de Qumica. Facultad de Ingeniera. UBA. E-mail: asoto@uca.edu.ar 2 Ibidem. INTI. E-mail: sdelval@inti.gov.ar

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INTRODUCCIN

La experiencia descripta ms adelante fue efectuada en el ao 1986. En ese momento el objetivo del trabajo fue evaluar los mtodos de obtencin de los glicsidos responsables del sabor dulce de las hojas de la Stevia rebaudiana descriptos en la bibliografa, tratando de reproducirlos y eventualmente modificarlos, teniendo como meta el diseo de un proceso de extraccin econmicamente rentable, con vistas a una posible implementacin a escala industrial. Pese a haberse llegado con xito al resultado buscado, el trabajo no fue publicado, limitndose su difusin a un informe de circulacin interna. A la luz de la tendencia actual de retorno a lo natural, se consider de inters hacer una revisin va Internet de publicaciones recientes sobre Stevia rebaudiana. Comprobada la vigencia del tema se decidi publicar el trabajo completo efectuado en el laboratorio. Cabe destacar que el principio del mtodo desarrollado en ese momento, se aplica hoy industrialmente. La Stevia rebaudiana , Ca-ch o yerba dulce, crece en forma silvestre en algunas zonas de Paraguay, Brasil y provincias del nordeste argentino. Sus hojas tienen un intenso sabor dulce, propiedad que se debe al contenido de glicsidos, de los cuales el estevisido es el que se halla en mayor proporcin. La hoja en su forma natural es de 10 a 15 veces ms dulce que el azcar comn. Los estevesidos tienen un poder edulcorante de 200 a 300 veces mayor que el azcar, constituyendo un sustituto no calrico y seguro para los diabticos. El estevisido es un glicsido diterpeno de M = 804,80 y frmula C38H60O18. La estructura qumica fue dilucidada por Mosettig E. et al.1 en 1963, siendo la aglucona el esteviol. En 1982, Tanaka2 aisl cuatro glicsidos dulces adicionales, presentes en menor porcentaje, a los cuales denomin rebaudisidos A, C, D y E (Cuadro 1). Las estructuras se muestran en las figuras 1 y 2.

Fig.1- Formula general de los glicsidos de Stevia rebaudiana 6

Fig. 2- Formula del esteviosido

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Cuadr o 1- Esteviol glicsidos pr esentes en la Stevia rebaudiana

Nombre Estevisido Rebaudisido A Rebaudisido C (dulcsido B) Dulcsido A R1 Esteviol glicsidos ms comunes
-G -G -G -G

R2
-G (2,1)G -G --(2,1)G (3,1)G -G --(2,1)R (3,1)G -G (2,1)R

Esteviol glicsidos presentes a nivel de trazas Rebaudisido D -G (2,1)G Rebaudisido E Estructura del esqueleto Esteviol
G : b - glucopiranosil (glucosa) R : a - ramnopiranosil (ramnosa)

-G (2,1)G

-G --(2,1)G (3,1)G -G (2,1)G

-H

-OH

MATERIALES Y MTODOS

El material usado en las experiencias proceda de un cultivo experimental de la provincia de Misiones. En las primeras experiencias de aislamiento de los glicsidos se ensayaron mtodos descriptos en bibliografa. Estos partan de una extraccin acuosa o hidroalcohlica de las hojas de la Stevia rebaudiana . La purificacin del extracto se llevaba a cabo en distintas fases del proceso mediante el uso de resinas de intercambio inico y solventes orgnicos tales como metanol, etanol y dioxano. En ningn caso se obtuvo un producto cristalino, sino jarabes consistentes, altamente coloreados, de los cuales no se logr precipitar el estevisido por adicin de alcohol ni cristalizarlo por evaporacin. Ante la falta de resultados positivos se intentaron modificaciones, fundamentalmente el uso de solventes como acetato de etilo, o mezcla de acetato de etilo y etanol, en las etapas intermedias con el fin de eliminar impurezas como clorofilas, taninos, etc. Estos tratamientos tampoco condujeron a un resultado final satisfactorio. El nico procedimiento que permiti llegar a un producto cristalino con buen rendimiento se basa en una extraccin acuosa del material vegetal a temperatura controlada seguida de varios pasos de purificacin, siendo la etapa clave del proceso el pasaje del lquido de extraccin a travs de una resina (Res.1) que retiene selectivamente los principios edulcorantes y deja pasar los otros componentes extrados simultneamente con stos. La recuperacin del producto de inters se logr por elucin de la columna con una mezcla hidroalcohlica, completndose la purificacin por pasajes sucesivos a travs
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de una resina de intercambio catinica (Res.2), una resina de intercambio aninica (Res.3) y una columna de carbn activado granulado. El extracto final result un lquido incoloro que se concentr por evaporacin al vaco hasta la obtencin de los cristales. La identificacin de los componentes del extracto se llev a cabo por cromatografa en capa delgada contra muestras autnticas de estevisido y rebaudisido. La relacin de frente de los standards coincide con los de las fracciones que se separaron en el producto obtenido. Condiciones de la cromatografa: Adsorbente: Silicagel GF 254 Solvente de desarrollo: cloroformo-metanol-agua 90:65:9 R f estevisido: 0.63 R f r ebaudisido A: 0.52
DIAGRAMA DE FLUJO

Extraccin de las hojas con agua + CaCO3 a 20 C Filtracin Lavado Defecacin con Ca(OH)2 Ajuste de pH y filtracin Pasaje por resina R1 Elucin con mezcla hidroalcohlica Pasaje por resina R2 Pasaje por resina R3 Pasaje por carbn activado Evaporacin al vaco Obtencin de cristales

Tcnica exper imental: 50 g de hojas secas de Stevia rebaudiana partidas se dejaron macerar a temperatura ambiente durante 24 horas en 700 ml de agua destilada ms 2.5 g de carbonato decalcio. Se eliminaron las hojas por filtracin, se agreg 5 g de hidrxido de calcio y se dej actuar durante 30
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minutos. El extracto se llev a pH aproximadamente 8 por pasaje de dixido de carbono. Luego se filtr al vaco y se pas por una resina de retencin selectiva hacia solutos no polares de soluciones acuosas (R1). Los glicsidos retenidos se eluyeron con una solucin 70:30 de alcohol en agua. El proceso de elucin se continu hasta que en el lquido emergente de la columna no se detectara el producto por TLC. El eluido se pas sucesivamente por resinas de intercambio catinica (R2) y aninica (R3) y finalmente por una columna de carbn activado granulado. Se obtuvo as una solucin incolora que se concentr por evaporacin al vaco. El producto cristalino se analiz por cromatografa en capa delgada utilizando como adsorbente Silicagel GF 254 de Merck y como solvente de desarrollo una mezcla 90:65:9 de cloroformo-metanol-agua.
RESULTADOS

El mtodo propuesto permite aislar los glicsidos de la Stevia rebaudiana con un rendimiento de alrededor de 5% sobre la base de las hojas secas. En el proceso slo se usa agua y alcohol etlico como solventes, lo cual es importante teniendo en cuenta el uso alimentario del producto obtenido.

CONCLUSIONES

La relativa simplicidad de las operaciones permitira su implementacin a escala industrial en las zonas de produccin de la planta.
AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Osamu Tanaka por la provisin de los standards de estevisido y rebaudisido. A la firma Rohm & Haas por la provisin de las resinas. Al Lic. Aecio Poletto por la gestin realizada para la conseguir las hojas de Stevia y la colaboracin prestada en el trabajo de laboratorio en las primeras etapas de este estudio
BIBLIOGRAFA

1. Mosettig, E. et al.1963. J.Am.Chem.Soc. 85:2305. 2. Tanaka, O. 1982. Trends in Analytical Chemistry 1 N 11: 246-248. 3. Kobayashi, M. et al.1977. Phytochemistry 16 :1405.

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