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Lisis de Trypanosoma brucei por un Subespecies txicos de lipoprotenas humanas de alta densidad

Trypanosoma brucei brucei es un importante patgeno de ganado domstico en el frica subsahariana y es estrechamente relacionadas con los parsitos de la enfermedad humana de dormir, Trypanosoma brucei gambiense y Trypanosoma brucei rhodesiense. Sin embargo, T. b. brucei es infecciosa a los seres humanos. La restriccin de la gama de huspedes de T. b. brucei resultados de la sensitivityo f del parsito a la lisis por txicos lipoprotenas de alta densidad humana (HDL) (Rifkin, MR (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 75, 3450 hasta 3,454). Se demuestra en este informe que actividad ltica tripanosoma no es una caracterstica universal de la todos los seres humanos, sino que las partculas de HDL s thati IATS asociado con una subclase menores de HDL. Hemos purificado la actividad ltica cerca de 8.000 veces y han identificado y caracteriza la subespecie de HDL responsable de lisis tripanosoma. Esta clase de HDL tiene un familiar peso molecular de 490.000, una densidad de flotacin de $ 21 a 1,24 g / ml, y un dimetro de partcula de 160 a 210 A. Contiene apolipoproteinsA I, AII, CI, CII y CIII, y anticuerpos monoclonales contra el apo-AI y apo-EA1 inhiben la actividad tripanocida. Adems de thceosme - apolipoprotenas comn, las partculas tambin contienen por lo menos tres protenas nicas, medido por el sodio dodecil gel de sulfato-poliacrilamida electroforesis en no reductor condiciones. El tratamiento de las partculas con ditiotreitol result en la desaparicin de dos de las protenas anadb olished ctivity.T tripanocida wodimensional electroforesis en gel de showedt roteins sombrero thesep trmero werae disulfuro-ligado de 45,000,36,000, y 13.500-Da polipptidos y e tsh dimoefr 36000 - y 13.500-Da r polypeptideso de 65.000 - y 8500 - Da polipptidos. Estudios sobre la lisis de T. b. brucei por la partcula purificada sugieren que la va ltica puede implicar la adopcin de la subespecie tripanocida de HDL por endocitosis. tripanosomas africanos son el nmero ageonft sa causal de importantes enfermedades humanas y bovinas en una amplia regin de frica Subsahariana (1). Tres de estos parsitos se han agrupados como subespecies de Trypanosoma brucei en el base de bioqumicos, morfolgicos y serolgicos evidencia (2-4). Sin embargo, la acogida rangeo f estos organismos es muy diferentes. Trypanosoma brucei rhodesiense y Trynosoma brucei gambiense infectan a los humanos y causa africana la enfermedad del sueo, mientras que el tercer miembro de la brucei grupo, Trypanosoma brucei brucei, no infectan a los humanos y causa nagana en el ganado bovino (2). El anfitrin rangeof T. b. brucei es ebido restrictedb el parsito es sensible una tnoo n-inmune factor de muerte en el suero humano. Esta actividad muerte natural es Tambin se encuentran en el suero de monos babuinos, que Bisu t vid ausente frombo, ratn, conejo, la rata y los sueros. Los tripanosomas africanos la enfermedad del sueo son resistentes a tkhiel factor de maruca en favor anbda humanos suero (5-7).

Rifkin (8, 9) demostraron que la actividad ltica tripanosoma se recuper en la fraccin HDL "de la normalidad humana suero. Adems, la actividad de IC trypanosomlyet estuvo ausente en el suero de pacientes con enfermedad de Tnger (8) resultados en el HDL disminuye circulacin debido a un defecto en el la maduracin de la apolipoprotena AI (lo), la principal apolipoprotena de HDL. Humanos HDiLs suero no es una clase homognea de partculas, sino que contiene numerosas subclases, discretos que puede ser fraccionado en el baosf ze ISSI, densidad, cargo, y la composicin de la apolipoprotena (11-15). Cuando el ser humano serumw como fraccionado por cromatografa de filtracin en gel, la distribucin de T. b. actividad brucei matar y HDL comprometidos, pero no coinciden, lo que sugiere que slo una subclase de los derechos humanos de HDL puede tener actividad ltica (5, 7). En este trabajo se muestra que el factor ltico tripanosoma (TLF) obtenidos a partir de sa serumi humanos subclase muy de menor importancia de HDL y que el HDL majorityo f suero no es txico para tripanosomas. TLF se ha purificado de aproximadamente 8000 - veces y representa una subclase de muy alta densidad de colesterol HDL que es muy grande y contiene un nmero nico de protenas, que estn threeo f disulfuro complejos. Estudios lisis de la reaccin a diferentes temperaturas indican que estas partculas inusual puede ser tomado por endocitosis. MATERIALES Y MTODOS Lipoprotenas sricas y TLF Purificacin-Normal sangre humana se ha obtenido de donantes sanos en ayunas y se enfra en hielo durante de transporte. La sangre se coagula para 2 b a temperatura ambiente y el cogulo se le permiti retirar a las 4 "C durante 2 h. El suero se separado del cogulo mediante centrifugacin a baja velocidad a los 18 C y residual de las clulas de sangre fueron retirados a partir del suero por centrifugacin a 9.500 rpm en un rotor SS-34 (Du Pont-Sorvall, Newton, CT). La la preparacin final del suero se ajust a 0,5 mM EDTA. VLDL y LDL fueron aisladas por centrifugacin despus de ajustar el suero con bromuro de sodio a una densidad de 1,063 g / ml (18 "C, 23 h, 50.000 rpm en una Ti70 rotor). HDL se aisl de forma secuencial despus de ajustar el sricos de LDL-deficiente a 1,26 g / ml (18 "C, 42 h, 50.000 rpm en una Ti70 rotor). El HDL se ajust a 1,17 g / ml de bromuro de sodio dilucin con solucin salina y se centrifug a 18 "C durante 38 horas a 50.000 rpm. Los dos tercios superiores del tubo que contiene el HDL de la densidad de 1.063- 1,17 g / ml se retir. El tercio inferior del tubo que contiene lipoprotenas de la densidad de 1,17 hasta 1,26 g / ml se recogi y se concentr 10 veces en un cono Centriflo filtro (CF-25, Amicon, Danvers, MA). La la muestra se diluy con PBS / EDTA y se concentr dos veces para eliminar el bromuro de sodio. Todas las muestras de suero fueron otros dializ frente a tres cambios de PBS / EDTA. TLF fue nuevamente purificada por filtracin en gel convencionales y adsorcin cromatografa en Sepharosa CL-GB (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y la hidroxiapatita (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). La etapa de purificacin final que participan de filtracin en gel HPLC, utilizando una columna TSK G3000SW (LKB, Suecia) y un doble sistema de bomba equipada con un monitor de rayos UV variable e integrado un colector de fracciones. Los detalles de la separacin cromatogrfica se se describe en la leyenda de la figura. 1. Active fracciones de cada

uno de purificacin paso se dializa frente a PBS / EDTA y se almacenan a -70 "C. El contenido de protena de suero de los preparativos diversos se determin por el mtodo de Lowry et al. (16), utilizando albmina de suero bovino como estndar. Lisis de los tripanosomas y ensayo-Una lnea celular clonal de T. b. brucei, ILTaT 1.3, se utiliz en todos los experimentos. Este es un antignicamente estable lnea celular que produce infecciones agudas, monomrfica en el laboratorio roedores. Para ensayar la actividad ltica de las muestras de suero, las mujeres suizas los ratones fueron inyectados por va intraperitoneal con 0,2 ml de un stock de congelados las clulas y la sangre de tripanosomas-infectados se recogi 3-4 das despus cuando la parasitemia alcanz 2.1 X 10 'tripanosomas / ml de sangre. Tripanosomas fueron separados de la sangre por elucin paso a paso de DEAE-celulosa (17), y se lavaron con F-12 a medio (Gibco) con 30 mM Hepes (pH 7.5) y 15% (v / v) fetal bovino suero (inactivado por calor). Tripanosomas se resuspendieron en el mismo medio a una densidad celular de 3 x 107/ml. lisis de los ensayos se llevaron a en las reacciones de 300 pl que contena 100 pl de la suspensin celular y 200 pl de las muestras de PBS o suero. Las clulas se incubaron a 37 "C durante 2 h, y el porcentaje de clulas lisadas se estim por contraste de fase microscopio a 400 aumentos. Una unidad de tripanosoma ltico actividad se define como la cantidad de muestra que lisadas 50% de la tripanosomas en 2 horas a 37 "C. Anlisis electrofortico de las fracciones de suero SDSpolyacrylamide-discontinuo electroforesis en gel se llev a cabo segn Laemmli (18). Protenas (10 pg) se disolvieron en tampn de muestra que contiene 5 mM Tris-HC1 (pH 6.8), SDS 0,4%, 4% de glicerol, y PG 0.55 / ml azul de bromofenol, con o sin mercaptoetanol 1%, como se indica en las leyendas de las figuras. Las muestras fueron calentadas a 100 'C durante 5 min y electroforesis a 150 V durante 5-6 h en geles de poliacrilamida al 15% 5% de poliacrilamida geles de apilamiento. Nativo 5% geles de poliacrilamida se prepararon en el 37,8 mM Tris-HC1 (PH 8.7) con un 1,6% de poliacrilamida de apilamiento de la capa en 6 mM Tris- HCl (pH 6.7). Las muestras (10 figura) se ajustaron a 5 mM Tris-HC1 (pH 6.8) de glicerol, 4%, y PG 0.25 / ml de azul de bromofenol y electroforesis a 100 V durante 5-6 horas en una solucin 25 mM Tris-HC1 y 191 mM de glicina (pH 8,3). Las protenas separadas a ambos nativos o SDSpolyacrylamide electroforesis en gel se visualizaron por tincin con Azul de Coomassie R-250 o tincin de plata. Las cantidades relativas de cada una de las apolipoprotenas TLF-asociados se estableci mediante el escaneo de densitometra de geles de poliacrilamida-SDS-Coomassie manchados. Para determinar la distribucin de la actividad ltica tripanosoma en el geles nativos de poliacrilamida, rodajas de 1 cm de ancho fueron retirados de la gel y las protenas se electroeluy. Las muestras fueron dializados contra PBS / EDTA antes del ensayo. Anlisis de electroforesis en gel bidimensional se realiz con purificada muestras TLF (10-50 pg) se ejecutan bajo condiciones no reductor en la primera dimensin. Despus de la electroforesis, los carriles (tiras de 1 cm) fueron retirados y empapado en 71 mM Tris (pH 6.8), 2.3% SDS, 10% de glicerol, y 50 mM ditiotreitol durante 2 horas a 37 "C. El segmento de gel era entonces integrado con el 1% de agarosa que contiene 132 mM Tris (pH 6.8) en un 60 V durante 12 h. 15% en gel

discontinuo de poliacrilamida-SDS y la electroforesis en Los anlisis de lpidos lpidos-TLF se extrajeron con cloroformo y metanol de acuerdo con el mtodo de Bligh y Dyer (19). Fosfolpidos fsforo se cuantific mediante el procedimiento de incineracin de Ames (20). Glicolpidos se cuantificaron por el eaction anthroner (21). Colesterol se cuantificarn mediante un kit de ensayo de colesterol en la sangre (Sigma). La peso molecular de los fosfolpidos se supone que es 850. La produccin de TLF-especfica del anticuerpo monoclonal-monoclonales anticuerpos contra las protenas TLF-asociados fueron preparados por fusin las clulas del bazo de ratones Balb / c inmunizados con TLF purificada. Ratones (hembras de 4 semanas de edad) fueron inyectados por va intraperitoneal con 60 gg de TLF purificada en una emulsin de 0,25 ml de adyuvante completo de Freund. Las inyecciones se repitieron a intervalos de un mes con 50 pg de TLF en una emulsin de adyuvante incompleto de Freund. Bazos se tomaron tres das despus de la njection lasti. Las clulas inmunes del bazo se fusionaron a P3X63 Ag8.653 clulas de mieloma de ratn (22). Conveniente hbridos se identificaron defendiendo los medios de comunicacin a partir de clones para la neutralizacin de la actividad TLF y por la unin a protenas TLF de Western blot (23). Hibridoma clon, FS.14, fue identificado por su TLF actividad neutralizante y se demostrado ser secretoras de anticuerpos contra una de 45.000 Da TLF-asociados protenas. Anticuerpos de neutralizacin de la actividad TLF-Adems de los TLFspecific monoclonales SF.14 dos anticuerpos monoclonales adicionales, AI- 4 y AII-1, se utilizaron en este estudio. Las propiedades de estos monoclonales anticuerpos han sido describedpreviously (15). Policlonal de cabra antisueros frente a las apolipoprotenas AI, AII, y B se obtuvieron de Boehringer Mannheim. Purificada TLF se mezcl con anticuerpo monoclonal anticuerpos o antisueros despus de varias diluciones en PBS. Las muestras fueron incubaron a 26 C durante 30 minutos, a una suspensin de 3 x lo6 tripanosomas en F-12, medio que contiene 15% de suero fetal bovino y 30 mM Hepes (pH 7.4), y se incub durante 2 horas a 37 'C.

RESULTADOS La purificacin del Trypanosoma lticas de Human Factor Los estudios anteriores de suero-Rifkin (5) mostr que los derechos humanos suero contena un factor que zadas por T. b. brucei. Tambin encontr que la mayora de la actividad con caractersticas de HDL y que los individuos con la enfermedad de Tnger, en los que la principal apolipoprotena de HDL, apo-AI, no madura normalmente, no TLF tienen en sus sueros. Anlisis de la ltica factor por filtracin en gel sugiri que no todas las partculas de HDL presentes en el suero humano se lisan tripanosomas y que una subclase de partculas contena la mayor parte de la actividad. Tomando ventaja de estas observaciones, se purifica an ms el factor, que llamamos factor de tripanosoma ltico (TLF), por la secuencia centrifugaciones densidad. Despus de la eliminacin de las VLDL y LDL del suero,

toda la fraccin HDL se purific mediante de flotacin en la densidad de 1,26 g / ml. En este paso en la purificacin de TLF, therew como inl estimulacin 3,3 veces la actividad que ytiC se mantuvo a lo largo de la purificacin posterior de TLF (Tabla I). Mezcla de HDL activa con la fraccin de suero que era ms denso que el 1,26 g / ml TLF actividad reducida a la que se encuentran en el suero intacto (datos no presentados). Estos resultados sugieren que ntagonist ana a TLFw como presente en humanos intactos suero y que sedimentan en la deficiencia de lipoprotena fraccin. Como se ha sealado anteriormente (5) y en el presente informe, intacta sueros de varios donantes difieren unas 50 veces en tripanocida actividad. Sin embargo, despus de la centrifugacin densidad a 1,26 g / ml, hemos encontrado que todos los donantes contenan cantidades comparables de actividad (datos no presentados). Fraccionamiento de HDL por centrifugacin de densidad mostraron que alrededor del 85% de la actividad TLF en el suero intacto sedimentado a una densidad de 1,17 g / ml, mientras que slo el 0,1% de la protena sedimentado en estas condiciones (Tabla I). Anlisis de la tripanocida actividad en la densidad de diversas fracciones mostraron que TLF se ha enriquecido a unos 500 veces despus de los 3,3 veces estimulacin de la actividad que haba tenido lugar se ha tenido en cuenta. filtracin del gel de TLF en Sepharosa CL-GB (Fig. 1A) mostr que la actividad ltica eluida de la columna en los principales borde de un pico de material que absorbe a 280 nm. Calibracin de la columna con globulares patrones de peso molecular indic que TLF tena un peso molecular relativo de aproximadamente 500.000. Las fracciones activas de la filtracin del gel se agrupados, concentrados, y se analizaron por cromatografa de hidroxiapatita, utilizando un gradiente lineal de fosfato de potasio a un pH de 6,8 a eluir TLF (Fig. 1B). Una vez ms, la actividad TLF no coincidir con el pico principal de material absorvente de UV y superpuesto el borde de salida. Nuestro ltimo paso en la purificacin de TLF se logr mediante la filtracin en gel HPLC (Fig. 1C). TLF cromatografa como una partcula de peso molecular relativa 490.000, de acuerdo con el valor obtenido por convencionales filtracin en gel. Aunque la actividad TLF no coincida con la pico principal de absorbancia UV-, se muestra a continuacin que esta preparacin se ve muy enriquecido para partculas nico. Una purificacin final factor de 8000 se logr y fue el rendimiento sobre Un 50%. Fuera de una unidad de sangre alrededor de 1 mg de altamente enriquecido TLF se obtuvo. Amplia centrifugacin en gradientes de bromuro de sodio puede alterar las propiedades de las HDL en suero. Para determinar si TLF fue alterado durante la centrifugacin, el suero estaba intacta cromatografa en CL-GB. TLF actividad eluy con un familiar peso molecular de aproximadamente 500.000 sugiriendo que la densidad de centrifugacin no alter thes zar de TLF. Como se muestra en la Tabla I, las mediciones de la actividad TLF fueron un tanto imprecisos, causando alrededor de un% de variacin veces en los resultados. Duplicar ensayos realizados en las mismas muestras variaban con frecuencia por un factor de dos. Esta imprecisin se causado en parte por la variabilidad en el ensayo de lisis tripanosoma, que depende de la evaluacin de la lisis celular mediante el examen microscpico del organismo. Algunos variabilidad puede deberse el estado fisiolgico de los tripanosomas, que dependa de la altura de la parasitemia y la salud de la animal de la que las clulas se obtuvieron. TLF purificada fue estable a 4 "C durante 1 semana, a -

20" C durante unas 4 semanas, y a -70 "C durante varios meses. No se ha intentado hecho para estabilizar la actividad con aditivos qumicos. La electroforesis de TLF purificado en poliacrilamida nativos geles (Fig. 2) mostr que TLF migran como una banda difusa entre la tiroglobulina (669.000 Da) y el apoferritina marcadores (443.000 Da). Gradiente de gel de electroforesis (5-X%), en el que la migracin de la muestra es proporcional al tamao de la partcula, mostr que TLF migran como si se tratara de alrededor de 550.000 Da (datos hown pobres). Las muestras de humanos intactos suero o LDL humanos no contienen material visible que migrado como TLF (Fig. 2), y el HDL (densidad 1,063-1,26 g / ml) y los inactivos HDL (densidad de 1.063 a 1.17 g / ml) emigraron ms y fue ms heterogneo que TLF. Estos hallazgos indic que TLF migrado a una posicin intermedia a un (HDL) - y fi-lipoprotenas (LDL). Para confirmar que la actividad ltica se asoci con el material marcado en el carril TLF (Fig. 2A), rebanadas de 1 cm de ancho se extrajeron de una gel sin mancha que haba sido electroforesis en las mismas condiciones. La elucin de las muestras de las rebanadas del gel y determinacin de la actividad tripanocida mostr que TLF coincidi con la gran banda de Coomassie azul manchado (comprese con la fig. 2, A y B). El comportamiento de TLF durante la ultracentrifugacin, filtracin en gel, y la electroforesis en gel nativo sugiri que era un TLF subespecies grandes de HDL. Microscopa electrnica de transmisin de las muestras teidas con cido fosfotngstico (22) mostr que la distribucin de dimetros de partcula de p! rified TLF era bimodal, con picos centrados en 150 y 200 A (Fig. 3C). Las partculas ms grandes se ausente de inactivos HDL (densidad 1.06! -1,17 G / ml, la figura. 3A), que tena un dimetro promedio de 110 A. Las muestras de un paso intermedio en la purificacin rgimen, tales como la fraccin activa de la cromatografa de hidroxiapatita (Fig. 3B), que figura 8. mezcla de partculas con dimetro promedio de 150 y A 180, que muestran que la purificacin plan de enriquecimiento de grandes partculas de dimetro. Sobre la base de los resultados de filtracin en gel (Fig. lC), electroforesis en gel de nativos (Fig. 2), y microscopa electrnica (Fig. 3C), se estima la pureza de correo tob TLF 50%. gradiente de densidad de equilibrio de centrifugacin purificada TLF indic que que su densidad de flotacin fue 1,21 a 1,24 g / ml (Datos no mostrados), lo que sugiere que la proporcin de protenas de los lpidos en estas partculas fue alta. Anlisis qumico de las partculas mostr que TLF contena 43% de fosfolpidos, el 10% el colesterol y steres de colesterol, el 6% glucolpidos, y el 41% de protena por de peso. TLF es una subespecie de los Derechos Humanos HDGSeveral caractersticas de TLF sugiere que la navegacin interior como una subespecie de menor importancia de suero humano HDL. En primer lugar, su alta densidad indic que TLF fue operacionalmente una partcula de HDL, mientras que la filtracin en gel y la transmisin microscopa electrnica muestra que el tamao de partcula fue mucho mayor que los tpicos de HDL. En segundo lugar, electroforesis en gel de nativos mostr que TLF no migraron con la espera una movilidad exhibida por el HDL a granel. Para estudiar si TLF era una subespecie de HDL se analiz la composicin de protenas de las partculas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS bajo condiciones no reductor (fig. 4). TLF contenida

apolipoprotenas Amnista Internacional (28.000 Da), EA1 dmeros (17.400 Da), CI (7000 Da), CII (10.000 Da) y CIII (9.300 Da). Estas protenas Tambin estuvieron presentes en muestras de suero intacto, HDL (1,063 a 1,26 g / ml), inactivo HDL (1.063 a 1,17 g / ml), activa HDL (1.17 a 1.26 g /ml), y TLF crudo de filtracin en gel convencional y cromatografa de hidroxiapatita. Adems de estos apolipoprotenas tpica, tres protenas importantes (Grupos A, b, yc) se enriquecieron en las muestras activas. La estequiometra relativa de las bandas A, B, C y protenas fue de aproximadamente 01:01:03 segn lo determinado por densitometra de Coomassie Bluestained geles. A pesar de la estequiometra de las tres protenas variada en las muestras de diferentes TLF los 3 protenas fueron consistentemente presente en activos preparativos TLF. Estos hallazgos sugiri que haba protenas nicas asociadas a TLF adems de las apolipoprotenas tpica de HDL. Para determinar la composicin del pptido b una banda, y c protenas, TLF se separ por primera vez por SDS-poliacrilamida electroforesis en gel en condiciones no reductoras seguido por electroforesis en condiciones reducidas en una segunda dimensin (Fig. 5). Bajo condiciones de reduccin de la Banda una protena complejo se resolvi en tres pptidos de 45.000, 36.000, y 13.500 Da, B y la protena b no resolvedi dos polipptido componentes de 65.000 y 8.500 Da; rotein whileB y cp se resolvi en dos componentes polipptido de 36.000 y 13.500 Da. Los 45.000 - 36.000 -, y 13.500-Da pptidos liberados de la banda y una banda de complejos de protena C no son protenas importantes en suero y puede llegar a ser nica para TLF. Debido a que nuestro reparacin purifiedp de TLF no fue homognea, la presencia de las apolipoprotenas AI, AII, CI, CII, y CIII podra haber sido duteo contaminantes HDL inactivo. Para estudio de este problema, se examin si el tratamiento previo de

o B que inhiben la actividad de TLF (Fig. 6). Dos monoclonales anticuerpos y un anticuerpo policlonal especfico para la apolipoprotena AI neutraliza la actividad ltica del purificada TLF (Fig. 6).

La inhibicin de TLF se redujo a 50% en la dilucin de la anticuerpos anti-apo-AI monoclonales por un factor de 180 y despus de la dilucin del antisuero policlonal en un factor de 700. La preincubacin de TLF con un anticuerpo monoclonal contra apo-EA1 tambin neutraliza la actividad ltica y tena el anticuerpo se diluye en un factor de 400 a disminuir la inhibicin de Un 50%. Tambin probamos los efectos de un anticuerpo monoclonal (SF.14) e fothr especfica de 45.000 Da protena TLF-asociados y encontr que el 50% de inhibicin de lisis T. brucei se logr a diluciones de 600 (datos no presentados). Por el contrario, el tratamiento de TLF con suero preinmune o antisuero policlonal preparado contra la apo-B, la principal apolipoprotena de las LDL, no tuvo ningn efecto en la actividad ltica si diluido 50 veces o ms. Estos hallazgos indic que era una subespecie TLF teniendo HDL apo-AI y apo-AII. La asociacin de la actividad TLF con una apolipoprotena AI partculas que contienen tambin se examin el Western blot de protenas de suero humano se ejecutan en geles de poliacrilamida nativos. Los anticuerpos monoclonales preparados contra el TLF 45000-Da protena (FS.14) y en contra de la apolipoprotena AI (AI-4) se utiliza para la sonda Western blot de suero humano intacto, nonlytic HDL (1.17 a 1.063 g / ml), y se purifica TLF (Fig. 7A). La monoclonales contra apolipoprotena AI reaccion fuertemente con el frotis de una lipoprotena, que corresponden a los principales Coomassie materiales teidos de azul en el nonlytic muestra de HDL. AI-4 tambin reaccion con mayor lentitud migrar difamacin TLF

(Fig. 7B). El TLF-monoclonal especfico (SF.14) reaccionaron exclusivamente con la lenta migracin de frotis de TLF en el TLF la muestra y slo dbilmente con la tincin de una lipoprotena de txicos HDL (Fig. 7C). La reactividad dbil de la SF.14 monoclonales con el HDL nonlytic fue muy probablemente debido a una pequea cantidad de degradacin TLF durante la purificacin ya que el cantidad de SF.14 reaccin de productos que con esta movilidad de nativos geles de poliacrilamida variado en diferentes preparaciones de TLF. La reactividad de los anticuerpos monoclonales AI-4 y en el oeste de SF.14 manchas de TLF apoy firmemente la interpretacin que TLF era una partcula de Amnista Internacional que contiene con varias apolipoprotenas nico. Como era de esperar, Western blot de las protenas separadas por TLF electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS mostr que antiapoanticuerpos monoclonales AI reaccion con la banda de protena a 28.000 Da y anticuerpos monoclonales anti-EA1 apo-reaccion con una protena de 17.000 Da (Fig. 8). Tambin se encontr que antiapoAI1 anticuerpos monoclonales reaccionaron con la protena b banda que se enriqueci en los preparativos TLF (Fig. 8B). Un Western blot de un recorrido en el gel de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras condiciones mostraron que la reaccin de la banda B con anti-apoanticuerpos EA1 fue abolida y la banda ya no estaba manchado por el azul de Coomassie (datos no presentados). Reduccin de la la muestra produce la forma monomrica espera de apoAI1 que emigraron a 8.500 Da. Estos resultados apoyan la resultados de gel de dos dimensiones que sugiere que b banda fue un complejo de apo-EA1 atl ind o isulfide-linkaget este otro

protenas. La importancia fisiolgica de disulfuro-ligado complejos se sugiri la observacin tbhye que la reduccin de TLF con ditiotreitol inhibe su capacidad de lisis de los tripanosomas (Datos no presentados y ref. 5). Mecanismo de Toxicidad TLF mediada por T. brucei-La disponibilidad de una preparacin ms purificada de TLF se le solicite que examinemos algunas de las caractersticas de la lisis celular reaccin. Rifkin (5) ha demostrado que la lisis de los tripanosomas por el suero humano se llev a cabo cerca de 30 minutos despus de las muestras se mezclaron. Esta fase de latencia tambin se observ en las reacciones que contenga unidades de 1 o 10 del purificada TLF (Fig. 9A), pero la tasa de lisis celular aument en proporcin a la concentracin de TLF. Este hallazgo sugiere la fase de latencia se define una reaccin que lysainsd precedida de clulas era independiente de la concentracin. Una pista sobre la naturaleza de esta reaccin inicial fue sugerido por un experimento en el que se examin la temperatura la dependencia de la actividad TLF. Tanto el suero humano y se purifica TLF causado la lisis celular que se produzca si la reaccin se llevado a cabo por encima de 17 "C (Fig. 9B), y la lisis no se produjeron debajo de esta temperatura, independientemente de cunto tiempo la reaccin se le permiti seguir adelante (hasta 6 h). Para determinar si haba una relacin entre el paso sensibles al fro y el retraso de la fase, se incubaron con T. brucei TLF durante 30 minutos a 17 "C y luego cambi la mezcla de reaccin a 37 "C (Fig. 9C, llena tringulos). El pretratamiento de las clulas a los 17 "C no acortar la fase de latencia, lo que sugiere que el paso que era sensible a las

17 'C precedi a la fase de latencia. Para confirmar esta hiptesis, pretratados con T. brucei TLF durante 30 minutos a 17 "C y eliminado TLF de las clulas por centrifugacin. Cuando las clulas lavadas posteriormente se incubaron a 37 C, se produjo despus de la lisis celular 30 min (Fig. 9C, plazas vacantes) y procedi de una manera indistinguible de la observada en las muestras de que TLF no haba sido eliminado. Estos resultados sugieren que en 17 "C las clulas consolidado o tom TLF suficiente para causar la clula lisis despus de que el bloque de la temperatura fue puesto en libertad. Una explicacin de estos hallazgos es que TLF se endocitosis en el tratamiento previo a los 17 "C.

DISCUSIN Los estudios anteriores de Rifkin y compaeros de trabajo (5, 8, 9, 25) demostr que un factor en el suero humano pueden lisar T. b. brucei y que purifica con HDL. En este trabajo hemos demostrado que el factor tripanosoma ltico (TLF) es una subclase de menores de HDL en suero humano y que la mayora c / thvea de las HDL en el suero humano no tiene actividad ltica hacia T. b. brucei. Como una subespecie de HDL, TLF tiene varios interesantes propiedades que lo diferencian de lo descrito previamente HDL subespecies: 1) TLF tiene una densidad de flotacin de alrededor de 1,22 g / ml, lo que la sita dentro de una subclase de muy alta densidad de colesterol HDL. 2) TLF emigra en menor medida que un lipoprotenas (HDL) y ms rpido que el P-lipoprotenas (LDL) en nativos de poliacrilamida geles. 3) TLF partculas son grandes en comparacin con otros clases de HDL, con un peso molecular aparente de 490.000 y un dimetro medio de 150 a 210 A. 4) Por lo menos tres las protenas se asocian con TLF que no se encuentran en HDL humano que carece de actividad tripanocida. Uno de estos protenas (una banda), parece estar compuesto de tres disulfidelinked protenas de 45.000, 36.000, y 13.500 Da. Banda B protena parece estar compuesto de apo-AI1 y otra protena de 65.000 Da. Banda de protena C es un dmero compuesto por un 36000 - y una protena de 13.500 Da. Por lo tanto, TLF es un grande, densa subclases de HDL que contiene protenas y tiene la nica capacidad inusual para la lisis de los tripanosomas.

Otras subespecies de HDL se han identificado sobre la base de diferencias de densidad y contenido de la apolipoprotena. Por ejemplo, HDL se pueden separar por ultracentrifugacin en subclases HDLz y HDL3, que reflejan sus diferentes contenidos de protenas y lpidos, especialmente colesterol. HDL3, el ms denso subclase, lleva el colesterol de las clulas y puede ser necesaria para el transporte inverso de colesterol desde los tejidos perifricos a la el hgado o las glndulas suprarrenales. La funcin de HDLz an no se conoce, pero puede representar un intermediario en el metabolismo de las VLDL y los quilomicrones a las partculas de LDL. TLF representa otro ejemplo de una subespecie de HDL que tiene un nica funcin biolgica, aunque ciertamente inusual. Este hallazgo sugiere que el tamao y la densidad heterognea de suero de HDL no se debe simplemente a la interconversin metablica de partculas, sino ms bien que las subclases discretos se sintetizan para fines especficos. A pesar de que no entienden el funcin de TLF en la fisiologa normal de los mamferos, es interesante a especular que es parte de la resistencia natural a infecciones parasitarias. La presencia de la disulfuro-ligado en TLF es intrigante. Hemos demostrado que la apo-EA1 en TLF existe como heterodmeros vinculados disulfuro-compuesto de una protena de 65.000 Da con homodmeros, as como AI1 apo-de apo-AII. En Adems, los complejos que contienen no apo-EA1 de 94.000 y 49.000 Da existen en TLF. Las funciones de estos complejos se no se conoce, pero el tratamiento de las partculas con ditiotreitol abolido TLF actividad, lo que sugiere que su asociacin covalente es necesario para la actividad tripanocida. Otros estudios han demostrado que las subclases de HDL puede contener las proteasas, lipopolisacrido, y 1ecithin: colesterol aciltransferasa (26), pero la asociacin de estos compuestos no aparece estar mediado a travs de enlaces disulfuro. El mecanismo por el cual TLF mata a T. b. brucei no es conocido. Estudios previos han sugerido que la lisis fue el resultado de un desequilibrio osmtico, pero esto parece ser un evento tardo en la reaccin. La fase de retardo en el inicio de la lisis sugiere TLF que podra ser tomado por T. b. brucei y que el evento primario en la lisis de los tripanosomas se produce a travs de la accin de TLF dentro de las clulas, quizs en endoctica vesculas. En las clulas eucariotas superiores, la incubacin de las clulas por debajo de 17 "C drsticamente bloquea la fusin de vesculas de endocitosis y lisosomas (27). Por lo tanto, nuestro hallazgo de que la lisis celular no se producen por debajo de 17 "C sugiere que TLF es absorbida por endocitosis. Tambin hemos encontrado que el intestino medio del insecto procclico etapa de desarrollo es resistente a la lisis mediada por TLF? Electrnica microscopia de los tripanosomas procclico mostr que organismos en la etapa de desarrollo tienen menos procclico vesculas endoctica en comparacin con aquellos en el torrente sanguneo de desarrollo etapas (28). Nuestros estudios no eliminan la posibilidad de que la lisis celular es la consecuencia de la interrupcin de la unin y el tripanosoma membrana plasmtica, ni excluye la posibilidad de lisis que es el resultado de un intercambio de colesterol o fosfolpidos entre la membrana plasmtica del parsito y TLF, como sugiere Rifkin (8, 9, 25). La disponibilidad de gran purificada

TLF hace posible el estudio de estos problemas utilizando mtodos radioqumicos para medir la absorcin y el metabolismo de TLF.

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