Universidade Federal de Pernambuco Centro de Tecnologia e Geocincias Departamento de Engenharia Qumica

ANLISE DE PROTENAS: CARACTERSTICAS E PESQUISA DE AMINOCIDOS EM OVOALBUMINA

Alunos: Jos Paulo Iago Jos Roberto

Recife Setembro de 2011

Introduo As protenas so as macromolculas mais abundantes nas clulas vivas. Elas ocorrem em todas as clulas e em todas as partes destas. As protenas tambm ocorrem em grande variedade e existem milhares de diferentes tipos, desde de peptdeos de tamanho relativamente pequeno at enormes polmeros com pesos moleculares na faixa de milhes. Elas so formadas por monmeros chamados aminocidos e que ao reagirem entre si eliminam gua e formam as protenas.

As protenas desempenham papis extremamente importantes, na maioria dos processos biolgicos, atuando como enzimas, hormnios, neurotransmissores, transportadores atravs das membranas celulares e outros. O desenvolvimento de metodologias para determinar protenas tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevncia em vrias reas do conhecimento, como por exemplo, em anlises clnicas, favorecendo o diagnstico de certas doenas

correlacionadas com a alterao da quantidade de protenas nos fluidos biolgica.

Os mtodos para a determinao da concentrao de protenas totais so muito variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas so as espectrofotomtricas no ultra-violeta e no visvel (UV-Vis). Entretanto os mtodos aplicados neste trabalho resumem-se apenas a determinao protenas e aminocidos de maneira qualitativa.

Sumrio
1. Objetivo ........................................................................................................................ 3 2. Materiais e Equipamentos ............................................................................................ 4 2.1. Materiais ................................................................................................................ 4 2.2. Equipamentos ........................................................................................................ 4 3. Procedimento Prtico .................................................................................................... 4 3.1. Coagulao de Protenas........................................................................................ 4 3.2. Solubilidade da Albumina ..................................................................................... 5 3.3. Reao Xantoproteica ............................................................................................ 5 3.4. Pesquisa do Triptfano .......................................................................................... 5 3.5. Reao do Biureto ................................................................................................. 5 4. Resultados e Discusses ............................................................................................... 6 4.1. Coagulao de Protenas........................................................................................ 6 4.2. Solubilidade da Albumina a Diferentes pHs ......................................................... 7 4.3. Reao XantoProteica............................................................................................ 7 4.4. Pesquisa do Triptofano .......................................................................................... 8 4.5 Reao do Biureto .................................................................................................. 9 5.Concluso .................................................................................................................... 10 6. Bibliografia ................................................................................................................. 11

1. Objetivo

O presente trabalho visa apresentar algumas tcnicas para identificao e determinao de aminocidos e protenas de maneira ilustrativa e didtica. Atravs da identificao destas espcies poder correlacionar os fatos experimentais s transformaes fsicas e qumicas que foram causadas pelas condies impostas a soluo de albumina.

2. Materiais e Equipamentos
2.1. Materiais Albumina cido Actico 10 % cido Clordrico 10% Solues Padro de pHs 2, 4, 7, 10 cido Ntrico Hidrxido de Sdio 10% Sulfato de Cobre cido Sulfrico Concentrado 2.2. Equipamentos Tubos de Ensaio (11) Pipeta 10 ml (14) Bico de Bunsen

3. Procedimento Prtico
3.1. Coagulao de Protenas

Adicionou-se 3 ml da soluo de albumina em um tubo de ensaio. Aqueceu-se em bico de bunsen por alguns minutos. Em outro tubo de ensaio adicionou-se 3 ml da soluo de albumina e adicionou-se gota gota cido Clordrico. Aps a adio da soluo cida de HCl observou-se uma mistura de aspecto viscoso e turvo. 3.2. Solubilidade da Albumina Colocou-se 2 ml da soluo de albumina em cada tubo de ensaio (quatro tubos), 2 ml da soluo de pH 4,0 para o tubo 1, 2 ml da soluo a pH 7,0 para o tubo 2, 2 ml da soluo a pH 10,0 para o tubo 3. A soluo padro de pH 2 no foi adicionada neste teste porque utilizou-se como substituto o tubo de ensaio do subitem 3.1, em que foi adicionado cido clordrico. Com a gradao do pH observou-se que a medida que o pH tendia para a basicidade a soluo tornava-se mais ialina e menos viscosa, fatos que atingiram sua plenitude em pH 10. 3.3. Reao Xantoproteica Adicionou-se 3 ml da soluo de albumina e em seguida 1 ml da soluo de cido ntrico em um tubo de ensaio. Aqueceu-se em bico de bunsen por alguns segundos e observou-se a formao de um precipitado amarelo. Aps isso foi adicionado 0,5 ml de hidrxido de amnio e assistiu-se a formao de uma colorao laranja ao precipitado. 3.4. Pesquisa do Triptfano Em um tubo de ensaio colocou-se 2 ml de cido Actico glacial e 2 ml de soluo de albumina. Agitou-se o tubo de ensaio e adicionou-se 5 ml de H2 SO4 concentrado tomando os devidos cuidados e fazendo-o escorrer pelas paredes. Constatou-se aparecimento de cor violeta na interface dos lquidos, indicando a presena de triptfano na composio da albumina. 3.5. Reao do Biureto

Colocou-se 3 ml da soluo de albumina em um tubo de ensaio e adicionou-se 5 gotas da soluo de Sulfato cprico 5%. Ao adicionar o sulfato cprico observou-se a formao de um precipitado. Adicionou-se em seguida uma soluo de NaOH 10%, gota a gota, at dissoluo deste precipitado. Houve aparecimento de colorao violeta, indicando a formao do complexo biuretocobre.

4. Resultados e Discusses
4.1. Coagulao de Protenas Quando as protenas so submetidas elevao de temperatura ou variaes de pH ecas sofrem alteraes nas sua configurao espacial e sua atividade biolgica perdida. No caso do experimento descrito no item 3.1 avaliou-se o comportamento da ovoalbumina aps o drstico aumento de temperatura e adio de HCl turvou a mistura e a deixou com aspecto viscoso. Na literatura, tal fato tem amparo no rompimento das ligaes de hidrognio que so mantidas pelos hidrognios e oxignios constituintes da molcula. Elevadas temperaturas fornecem energia suficiente para que essas ligaes possam ser quebradas, desfazendo toda a sua estrutura (helicoidal, geralmente) outrora mantida por essas ligaes apoiadas por atraes eletrostticas. Em geral, entre OC e 40C, o aumento da temperatura favorece a solubilidade das protenas. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cintica das molculas da protena, facilitando a interaco destas com o solvente. Entretanto, acima de 40C, as protenas comeam a precipitar: os movimentos moleculares tornam-se to intensos que os agrupamentos qumicos afastam-se para alm da distncia permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, as interaes como as pontes de hidrognio rompem-se e a protena adquire outra conformao, uma conformao inativa (desnaturada). Cada protena tem uma temperatura especfica de desnaturao e este , normalmente, um processo irreversvel. No que se deve a variao do pH observou-se que na medida em que o meio tornava-se mais bsico mais solvel era a protena ovoalbumina. A precipitao

da protena em meio cido se deve ao fato do pH caracterizar o equilbrio entre ons H+ e OH- de uma soluo e sua mudana afetar o equilbrio de ionizao de grupos cidos e bsicos de uma protena. Assim, mudanas no pH vo afetar a distribuio de cargas de uma protena e, conseqentemente, as interaes eletrostticas entre grupos da protena, entre a protena e o solvente e entre as prprias molculas do solvente. Assim em pHs muito cidos e muitos bsicos estas interaes, que mantm a solubilidade da protena, so muito afetadas devido ao efeito provocado pelas concentraes de OH- e H+. 4.2. Solubilidade da Albumina a Diferentes pHs As observaes obtidas podem ser explicadas da mesma forma como foi exposto no subitem 4.1, inclusive corrobora com a mesma. Observa-se que quanto maior a concentrao H+ mais turva a soluo, conseqentemente mais protena se precipita. Assim v-se claramente que a adio de H+ a soluo alteram as interaes eletrostticas das protenas quanto maior for sua concentrao no meio, ou seja, quanto mais cido maior perturbao eletrosttica do sistema maior a precipitao da protena. No caso de pH elevado o nion (OH-) capaz de se combinar com protenas que possuam resduos de aminocidos na forma de ctions, formando complexos insolveis. A Hidroxila ataca os centros hidrofbicos das protenas precipitando-as. 4.3. Reao XantoProteica Na realizao do procedimento experimental do subitem 3.3 observou-se a formao de um composto de colorao laranja-amarelado. Devido a cor do composto formado, esta reao conhecida como reao xantoproteica (xanto significa amarelo em grego) e ela caracterstica de alguns aminocidos que contm grupamentos aromticos que so derivados do benzeno. Esses grupamentos submetem-se a reaes especficas do benzeno e seus derivados, sendo uma dessas reaes a nitrao do anel benznico pelo o cido ntrico em meio alcalino. Essa reao de nitrao, quando usada para identificar a presena de um anel benznico ativado comumente conhecida como teste xantoproteico (devido a formao de composto amarelado).

Este tipo de reao a mesma que ocorre para a identificao da tirosina como foi realizado em laboratrio. A Reao para a identificao da tirosina mostrada na figura 1, abaixo.

Figura 1 Reao de nitrao da tirosina no teste xantoproteico Esta reao uma das reaes que ocorrem quando a soluo concentrada do cido ntrico entra em contato com a pele. A protena na pele contm tirosina e triptofano, que se sofrem nitrao e se coram de amarelo.

4.4. Pesquisa do Triptofano A reao que foi executada uma variao do teste de Hopkins-Cole, que especifica para a pesquisa aminocidos que possuem grupamento indlico. Em substituio ao cido glioxlico, usou-se o cido actico em presena de cido forte (H2SO4) e obteve-se o composto violeta. Isso ocorre devido a reao do cido actico com o grupamento indlico do triptofano, formando um produto cclico violeta.

Figura 2 Reao do teste de Hopkins-Cole. Fonte: Milio & Loffredo (2007).

4.5 Reao do Biureto O mtodo se baseia na reao do reativo do Biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o mais recomendado o trtaro de sdio 1. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica mostrado na figura 3. O mtodo do Biureto, portanto, desenvolve uma cor violeta em soluo aquosa resultante da reao da protena com o reagente mencionado. O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentarem em seis vezes a sensibilidade do mtodo do Biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo. Este mtodo pode sofrer interferncia de substncias que possam reagir com os ons cobre II. Existem na literatura vrios mtodos para se eliminar estas substncias, porm o recomendado por Zaia2 et al. (1998) a precipitao das protenas com cido tricloroactico e posterior solubilizao para determinao das mesmas. Algumas das substncias so mostradas na Tabela 1 e interferem na determinao de protenas totais pelo mtodo de Biureto: Bilirrubina, Amnio, Lipdios, Hemoglobina, Dextran-40 e 70, Peptdeos e aminocidos livres (His, Ser, Thr), Melanina, Tampo tris-HCl e glicose, Lactose e Amido.

Figura 3 Biureto e Formao do Complexo Quadrado Planar

5.Concluso

Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinao de protenas e aminocidos, porm, um deles essencial: o conhecimento, o mais preciso possvel, da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentraes aproximadas. Isto facilitar a identificao dos possveis interferentes e consequentemente ajudar na escolha do mtodo mais apropriado para cada situao. Outros fatores, tambm importantes, so a

sensibilidade necessria, que dependente da concentrao de protena na amostra e do volume de amostra disponvel; a rapidez e o custo da metodologia; e, no menos importante, o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no mtodo escolhido. Tem-se observado que muitas vezes a escolha de uma metodologia para a determinao de protenas totais feita com base na popularidade de um determinado mtodo e isto acontece em parte devido falta de trabalhos de comparao de metodologias. Portanto, acredita-se que muitos trabalhos deste tipo devam ainda ser desenvolvidos principalmente nas reas de anlises clnicas, cincias e tecnologia de alimentos.

6. Bibliografia
1.MILIO, F. R.; LOFFREDO, W. M. Qualitative testing for amino acids and proteins. Disponvel em: <http://www.cerlabs.com/experiments/10875404480.pdf >. Acessado em 01 de Setembro de 2011. 2.ZAIA, D.A.M,; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qumica Nova, n.21, v.6. 1998. p.787-793. 3.LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Princpios de bioqumica. 2. ed. So Paulo: Sarvier, 1995. 839 p. 4.SOUZA, Karina A.F.D; NEVES, Augusto. Caracterizao de aminocidos e protenas: reaes coradas. Disponvel em:<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_corada s.htm>. Acessado em 13 de Setembro de 2011.