ORIGINALES BREVES

Factores de virulencia y serogrupos 0 de Escherichia coli causantes de infecciones urinarias comunitarias

Miguel Blanco, Jorge Blanco, Jess Eulogio Blanco, M. Pilar Alonso*, Inmaculada Abalia**, Elena Rodrguez**, Jos Ramn Bilbao** y Adelaida Umaran***
Departamento de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago. Campus de Lugo. *Unidad de Microbiologa. Hospital Xeral-Calde. Lugo. Departamentos de **Enfermera y ***Microbiologa e Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad del Pas Vasco. Leioa. Vizcaya.

FUNDAMENTO: Determinar los factores de virulencia y serogrupos 0 de las cepas de Escherichia coli responsables de infecciones del tracto urinario comunitarias. MTODOS: Se investigaron 103 cepas de E. coli causantes de infecciones del tracto urinario en Bilbao. Los factores de virulencia detectados por tcnicas fenotpicas fueron: la alfa-hemolisina (HIy), el factor necrosante citotxico tipo 1 (CNP-1) y los tipos de hemaglutinacin resistente a la manosa MRHA III, IVa y IVb expresados por las cepas P fimbriadas o que poseen fimbrias P relacionadas. La serotipificacin se realiz empleando 163 antisueros 0. RESULTADOS: De las 103 cepas examinadas, 55 (53%) resultaron positivas para al menos uno de los factores de virulencia determinados, siendo el 41% HIy+, el 28% CNF1 + y el 48% de los tipos MRHA (lll, IVa o IVb) caractersticos de cepas P fimbriadas. Las cepas uropatognicas se repartieron en 27 serogrupos diferentes, pero el 68% pudo englobarse en 10 serogrupos (01, 02, 04, 06, 09, 018, 027, 073, 075 y 077) y el 36% solamente en 3 serogrupos (02, 04 y 06). El 97% (36/37) de las cepas pertenecientes a los tres serogrupos ms frecuentemente encontrados presentaron alguno de los factores de virulencia estudiados, frente a tan slo el 29%, 19/66 (p < 0,001), de las cepas englobadas en otros serogrupos. CONCLUSIONES: Nuestros resultados confirman la teora de la especial patogenicidad e indican que una proporcin elevada de las infecciones del tracto urinario comunitarias son causadas por cepas de E. coli

toxignicas (Hly+ y/o CNF-1+) que pertenecen principalmente a los serogrupos 02, 04 y 06 y expresan fimbrias P o fimbrias P relacionadas de los tipos MRHA III, IVa o IVb.
Palabras clave: Serodiagnstico; Escherichia coli; Infecciones urinarias; Infecciones por Escherichia.

Virulence factors and O groups of Escherichia coli isolates from community acquired urinary tract infections
BACKGROUND: The aim of this study was to determine the virulence factors and 0 serogroups of E. coli strains that cause community acquired urinary tract infections (UTI). METHODS: We examined 103 E. coli strains isolated from the urine of patients with UTI. The following virulence factors were investigated using phenotypic techniques: the -haemolysin (Hly), the cytotoxic necrotizing factor type 1 (CNF-1) and the mannoseresistant haemagglutination (MRHA) types III, IVa and IVb expressed by P fimbriated E. coli. Serotyping of 0 antigen was carried out by means of a microtechnique using 163 antisera. RESULTS: Fifty-five (53%) of the 103 E. coli strains examined showed some of the virulence factors investigated in this study; 41% of the strains were Hly+, 28% were CNF-1+ and 48% expressed MRHA types III, IVa or IVb. The uropathogenic strains characterized belonged to 27 different 0 serogroups. However, 68% were from one of 10 serogroups (01, 02, 04, 06, 09, 018, 027, 073, 075 and 077) and 36% were from one of only 3 serogroups (02, 04 and 06). Furthermore, the virulence factors were concentrated in strains belonging to the 3 serogroups most frequently detected. Thus, 36 (97%) of the 37 strains of these 3 serogroups showed virulence factors, versus only

Correspondencia: Prof. Dr. J. Blanco. Departamento de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de Veterinaria. 27002 Lugo. Manuscrito recibido el 29-6-1994; aceptado el 21-12-1994. Enferm Infecc Microbiol Clin 1995; 13: 236-241.

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19 (29%) of 66 belonging to other serogroups (p < 0.001). CONCLUSIONS: Our results support the special pathogenicity theory and suggest that many cases of community acquired UTI may be caused by a limited number of uropathogenic E. coli strains that produce toxins (Hly+ and/or CNF-1+) and posses P fimbriae or Prelated adhesins (with MRHA types III, IVa or IVb), and that usually belong to 02, 04 and 06 serogroups.

urocultivo y registrarse bacteriuria ( 105 UFC/ml), se realiz la identificacin de E. coli por mtodos bacteriolgicos clsicos. Las cepas se conservaron a temperatura ambiente en caldo nutritivo (Difco) con 0,75% (p/v) de agar. Las cepas control de referencia utilizadas fueron: MR199 (06: K13, CNF-1, Hly, MRHA III), MR48 (075: K95, CNF-1, Hly, MRHA III), C1212-77 (06:K2:Hl, FP, MRHA IVa) y C1976-79 (01:Kl:H7, FP, MRHA IVa). Fimbrias P y hemaglutinacin Las bacterias se sembraron en 5 ml de caldo MuellerHinton (37 C/5 das/esttico) y a partir del anillo-pelcula que se forma en la superficie del caldo se sembr en agar CFA (37 C/18 horas). La hemaglutinacin en presencia de manosa (MRHA) fue realizada en macroplacas de vidrio tal y como describimos previamente con detalle usando eritrocitos humanos en los grupos 0 y A, de ternera, cobaya, pollo, carnero y cerdo19. A una gota de suspensin bacteriana (1012 bacterias/ml en PBS, pH 7,4) se le aadi una gota de eritrocitos (3% en PBS) y otra de PBS con un 3% de D-manosa. Las macroplacas se balancearon durante 5 minutos a temperatura ambiente y seguidamente se incubaron a 4 C otros 5 minutos. Atendiendo a los espectros de hemaglutinacin, las cepas MRHA+ eran clasificadas en los tipos I a VI de nuestra clasificacin. La deteccin de fimbrias P tpicas se llev a cabo empleando el PF test de Orion Diagnostica. Brevemente, una gota de suspensin bacteriana se mezcl con una gota de solucin que contena partculas de ltex recubiertas con el receptor de las fimbrias P, el digalactsico -D-Gal(1-4)-D-Gal, empleando como control partculas de ltex sin el receptor de las fimbrias P20. Produccin y deteccin de toxinas La deteccin de Hly fue realizada en placas de agar sangre base con un 5% (v/v) de eritrocitos de carnero lavados dos veces. La produccin de CNF-1 se hizo en caldo de triptona-soja en presencia de mitomicina C y su deteccin se llev a cabo en monocapas de clulas Vero y HeLa siguiendo los protocolos descritos previamente en detalle19,21,22. Cada cepa fue sembrada en 5 ml de caldo triptona-soja (pH, 7,5), de Oxoid, contenidos en matraces Erlenmeyer de 50 ml y se incub en un agitador orbital (37 C/200 rpm). Cinco horas despus de la inoculacin se aadieron 20 l de una solucin de mitomicina C (0,125 g/l), de Sigma, para inducir la liberacin de CNF-1. Despus de 20 horas de incubacin, los cultivos se centrifugaron (6.000 g/15 minutos/4 C) y los sobrenadantes se conservaron a 4 C hasta el momento de ser ensayados en cultivos celulares. Los extractos con mitomicina C as obtenidos se ensayaron posteriormente en monocapas de clulas Vero y HeLa, empleando placas de plstico de 24 pocillos de fondo plano de 16 mm de dimetro. Un da antes de la inoculacin se repartieron 0,5 ml de medio RPMI con un 10% de suero fetal de ternera (Bio-Whittaker) y 105 clulas en cada pocillo. En el momento del ensayo el medio de mantenimiento se sustituy por 0,5 ml de medio esencial mnimo (MEM) con 0,05 mM de metilisobutilxanti-

Introduccin
Escherichia coli es el patgeno oportunista aislado con ms frecuencia de infecciones del tracto urinario (ITU). Las ITU son generalmente infecciones ascendentes causadas por cepas presentes en la flora normal intestinal que presentan factores de virulencia que les permiten invadir, colonizar y daar el tracto urinario provocando bacteriuria asintomtica, cistitis o pielonefritis1-3. La adhesin, mediada generalmente por fimbrias P u otro tipo de factores de colonizacin que presentan actividad hemaglutinante en presencia de manosa (fimbrias S y Dr, tipos III, IVa y IVb) es tal vez el evento ms importante en la patogenia de las ITU4-7. Adems de la adherencia, se ha demostrado que otros factores de virulencia pueden contribuir a la patogenicidad, tal es el caso de la produccin de alfa-hemolisina (Hly) y la sntesis del factor necrosante citotxico tipo 1 (CNF-1), la resistencia al suero y la expresin del siderforo aerobactina8-16. Se cree que varios de estos factores contribuyen conjuntamente a la virulencia del microorganismo, siendo sta multifactorial1-3. La mayora de las cepas de E. coli uropatgenas pertenecen a un limitado nmero de serogrupos 0 que predominan en todo el mundo. No obstante, se ha sugerido que los factores geogrficos pueden tener importancia en la frecuencia y distribucin de los diferentes serogrupos1-3,9,11,15-18. En este estudio hemos examinado la presencia de los factores de virulencia y hemos determinado los serogrupos 0 de 103 cepas de E. coli responsables de ITU comunitarias en Bilbao.

Material y mtodos
Cepas bacterianas Se investigaron 103 cepas de E. coli aisladas de otros tantos pacientes con infecciones urinarias adquiridas en la comunidad. Tras llevar a cabo el correspondiente

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na (Sigma) como inhibidor de la fosfodiesterasa y sulfato de polimixina B (50 n/ml) para impedir el crecimiento bacteriano. Tras la inoculacin de las clulas con 50 l de extracto con mitomicina C, se incubaron las monocapas a 37 C en una atmsfera con un 5% de dixido de carbono y los cambios morfolgicos se observaron con un microscopio invertido de contraste de fases, a las 5, 24 y 48 horas. En estas condiciones las clulas Vero son sensibles a la enterotoxina termolbil LT, a las verotoxinas (VT1 y VT2) y a los factores necrosantes citotxicos (CNF-1 y CNF-2); mientras que las clulas HeLa son afectadas nicamente por las verotoxinas y los factores necrosantes. Serotipificacin La determinacin del serogrupo 0 fue realizada empleando los 163 antisueros 0 (01-0171) por un micromtodo descrito con detalle en previas publicaciones22,23. La serotipificacin se llev a cabo en tres etapas: en primer lugar se realiz la identificacin presuntiva con 25 antisueros polivalentes, y segundo, con 163 monovalentes, a continuacin se realiz la confirmacin por titulacin. Todos los antisueros se absorbieron para eliminar las posibles reacciones cruzadas. La dilucin de cada antisuero individual en el suero polivalente fue de 1/40 o 1/80. Cuando una reaccin positiva era obtenida con uno o ms de los antisueros polivalentes (primer paso), la suspensin bacteriana era ensayada con cada uno de los antisueros monovalentes incluidos en el antisuero polivalente correspondiente (segundo paso). Si se produca una aglutinacin con uno o ms antisueros 0 monovalentes, se proceda a la titulacin confirmatoria (tercer paso). Se emplearon placas de microtitulacin de fondo en V en vez de los clsicos tubos de vidrio, y 50 l del antisuero diluido (1/40 o 1/80) y 50 l de la suspensin bacteriana con el antgeno 0 eran aadidos a cada pocillo. Las suspensiones bacterianas con el antgeno 0 eran preparadas por calentamiento (1,8 109 bacterias/ml) durante una hora a 100 C y 2,5 horas a 121 C. Para facilitar la lectura de las aglutinaciones, a las suspensiones con el antgeno 0 se les aadi un volumen igual de solucin salina formalinizada (0,5%, v/v) conteniendo violeta genciana (0,005%, p/v). Las suspensiones autoclavadas a 121 C fueron ensayadas exclusivamente con los antisueros 08, 09, 020 y 0101, mientras que las calentadas a 100 C se enfrentaron con los antisueros polivalentes y los correspondientes monovalentes. Los antisueros fueron adquiridos al National Institute of Public Health and Environmental Protection (Bilthoven, Holanda) y a los laboratorios Difco. Anlisis estadstico Los resultados fueron analizados usando el test de ji al cuadrado con la correccin de Yates para la continuidad en tablas 2 2.

TABLA 1. Factores de virulencia de E. coli uropatognicos

Factor de virulencia Cepas; n = 103

Alfa hemolisina (Hly) Factor necrosante citotxico tipo 1 (CNF-1) MRHA tipo III MRHA tipo IVa MRHA tipo IVb Fimbrias P* Cepas virulentas**

42 29 8 32 9 49 55

(41) (28) (8) (31) (9) (48) (53)

*Cepas que dan positivas en el PF test y/o pertenecen a los tipos MRHA III, IVa o IVb. **Con alguno de los factores de virulencia anteriormente citados. Entre parntesis, los valores en porcentaje.

lencia buscados en este estudio. Concretamente, 42 (41%) resultaron ser productoras de Hly, 29 (28%) sintetizaron CNF-1 y 49 (48%) expresaron tipos de MRHA (III, IVa o IVb) caractersticos de cepas P fimbriadas (tabla 1). Noventa (87%) de las cepas ensayadas resultaron ser tipificables con los 163 antisueros 0 empleados, repartindose en 27 serogrupos 0 diferentes. No obstante, 70 (68%) pudieron englobarse en tan slo 10 serogrupos, que por orden de frecuencia fueron: 06 (15), 02 (12), 04 (10), 073 (7), 018 (6), 075 (5), 01 (4), 09 (4), 027 (4) y 077 (3) (tabla 2). Los factores de virulencia se concentraron en las cepas de los tres serogrupos ms frecuentemente encontrados, ya que 36 (97%) de las 37 cepas pertenecientes a los serogrupos 02, 04 y 06 presentaron alguno de los factores de virulencia estudiados, frente a tan slo 19, que correspondan a un 29% (p < 0,001), de las 66 cepas pertenecientes a otros serogrupos (tabla 2). Adems, hemos comprobado que existe asociacin entre la produccin de toxinas y la expresin de adhesinas, ya que tipos III, IVa y IVb, caractersticos de E. coli P fimbriados, se detectaron en 37 (84%) de las 44 cepas toxignicas, frente a tan slo 12 (20%) de las 59 cepas no productoras de toxinas (p < 0,001) (tabla 3).

Discusin
E. coli es el microorganismo causal aislado con ms frecuencia en ITU, tanto nosocomiales como en las adquiridas en la comunidad, aunque su incidencia es mayor en pacientes no hospitalizados. En general, se acepta que la mayor parte de las ITU siguen una va ascendente y que son causadas por microorganismos presentes en la flora intestinal, aunque tambin ocasionalmente pueden producirse por rutas hematgenas. De hecho, se ha comprobado que normalmente la bacteriuria en

Resultados
En total, 55 (53%) de las 103 cepas examinadas presentaron al menos uno de los factores de viru238

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TABLA 2. Serogrupos y factores de virulencia en E. coli causantes de ITU comunitarias en Bilbao

Cepas Serogrupos Totales Hly+ CNF1+ III MRHA+ Virulentas* IVa IVb

01 02 04 06 09 018 027 073 075 077 Otros** NT***

4 12 10 15 4 6 4 7 5 3 20 13

0 6 9 15 0 3 1 0 2 0 4 2

0 5 8 9 0 0 1 1 2 0 2 1

0 1 1 2 0 0 0 1 2 0 1 0

1 5 8 8 0 3 1 0 0 0 5 1

0 5 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1

1 (25) 11 (92) 10 (100) 15 (100) 1 (25) 4 (67) 1 (25) 1 (14) 2 (40) 0 (0) 6 (30) 3 (23)

*Se consideraron cepas virulentas a las que presentaron al menos uno de los factores de virulencia estudiados: Hly +, CNF-l+, MRHA III+, IVa+ o IVb+. **Representados por menos de 3 cepas: 05(1), 07(1), 012(1), 013(1), 014(2), 015(1), 016(1), 020(1), 021(1), 028(1), 044(1), 083(2), 084(1), 086(1), 0102(1), 0128(2) y 0149(1). **No tipificables (negativas con todos los antisueros empleados). Entre parntesis, los valores en porcentaje.

TABLA 3. Tipos de MRHA tpicos de E. coli P fimbriados: relacin con la produccin de toxinas
Cepas Fenotipos txicos Total III IVa IVb MRHA Con adhesinas*

Hly+ CNF-1+ Hly+ CNF-1 Hly CNF-1+ Hly CNF-1

27 15 2 59

7 0 1 0

18 10 0 4

1 0 0 8

26 (96) 10 (67) 1 (50) 12 (20)

*Las adhesinas se detectaron en 37 (84%) de las 44 cepas toxignicas, frente a tan slo en 12 (20%) de las 59 cepas no productoras de toxinas (p < 0,001). Entre parntesis, los valores en porcentajes.

mujeres viene precedida por la colonizacin del introito vaginal y del rea periuretral; y es frecuente aislar las mismas cepas de E. coli de las heces y la orina de pacientes con ITU1-3. Se han desarrollado dos teoras para explicar la relacin existen-

te entre las cepas fecales de E. coli y las causantes de ITU: la teora de la prevalencia y la teora de la especial patogenicidad. La primera sostiene que la cepa presente en mayor abundancia en la flora intestinal es la que usualmente causa las ITU, mientras que la segunda apoya la hiptesis de que slo determinadas cepas con factores de virulencia son capaces de producir infecciones extraintestinales3. Aunque las implicaciones clnicas de los factores de virulencia no estn claras, parece ser que la expresin de adhesinas y la produccin de toxinas desempean un papel fundamental en las ITU del tracto superior de pacientes sin factores predisponentes locales (cualquier tipo de obstruccin al libre flujo de orina, anomalas anatmicas e instrumentacin del tracto urinario) y generales (embarazo, edades avanzadas y enfermedades de base). As, por ejemplo, Kllenius et al4 observaron que las fimbrias P estaban presentes en el 91% de las

TABLA 4. Frecuencia y distribucin de los serogrupos 0 ms comnmente encontrados entre E. coli uropatognicos aislados en diferentes pases
Bilbao n = 103 Galicia23: n = 252 Finlandia15: n = 148 Hungra11: n = 384 Inglaterra18 Hong Kong17: n = 427

01 02 04 06 09 018 027 073 075 077

(4) (12) (10) (15) (4) (6) (4) (7) (5) (3)

01 02 04 06 07 08 015 018 075 083

(3) (8) (8) (13) (3) (3) (3) (15) (4) (4)

01 02 06 08 016 018 025 075

(5) (7) (12) (4) (3) (4) (3) (9)

01 02 04 06 07 08 018

(4) (8) (4) (8) (3) (4) (3)

01 04 06 07 018 075

(7) (5) (10) (3) (5) (9)

01 02 04 06 08 021 025

(4) (8) (7) (5) (3) (4) (3)

Entre parntesis, los valores en porcentaje de cepas de cada serogrupo.

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cepas de E. coli aisladas de nios con pielonefritis sin factores de riesgo, mientras slo las expresaban el 7% de E. coli fecales de controles sanos. Domingue et al5 encontraron fimbrias P en el 100% de las cepas de E. coli aisladas de pacientes adultos no comprometidos con pielonefritis, frente a tan slo el 34 y el 38% de las obtenidas de cistitis y bacteriuria asintomtica, respectivamente. Ikheimo et al15 han comprobado, recientemente, que las cepas de E. coli responsables de infecciones nosocomiales posean pocos factores de virulencia, detectando las fimbrias P en tan slo el 11% de las cepas. Por lo tanto, en las ITU hospitalarias, debido a la frecuente cateterizacin y presencia de numerosos factores de riesgo, las cepas con pocos factores de virulencia consiguen causar estados patolgicos en los pacientes con sus defensas disminuidas. Los resultados obtenidos en nuestro estudio confirman la teora de la especial patogenicidad, ya que los factores de virulencia estudiados los hemos detectado ms frecuentemente entre E. coli uropatognicos que entre las cepas fecales control. As, 55 (53%) de las 103 cepas causantes de ITU presentaron al menos uno de los factores de virulencia examinados, frente a tan slo 24 (16%) de las 154 cepas fecales control aisladas de individuos sanos en un estudio previo (p < 0,001)23. En dicho estudio, realizado con cepas causantes de ITU nosocomiales y comunitarias en Lugo, comprobamos que los factores de virulencia eran ms frecuentes entre las cepas causantes de infecciones urinarias graves, como las pielonefritis (88%), que entre las procedentes de cistitis, que correspondan al 60% (p < 0,0l), y de bacteriurias asintomticas, que correspondan al 56% (p < 0,0l). E. coli uropatognicos responsables de infecciones comunitarias en Bilbao pertenecieron a los serogrupos 0 ms comnmente encontrados entre las cepas causantes de ITU en otras zonas geogrficas (tabla 4). Concretamente el 68% (70 de 103) pudo englobarse en 10 serogrupos (01, 02, 04, 06, 09, 018, 027, 073, 075 y 077) y el 50% (50 de 103) en tan slo 5 (02, 04, 06, 018 y 073). En Lugo encontramos resultados muy similares, ya que el 67% de las cepas uropatognicas se repartieron en 12 serogrupos (01, 02, 04, 06, 07, 08, 014, 015, 018, 022, 075 y 083) y el 44% pudo incluirse en tan slo 4 serogrupos (02, 04, 06 y 018)23. Andreu et al24, tras serotipificar 180 E. coli causantes de ITU aislados en Barcelona, comprobaron que el 72% poda englobarse en tan slo 6 serogrupos (02, 04, 06, 07, 075 y 083). Por lo tanto, nuestros resultados indican que existen pequeas diferencias en la frecuencia y distribucin de los serogrupos 0 en distintas zonas geogrficas y que las
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cepas de E. coli que causan ITU en Espaa pertenecen a los mismos serogrupos 0 que las aisladas en otros pases. Se ha sugerido que las cepas pertenecientes a los serogrupos ms comnmente encontrados entre E. coli uropatognicos deben poseer un mayor nmero de factores de virulencia que justifiquen su mayor prevalencia y patogenicidad1,3. Los resultados obtenidos en nuestro estudio apoyan esta idea, ya que hemos comprobado que los factores de virulencia se encuentran presentes especialmente en las cepas de los serogrupos ms comnmente encontrados. As, 36 (97%) de las 37 cepas pertenecientes a los serogrupos 02, 04 y 06 presentaron alguno de los factores de virulencia estudiados, frente a tan slo 19 (29%) de las 66 cepas pertenecientes a otros serogrupos (p < 0,001). Adems, hemos confirmado el carcter multifactorial de la virulencia de E. coli uropatognicos. En este sentido, hemos observado una clara asociacin entre la produccin de toxinas (Hly y CNF-1) y la expresin de los tipos MRHA III, IVa y IVb tpicos de E. coli P fimbriados. En resumen, podemos concluir que nuestros encuentros confirman la teora de la especial patogenicidad e indican que una proporcin elevada de las ITU son causadas por cepas de E. coli toxignicas (Hly+ y/o CNF-1+) que pertenecen principalmente a los serogrupos (02, 04 y 06) y expresan fimbrias P o fimbrias P relacionadas de 106 tipos MRHA III, IVa o IVb.
Agradecimientos
Este estudio ha sido financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (FIS 90-0447-2) y por un proyecto de la Universidad del Pas Vasco (UPV-078.352EA001/92). M. Blanco y J.E. Blanco agradecen a la Universidad de Santiago y a la DGICYT del Ministerio de Educacin y Ciencia la beca posdoctoral y de FPI que han disfrutado durante la realizacin de este estudio. En este estudio tambin han participado las tcnicos de laboratorio Cristina Prado Croas y Marta Ro Silva.

Bibliografa
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