Disciplina de Ecotoxicologia

Gentica Toxicolgica e Meio Ambiente:

uma abordagem terico-prtica

Teste do Microncleo

MSc. Rodrigo Juliano Oliveira

Laboratrio de Gentica Toxicolgica UEL Londrina PR. Centro de Estudos em Nutrio e Gentica Toxicolgica Londrina PR. Doutorando do Programa de Biologia Celular e Molecular UNESP Rio Claro SP.

Etiologia dos defeitos congnitos: Etiologia Gentica: Herana monognica: 20%; Alteraes cromossmicas (eventos clastognicos e/ou aneugnicos): 3-5%; Etiologia Ambiental: Radiao ionizante nucleares): <1%; Infeces pr-natais citomegalovirus): 2-3%; (teraputica, (rubola, exploses

Teste do Microncleo
Histrico e Aspectos Gerais
Estabelecido em clulas de medula ssea de camundongos Matter & Schimid (1971); Modificado para tcnica in vitro (linfcitos perifricos humanos toxoplasmose, deteco de agentes cancergenos) - Heddle (1973) e assim elucidou-se a origem do microncleo - Carrano & Heddle (1973);

Doena materna crnica (hipotireoidismo endmico, diabetes, fenilcetonria): 1-2%; Agentes ambientais e frmacos (talidomida, etilismo

Amplamente aceito pelas agncias internacionais e instituies governamentais / bateria de testes para estabelecer avaliao e o registro de novos produtos qumicos e farmacuticos - Choy (2001); Teste mais utilizado para deteco de agentes clastognicos (quebram cromossomos), e de agentes aneugnicos (induzem aneuploidia ou segregao cromossmica anormal) - MacGregor e cols. (1987); Hayashi e cols. (1994);

Definio: Microncleo: pequenos corpos contendo DNA e localizados no citoplasma; aparecem na telfase e so resultantes de fragmentos cromossmicos acntricos, originados de quebras isocromatdicas, cromatdicas, ou de disfunes do fuso mittico; podem haver um ou mais por clula;

no devem apresentar nenhuma conexo estrutural com o ncleo principal - Rabello-Gay (1991); Mersch e cols. (1996); Krisch-Volders & Fenech, 2001); possuem formato arredondado; cor e textura semelhante a do ncleo principal; possuir tamanho igual ou menor a 1/3 do ncleo principal; no podem ser birrefringente;

Teste do Microncleo in vivo

Teste do Microncleo em Medula ssea de Roedores

Caractersticas: o efeito do agente qumico observado em eritrcitos policromticos anucleados (PCEs);

os MN so facilmente identificveis e a sua distribuio bem definida; a freqncia de MN induzida em eritrcitos policromticos dependente do tempo de amostragem; os eritrobalstos, na medula ssea, sofrem uma

o eritrcito policromticos tem um tempo de vida curto qualquer microncleo (MN) presente certamente foi gerado como resultado de danos cromossmicos induzidos recentemente;

duplicao final dos cromossomos, aps o que se dividem e se diferenciam em eritrcitos policromticos;

Formao de uma clula micronucleada contendo um fragmento cromatdico acntrico. A induo do dano estrutural cromossmico na intrfase (a) resultando na formao de um fragmento cromatdico sem centrmero (acntrico) pode ser visualizado quando os cromossomos so condensados na metfase (b) da mitose. A reconstituio da membrana Processo de maturao das clulas da linhagem eritrocitria. Fonte: Mutagnese Ambiental, p. 175. nuclear ao redor do fragmento cromatdico produz um microncleo (c) o qual pode ser quantificado na clula filha formada aps a diviso (e). Fonte: Mutagnese Ambiental, p. 176.

Os MN aparecem nas clulas filhas, em decorrncia de danos induzidos nas clulas parentais; Fragmentos cromossmicos resultantes de quebras ou cromossomos inteiros podem no ser incorporados no ncleo principal das clulas filhas aps a mitose;
Formao de uma clula micronucleada contendo um cromossomo inteiro. A clula com dano no fuso mittico pode resultar em um cromossomo inteiro que no conectado aos microtbulos (b). Como esta clula sofre diviso, este cromossomo ir se atrasar durante a anfase e no segregar corretamente para o ncleo da clula filha (e). Fonte: Mutagnese Ambiental, p. 176.

Membrana nuclear se forma em volta do fragmento pequeno ncleo evidenciando o MN separado do ncleo principal;

Em ratos: MN - em eritrcitos policromticos (jovens); Em normocromticos; Rato = Homem Camundongo

Bao do camundongo no sequestra os eritrcitos com MN do sangue

Resultados Positivos - fortes evidncias de mutagenicidade ou sistmica; Resultados Negativos - suportam a concluso de que a substncia teste no mutagnica in vivo;

camundongos

em

eritrcitos

poli-

Metodologia
Espcies: camundongos / ratos - Sangue perifrico:

Doses a serem testadas: basea-se em dados de toxicidade considerando mesma espcie, linhagem, sexo, via, tempos de tratamento, durao do estudo; Estudo piloto: determinar a Dose Mxima Tolerada (DMT) - dose que no induz mortalidade, morbidade, toxicidade excessiva (sinais clnicos como diarria, falta de vontade de comer ou beber gua, perda de peso); DMT 2000mg/Kg/dia Estabelecer outras 2 doses inferiores (50 e 25% da DMT) - OECD (1977);

camundongos - CSGMT (1988); Sexo: machos / fmeas so usados indistintamente - CSGMT (1988); N de clulas / N de animais = 2000 PCEs / animal - 5 animais / tratamento; Animais em idade adulta (7 a 12 semanas) e saudveis; Pesos semelhantes (variao mxima de 20%);

Administrao: oral (dieta ou gua de beber), gavagem, intravenosa, intradermal; Melhor aquela que mais se assemelha exposio humana Protocolos: Agudo - Dose nica intraperitoneal, intramuscular, subcutnea ou

Protocolos: Agudo - Doses Mltiplas

Tratamento t0 t1 t2 t3 Colheita

Adaptao Tratamento - Dose nica Colheita

18 a 24 horas aps o tratamento

Adaptao

24 a 48 horas aps o tratamento

Protocolos de colheita:
Medula ssea - Fmur Lavagem do fmur com soro bovino fetal

Colorao (Giemsa)

Homogeneizao

Centrifugao Preparar lminas Desprezar o sobrenadante

Ressuspendender o pelete em 0,5ml de soro bovino fetal

Eritrcito policromtico micronucleado (a), sem microncleo (b) e normocromtico (c). Fonte: Mutagnese Ambiental, p. 189.

Teste do Microncleo em Cultura de Clulas (CHO-k1 / HTC)

Caractersticas:

Teste do Microncleo in vitro

Vantagens: Anlise mais simples quando comparadas a outros testes; Serve para diagnstico de doenas e monitoramento ambiental;

In vitro pode-se citar a identificao de clulas que completaram uma diviso nuclear; Alta sensibilidade; Alta preciso; Presta-se somente a tecidos que esto em Deteco de perdas cromossmicas e de no-disjunes; Medida da extenso e progresso da diviso nuclear; Deteco de eventos de reparo por exciso Vilela e cols. (2003); Salvadori e cols. (2003); constante diviso ou aqueles que podem ser submetidos a procedimentos de cultura; Quando in vitro a citocalasina-B pode interferir na deteco de compostos que tambm inibem a citocinese ou a polimerizao dos microfilamentos - Vilela e cols. (2003); Salvadori e cols. (2003); Desvantagens: Aplicvel somente a clulas que passaram por uma diviso celular aps o evento mutagnico;

Culturas Celulares: Vantagens: Material uniforme em Facilidade de padronizao das condies experimentais (densidade populacional, pH, temperatura, composio do meio de cultivo); Possibilidade de aplicao do tratamento em qualquer fase do ciclo celular; Ensaios econmicos; Boa reprodutibilidade; Clulas: V79, CHO-k1, HTC, HepG2; Organizao dos cromossomos e de seu DNA a mesma das clulas in vivo - Rabello-Gay e cols. (1991); Rodrigues (1991); comportamento; seus requisitos metablicos e

Vantagens: facilidade de crescimento em cultivo; pequeno n de cromossomos; ciclo celular curto (CHO-k1 - 12h / HTC - 24h); alta freqncia de metfases analisveis;

Desvantagens: caritipo varivel (CHO-k1 = 21 1 cromossomo / HTC = 42 1 cromossomo ou 63 1 cromossomos); populaes celulares no-sincrnicas; heterogeneidade nos tempos de ciclo celular; so celulas transformadas - Preston e cols. (1997);

Introduo:
Avaliao do mecanismo de ao da molcula -Glucana em testes de antimutagnese em clulas CHO-k1 (no metabolizadora) e HTC (metabolizadora), in vitro Alimentos Funcionais: exercer efeito metablico ou fisiolgico que contribua para a sade fsica e para a reduo do risco de desenvolvimento de doenas crnicas;
Mestrando: Rodrigo Juliano Oliveira Orientador: Mrio Srgio Mantovani

fazer parte da alimentao usual; possuir efeitos positivos obtidos atravs de quantidades no

Laboratrio de Mutagnese in vitro Departamento de Biologia Geral - CCB/UEL

txicas que devem persistir mesmo aps a suspenso da ingesto; no devem ser utilizados com o intuito de tratar ou curar doenas - Milner (1999);

Simbiticos renem todas as caractersticas anteriores

Prbiticos no sofrem hidrlise ou absoro no intestino delgado; quando atingem o clon, devem ser metabolizadas seletivamente por um n limitado de bactrias benficas e devem ser capazes de induzir efeito fisiolgico importante para a sade.

Introduo: -Glucana: parede celular de microorganismos (fungos e bactrias) e cereais; esqueleto central linear de molculas de D-glicose ligadas na

Alimentos Funcionais
Probiticos organismos vivos que ingeridos promovem efeito benfico no balano da flora bacteriana intestinal e na sade do hospedeiro

posio -(13) contendo cadeias laterais de glicose (ligao 16) de tamanhos variados que ocorrem ao longo do esqueleto central - Di Luzio e cols. (1979); Sandula e cols. (1995); fontes: aveia, cevada e cogumelos (mitake/shitake); Raymundo (2004);

Gibson, 1999; Comunicao Pessoal Nutricionista Clisia Mara Carreira

cereais - custo nutritivos massas, pes, biscoitos, tortas e farelos; no degradadas pelas enzimas humanas fibras alimentares - Soares e cols. (2000); investigao epidemiolgica, experimentos in vivo e in vitro ingesto (frutas e verduras ricas em cido ascrbico, fitoestrgenos e carotenides) cnceres e outras patologias - Flagg e cols. (1995); Weisburger (1999); Zhang e cols. (1999); Weishurger (2000); Ferrari & Torres (2002);

Caracterizao da atividade da -Glucana: estimulao do sistema inume infeces de origem bacteriana - Tzianabos & Cisneros (1996), viral - Reynolds e cols. (1980), fngica - Meira e cols. (1996), parasitria - Holbrook e cols. (1981); respostas envolvendo imunidade humoral (linf. B) e celular (linf. T) - Patchen & Mac Vittie (1983); Solts e cols. (1994); Falch e cols. (2000); Tokunaka e cols. (2000); Kubala e cols. (2003) ligada infeces e tumores malignos - Maeda e cols. (1996); Kogan e cols. (2002);

estimulao hematopotica: ativao de macrfagos Tsiapali e cols. (2001), neutrfilos - Rankin e cols. (1990) e clulas NK - Di Renzo e cols. (1991); efeitos antimutagnico: perxido de hidrognio - Slamenova e cols. (2003), doxorrubicina - Lin e cols. (2004) e ciclofosfamida Chorvatovicova e cols. (1996); Chorvatovicova e cols. (1998), Tohamy e cols. (2003); Objetivo: Avaliao do mecanismo de ao da molcula -Glucana em testes de antimutagenicidade em clulas CHO-k1 (no metabolizadoras) e HTC (metabolizadoras).

Material e Mtodos: Linhagens celulares: CHO-k1 / HTC; Condies de cultura: Meio D-MEN/F12 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Gibco), estufa do tipo BOD 37C, frascos de cultura de 25cm2, ciclo celular de 12h / 24h;

Agentes qumicos: metilmetanosulfonato (MMS) - Merck - 4,0 x 104M; 2-Aminoantraceno (2AA) - Acros - 1g/ml; -Glucana (-G) - Sigma - 5, 10 e 20 g/ml; Citocalasina-B (Cit-B) - Sigma - 2,5 g/ml;

Protocolos e Resultados Parciais: Protocolos de Avaliao de Mutagencidade

Clula CHO-k1 binucleada
24h

Tratamento de Pulso (3h) - CHO-k1

colheita 3h 17h

crescimento

tratamento

citocalasina-B

Tratamentos:

Clula CHO-k1 binucleada com microncleo

C - Controle; MMS - 4,0 x 104M; -G1 - 5g/ml; -G2 - 10g/ml; -G3 - 20g/ml;

Frequncia de MN

Protocolos de Avaliao de Mutagencidade: Tratamento de Pulso (3h) - HTC

60 40 20 0
a a a c b

colheita 48h 3h 30h

C
crescimento Tratamentos: C - Controle; MMS - 4,0 x 104M; 2AA - 1g/ml; -G1 - 5g/ml; -G2 - 10g/ml; -G3 - 20g/ml; tratamento citocalasina-B

MMS

B1 Tratamentos

B2

B3

Figura 01 - Freqncia de MN na avaliao da mutagenicidade da Glucana em clulas no metabolizadoras (CHO-k1)

Estatstica: t-Student

Frequncia de MN

80 60 40 20 0 C MMS 2AA B1 B2 B3
a b c a k1 a d

Protocolos de Avaliao de Antimutagencidade: Pr-tratamento (17h) e Induo de danos - Pulso (3h) - CHO-

colheita 7h 17h 3h 17h

crescimento

pr-tratamento

tratamento

citocalasina-B

Tratamentos
Figura 02 - Freqncia de MN na avaliao da mutagenicidade da Glucana em clulas metabolizadoras (HTC)
Estatstica: t-Student

Tratamentos: C MMS MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3

Frequncia de MN

Pr-tratamento (30h) e Induo de danos - Pulso (3h) - HTC

colheita 18h 30h 3h 30h

60 40 20 0
a b c c c

crescimento Tratamentos: C MMS MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 2AA 2AA+-G1 2AA+-G2 2AA+-G3

pr-tratamento

tratamento

citocalasina-B

MMS

MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 Tratamentos

Figura 03 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas no metabolizadoras (CHO-k1), em protocolo de prtratamento
Estatstica: t-Student

Frequncia de MN

60 % Reduo 40 20 0 MMS+B1 MMS+B2 Tratamentos

Figura 04 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas no metabolizadoras (CHOk1), em protocolo de pr-tratamento

40 30 20 10 0

b a

b b

2 +B 2A A

2A A

+B

...

...

...

2A A

MMS+B3

Tratamentos
Figura 05 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de prtratamento
Estatstica: Q-quadrado

Tratamento Simultmeo e Pr-incubao (3h) - CHOk1

colheita 24h 3h 17h crescimento crescimento tratamento citocalasina-B Tratamentos: Tratamentos: C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 Tratamentos: C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 Solues pr-incubadas por 1h em estufa BOD 37C C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 2AA 2AA+-G1 2AA+-G2 2AA+-G3

Tratamento Simultmeo e Pr-incubao (3h) - CHOk1

colheita 48h 3h 30h

tratamento Tratamentos: C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 2AA 2AA+-G1 2AA+-G2 2AA+-G3

citocalasina-B

Solues pr-incubadas por 1h em estufa BOD 37C

Solues pr-incubadas por 1h em estufa BOD 37C

2A A

+B

Frequncia de MN

60 40 20
a

75 % Reduo
b c c c

70 65 60 55 MMS+B1 MMS+B2 Tratamentos MMS+B3

0 C MMS MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 Tratamentos

Figura 06 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas no metabolizadoras (CHO-k1), em protocolo de tratamento simultneo
Estatstica: t-Student

Figura 07 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas no metabolizadoras (CHOk1), em protocolo de tratamento simultneo

Frequncia de MN

60 40 20 0

e f f f

% Reduo

150 100 50 0

2A A

+B

+B

+B

+B

+B

...

...

...

...

...

...

2A A

2A A

2A A

2A A

2A A

Tratamentos

Tratamentos

Figura 08 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de tratamento simultneo
Estatstica: t-Student

Figura 09 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de tratamento simultneo

2A A

+B

Frequncia de MN

60 40 20
a b c c c

0 C MMS MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 Tratamentos

90 85 80 75 70 65 MMS+B1 MMS+B2 Tratamentos MMS+B3

Figura 10 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas no metabolizadoras (CHO-k1), em protocolo de tratamento simultneo pr-incubao
Estatstica: t-Student

Figura 11 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas no metabolizadoras (CHOk1), em protocolo de tratamento simultneo pr-incubao

Frequncia de MN

% Reduo
d

50
a

b c

b d d e

% Reduo

100

80 60 40 20 0

2A A

+B

+B

+B

+B

...

...

...

...

...

...

+B

2A A

2A A

2A A

2A A

Tratamentos

Tratamentos

Figura 12 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de tratamento simultneo pr-incubao
Estatstica: t-Student

Figura 13 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de tratamento simultneo pr-incubao

2A A

2A A

+B

Ps-tratamento (17h) e Induo de danos - Pulso (3h) - CHOk1

colheita 24h 3h 17h

Ps-tratamento (30h) e Induo de danos - Pulso (3h) HTC

colheita 48h 3h 30h

crescimento crescimento tratamento ps-tratamento + citocalasina-B Tratamentos: C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3 2AA 2AA+-G1 2AA+-G2 2AA+-G3

tratamento

ps-tratamento + citocalasina-B

Tratamentos: C MM MMS+-G1 MMS+-G2 MMS+-G3

Frequncia de MN

60 40 20 0 C MMS MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 Tratamentos

a b b c c

60 % Reduo 40 20 0 MMS+B1 MMS+B2 Tratamentos MMS+B3

Figura 14 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas no metabolizadoras (CHO-k1), em protocolo de pstratamento
Estatstica: t-Student

Figura 15 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas no metabolizadoras (CHOk1), em protocolo de ps-tratamento

Frequncia de MN

c a

d e e d

% Reduo

60 40 20 0

300
b b b

200 100 0 -100

2 +B

2A A

+B

+B

...

...

...

B1

B2

B3

+B

2A A

2A A

2A A

S+

S+

S+

+B

2A A

Tratamentos

Tratamentos

Figura 16 - Freqncia de MN na avaliao da antimutagenicidade da Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de pstratamento
Estatstica: t-Student

Figura 17 - Porcentagem de reduo de danos na avaliao da antimutagenicidade da -Glucana em clulas metabolizadoras (HTC), em protocolo de ps-tratamento

Tipo Celular CHO-k1

HTC

Tratamento MMS B1 B2 B3 MMS 2AA B1 B2 B3

Protocolos de Mutagenicidade + + + + +

Tipo Celular CHO-k1

Tratamentos MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 MMS+B1 MMS+B2 MMS+B3 2AA+B1 2AA+B2 2AA+B3 Pr-Tratamento + + + -

HTC

Protocolos de Antimutagenicidade Simultneo Sim. Pr-incubao + + + + + + + + + + + + + + -

2A A

2A A
Ps-Tratamento + + + + + -

+B

Rodrigo Juliano Oliveira

rjoliver@hotmail.com