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Testes de quatro candidatos Vacina Leishmania em um modelo do rato de Infeco por Leishmania (Viannia) braziliensis, o principal causais Agente

da leishmaniose tegumentar no Novo Mundo? Avaliamos se quatro antgenos recombinantes anteriormente utilizado para a vacinao contra a infeco experimental com Leishmania (Leishmania) tambm pode induzir maior imunidade protetora contra um desafio com Leishmania (Viannia) braziliensis, a espcie responsvel por 90% do the28, 712 casos anuais de cutnea e mucocutnea leishmaniose registrados no Brasil durante o ano de 2004. Inicialmente, foram isoladas dos genes que codificam quatro homlogo antgenos L. (V.) braziliensis: (i) homlogo do receptor para quinase C ativada, (ii) antioxidante tiolespecfica, (iii) o alongamento Leishmania e do fator de iniciao, e (iv) L. (L.) protena stressinducible principais. No nvel de aminocidos deduzida, todos os quatro quadros de leitura aberta tinha um alto grau de identidade com os genes previamente descritos de L. (L.) principal que expressa em promastigotas e amastigotas de L. (V.) braziliensis. Estes genes foram inseridos no vetor ou pcDNA3 expressa como protenas recombinantes bacterianas. Aps a imunizao com plasmdeos recombinantes ou protenas, camundongos BALB / c gerados anticorpos especficos ou mediada por clulas respostas imunes (gama interferon produo). Depois de um desafio intradrmico com L. (V.) braziliensis promastigotas infectantes, no houve reduo significativa nas leses foi detectado. Conclumos que a imunidade protetora oferecidas por esses candidatos vacina contra a leishmaniose cutnea quatro experimental causada por L. (L.) major no poderiam ser reproduzidos contra um desafio com L. (V.) braziliensis. Apesar de negativo, consideramos nossos resultados importantes, pois sugerem que os estudos que visam o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra L. (V.) braziliensis, o principal agente causador da leishmaniose cutnea no Novo Mundo, deve ser redirecionada para antgenos distintos ou diferentes estratgias de vacinao. O protozorio parasita Leishmania (Viannia) braziliensis comumente causador da leishmaniose cutnea localizada (CL), no entanto, uma crnica da leishmaniose mucosa (LM) podem se desenvolver em alguns indivduos infectados, com manifestaes graves e progressivas (revisado em referncia 11). Actualmente, esta espcie represente mais de 90% dos 28.712 casos anuais de CL e ML gravado no Brasil em 2004 (7). Apesar de quimioterapias para CL e ML existem, existem vrias limitaes: (i) o tratamento medicamentoso raramente acessvel por aqueles que precisam deles, (ii) o tratamento medicamentoso requer injees dirias da droga por semana, (iii) o tratamento medicamentoso pode ser associado com efeitos colaterais, e (iv) resistncia a drogas est se tornando um problema crescente (13, 24; revisto em referncias 3 e 32). Para piorar a situao, o controle da CL e ML problemtico devido natureza silvestre de vetores e reservatrios, tornando o uso de inseticidas ea eliminao de reservatrios particularmente difcil (26). Devido a estas dificuldades, a longo prazo, o desenvolvimento de uma vacina eficaz pode ajudar tanto a preveno eo tratamento de CL e ML causada por L. (V.) braziliensis. A maioria dos estudos realizados at agora na vacinao contra genes CL usadas e / ou antgenos isolados e caracterizados a partir de Leishmania (Leishmania) major ou L. (L.) amazonensis (8, 31; revisto em referncias 9 e 21). Entre os principais candidatos para o desenvolvimento de uma vacina contra a CL, h homlogos do receptor para protena

quinase C (falta ou p36), Leishmania alongamento e fator de iniciao (Leif), L. (L.) protena induzvel grande stress 1 (LmSTI1), e tiol-especfica antioxidante (TSA) de L. (L.) major (5, 6, 10,14, 15, 28 e 30). Com base nessas perspectivas promissoras, o presente estudo foi desenhado para testar se quatro antgenos recombinantes anteriormente utilizado para a vacinao contra a infeco experimental com L. (L.) major (FALTA, LmSTI1, Leif, e TSA) pode tambm gerar uma imunidade protetora contra intradrmica (id) desafio com L. (V.) braziliensis. Consideramos esta questo muito importante porque, como mencionado acima, esta espcie responsvel pela maioria dos casos de CL e ML no Brasil e no Novo Mundo. MATERIAIS E MTODOS Parasitas e ratos. L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903 e MHOM / BR/01/BA788) e L. (L.) major (Friedlin tenso) promastigotas foram cultivadas em 26 C em 199 mdio (Life Technologies), suplementado com HEPES 40 mM, 0,1 mM adenina, 2 mM L-glutamina, 5 mg de hemina / ml (em trietanolamina 50%), 100 U de penicilina / ml, 100 mg de estreptomicina / ml, e 10% inativado pelo calor soro fetal bovino (todos da Life Technologies). Para L. cultura promastigotas (V.) braziliensis foi adicionado 2% de urina humana estril masculina. Os parasitas foram isoladas de fase estacionria na cultura (5 a 6 dias de idade). Amastigotas L. (V.) braziliensis foram obtidos a partir do osso do rato infectado derivadas da medula cultura de macrfagos (1). Suspenses amastigotas de L. (V.) braziliensis foram preparados pela ruptura de macrfagos infectados raspada da garrafa 48 h aps a infeco com as clulas foram rompidas promastigotes.These atravs de uma agulha calibre 22 e foram centrifugadas a 250? g por 10 min, o sobrenadante resultante foi centrifugado a 1400? g por 10 min, eo pellet foi ressuspendido em RPMI. A suspenso foi mantida sob agitao por 4 h temperatura ambiente e centrifugado a 250g por 10 min. O pellet final continha purificada amastigotas que foram essencialmente livre de contaminao por outras clulas (2). Camundongos BALB / c foram obtidos a partir da Universidade de So Paulo, So Paulo, Brasil. Os ratos foram mantidos sob condies livres de patgenos e utilizado em 6 a 8 semanas de idade. Os protocolos para os experimentos com camundongos foram aprovadas pelo Comit de tica da Universidade Federal de So Paulo-Escola Paulista de Medicina. Isolamento do DNA genmico, amplificao, clonagem de DNA e seqenciamento. DNA genmico de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis foi extrado essencialmente como descrito anteriormente (4). Amplificao dos quadros de leitura aberta (ORFs) dos antgenos de L. (V.) braziliensis foi realizado com primers especficos desenhados de acordo com as seqncias disponveis no GenBank. Resumidamente, para PCR foram utilizados 500 ng de DNA genmico de L. (V.) braziliensis, 200 pmol de cada primer, 10 mM mix trifosfato desoxinucletidos, 3 mM MgCl e PlatinumTaq DNA polimerase (Gibco-BRL) em um volume final de 50 ? l. A reao foi realizada em um primeiro passo de 5 min a 94 C e 35 ciclos, com o seguinte perfil trmico: 30 s em 94 C, 30 sa 50 C, e 1 a 2 min a 68 C, com uma etapa final de 7 min a 4 C. Os produtos de PCR foram colocados em um gel de agarose 1% e retirado a partir dele, eo DNA foi purificado com kit GeneClean II (Bio 101). Os produtos foram clonados no vetor pMOSBlue (Amersham-Pharmacia). Os

clones recombinantes selecionados foram seqenciados. Seqenciamento automtico de DNA de fita dupla foi realizada usando o Big Dye terminator ciclo de seqenciamento kit (Perkin-Elmer) em um ABI Prism 377 sequencer (Perkin-Elmer). DNA e previu seqncias de aminocidos foram analisados usando a verso do pacote DNASTAR 5,00 (DNASTAR, Inc.). Alinhamentos foram produzidas usando o programa W CLUSTAL. Para um vetor de expresso bacteriana, utilizou-se o PHIS, plasmdeo gentilmente cedidas por Peter Sheffield (University of Virginia) (27). O ORFs dos genes que contm as seqncias do site descrito restrio, para a clonagem direcional, foram retirados do vector pMOSBlue pelo tratamento com as enzimas de restrio especficos e ligados ao vetor PHIS tratados com as mesmas enzimas. Para a expresso eucaritica pcDNA3 comercialmente disponveis plasmdeo (Invitrogen, San Diego, CA) foi usado como o vetor de expresso de mamfero. Os plasmdeos recombinantes foram obtidos como descrito acima, usando o ORFs dos genes que contm os antgenos. Plasmdeos de imunizao foram obtidos atravs da insero da seqncia de nucleotdeos que codifica a imunoglobulina mouse? peptdeo cadeia de sinal (IgSP) no quadro com os 5? seqncia de nucleotdeos dos genes. A seqncia de nucleotdeos IgSP codificao foi gerado como descrito anteriormente (4). Os plasmdeos recombinantes foram produzidos em Escherichia coli DH5? e purificadas em gradiente de densidade de csio cloreto de acordo com protocolos padro (25). A concentrao de DNA foi estimada em 260 nm. Cada DNA plasmidial foi diludo em estril tampo fosfato (PBS) a uma concentrao de 1 mg / ml. Northern blot. RNA total foi isolado de 108 promastigotas e amastigotas de L. (V.) braziliensis e promastigotas de L. (L.) major usando o reagente Trizol (Gibco-BRL), de acordo com as instrues do fabricante. Para as anlises de Northern blot, RNA total foi ressuspendido em gua livre de RNase; equilibrada em um buffer contendo formamida, formaldedo e cido morpholinepropanesulfonic; aquecida por 30 min a 70 C; e fracionado em gel 1% agarose formaldedo (26). Uma escada de RNA que vo 0,24-9,5 kb foi usada como marcador de tamanho (Life Technologies). Gis foram fotografados e transferidos para membranas com 20? SSC (1? SSC 0,15 M NaCl alm de citrato de sdio 0,015 M), eo RNA foi fixado e inter-relacionadas com HybondN membranas por irradiao UV. Filtros foram prehybridized por 2 horas a 42 C em uma soluo de hibridizao contendo 50% (vol / vol) formamida (Sigma), 5? SSC, 5? Denhardt soluo, 10? G de tRNA (Sigma) por ml, e 100? G de salmo testes de DNA (Sigma) por ml. Os filtros foram hibridizados durante a noite a mesma temperatura com as sondas indicou marcado com [?-32P] dCTP (Amersham) utilizando um kit oligolabeling (Pharmacia Biotech) de acordo com as instrues do fabricante. Os filtros foram lavados em solues SSC (2? A 0,1?) Contendo 0,1% (wt / vol) dodecil sulfato de sdio (SDS) 42-50 C e expostas Hyperfilm (Amersham-Pharmacia) ou um sistema Typhoon (Amersham- Pharmacia). Expresso e purificao da protena recombinante. Os plasmdeos recombinantes obtidos foram transformados em E. coli BL21 (DE3) clulas hospedeiras (Novagen, Madison, WI). Expresso de protenas foram

realizadas como descrito anteriormente (30). As clulas foram colhidas a partir de culturas de 500 ml lote por centrifugao e ressuspendidas em 20 ml (0,1 M fosfato de sdio [pH 8,0], 10 mM Tris-HCl [pH 8,0]) contendo 2 mM de flor fenilmetilsulfonil. Tampo de ligao E. coli foi lisadas pela adio de 15 mg de lisozima e balanando por 30 min a 4 C, aps sonicao (quatro vezes por 30 s de cada vez), e depois centrifugada a 12.000 rpm por 30 min para sedimentar as clulas. Somente a protena TSA foi obtida como uma protena solvel. O protocolo foi continuado para obter a FALTA protenas insolveis, Leif, e LbSTI1. Resumidamente, os corpos de incluso foram lavadas trs vezes em CHAPS 1% {3 - [(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]1-propanesulfonate} em 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). As amostras foram girados a 12.000 rpm por 30 min para sedimentar os corpos de incluso. Estes foram finalmente solubilizado em 20 ml de ligao s protenas contendo 8 M de uria. Todos os antgenos recombinantes com resduos Sua tag lote foram obrigados a Ninitrilotriactico cido agarose resina (5 ml por induo de 500 ml) por balanar temperatura ambiente durante 1 h, e os complexos foram passados mais de uma coluna. O fluxo contnuo foi aprovado por duas vezes a mesma coluna, e foi lavado trs vezes com 30 ml cada de soluo de lavagem (0,1 M fosfato de sdio e 10 mM Tris-HCl [pH 6,3]) uria M tambm contendo 8. Protena ligada foi eluda com 30 ml de 100 mM imidazol em tampo de lavagem, e 3 ml-fraes foram coletadas. Nesta etapa final, as amostras foram analisadas por SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Imunizaes. Para realizar o ensaio de imunofluorescncia indireta (AII), camundongos BALB / c foram injetados na pata traseira (por via subcutnea) com 10? G de cada protenas purificadas recombinante (His6 FALTA, His6-TSA, His6-LbSTI e His6-Leif) em adjuvante completo de Freund (CFA). Aps 2 semanas os ratos foram injetados em um local um centmetro distal ao garupa com 10? G de cada protena recombinante com adjuvante incompleto de Freund (IFA). Camundongos foram sangrados com 7 dias aps a primeira dose e 10 dias aps a ltima dose. A frao de plasma foi obtido e armazenado a? 20 C. Vacinao DNA foi realizada conforme descrito anteriormente (4), utilizando os plasmdeos DNA recombinante isoladamente ou em conjunto. PcDNA3 vazio plasmdeo foi utilizado como controle. Ambos os msculos tibial anterioris foram injetados com 3,5? G de cardiotoxin (Sigma). Cinco dias depois, 50 g? De DNA plasmidial foram injetados por via intramuscular nos mesmos locais como para a injeo cardiotoxin (a g no total of100? de plasmdio por mouse). As doses subseqentes consistiram na mesma quantidade de DNA plasmdeo injetados 2 e 4 semanas aps a primeira dose imunizante. O protocolo de imunizao com as protenas recombinantes foi realizada pela administrao intraperitoneal de 25 g de cada protena purificada na presena de CpG ODN 1826 (10 g / dose / mouse;? Coley Pharmaceuticals, Wellesley, MA)? E hidrxido de alumnio 2% (alum; Superfos Biosector, Dinamarca), ou seja, 2,5 l / g de protena recombinante?. Alguns animais receberam todas as quatro protenas conjunto, dependendo da estratgia de imunizao. O grupo controle recebeu apenas CpG ODN 1826 e almen em PBS. Imunizaes foram realizadas pela administrao de trs doses dado 2 semanas de intervalo. O protocolo de imunizao antes do i.d. desafio consistiu de duas doses da

plasmdeos DNA recombinante seguido por uma ou duas doses de protenas recombinantes purificadas. Menos 2 semanas aps a ltima dose, os camundongos foram desafiados com promastigotas de L. (V.) braziliensis. Camundongos BALB / c foram desafiados i.d. como descrito anteriormente (20). Brevemente, as formas promastigotas cultivadas de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/01/BA788) foram ajustados a uma concentrao de 107 parasitas / ml em PBS, e 10? L foi injetado na derme da orelha de cada rato. A infeco foi monitorada por 9-10 semanas, e formao da leso foi medido uma vez por semana com um paqumetro direta. IIA. Macrfagos (105 clulas / lamela) estavam infectados com promastigotas de L. estacionria (V.) braziliensis (a uma razo de 10:1 parasita / clula); 48 h mais tarde, as lamelas foram usados em IIA. Promastigotas de L. (V.) braziliensis ou macrfagos infectados foram fixadas por 40 min em 3,5% paraformaldedo-PBS e lavadas trs vezes com PBS, ea soluo foi ajustado para uma concentrao de 107 parasitas por ml. Pores (10? L) da suspenso de parasitas foram mergulhadas em redondo, revestido lamnulas e deixar repousar durante a noite a temperatura ambiente. Lamnulas foram armazenadas a 20 C at o uso. Slides contendo promastigotas ou amastigotas macrfagos infectados foram bloqueadas com PBS contendo 2% de gelatina e 0,1% NaN3 e permeabilizadas com saponina a 0,1% (BDH; Amersham, Reino Unido) de gelatina em 0,2 e 0,1% NaN3 (PGN) e ento incubadas com amostras diferentes a partir de camundongos imunizados com protenas recombinantes (FALTA, TSA, LbSTI, ou Leif) diluda a 1:100 em PGN por 1 h em temperatura ambiente, lavadas trs vezes com PBS, e desenvolvido com coelho de imunoglobulina G (IgG) Cy3 conjugada anti- rato IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diludo 1:100 em PGN com 10? M DAPI (4?, 6?-diamidino-2-phenylindole) para um h 1 temperatura ambiente. Macrfagos infectados foram incubadas com um pool de soros de pacientes com leishmaniose mucocutnea diludo 1:100 por 1 h em temperatura ambiente, lavadas trs vezes com PBS, e em seguida incubadas com IgG de cabra isotiocianato de fluorescena (FITC) conjugada anti-IgG humana (Sigma ) diludo 1:50 para 1 h na presena de 10? M DAPI. Este corante DNA preferencialmente etiquetas DNA condensado e demonstra claramente kinetoplasts clula hospedeira nuclolos e parasita. Clulas controle no infectadas macrfagos foram submetidos ao mesmo procedimento. Aps trs lavagens com PBS, as lamelas e promastigotas em lamnulas foram montadas em glicerol tamponado com Tris 0,1 M (pH 8,6) e 0,1% parafenilenodiamina para reduzir branqueamento e observado usando um Optishot-2 microscpio de fluorescncia (Nikon). Imagens foram adquiridas em um Bio-Rad 1024UV sistema confocal acoplada a um microscpio Zeiss Axiovert usando um 63? NA x 1,4 Phan-Apocromtico (contraste de interferncia diferencial) O objectivo de imerso em leo. Immunoblot. Extratos de promastigotas de L. (V.) braziliensis (30? G de protena / lane) foram submetidos a SDS-PAGE 12% e transferidos para membranas de nitrocelulose. Membranas foram bloqueadas com 5% de leite em p desnatado em PBS e incubadas por 1 h com soros de camundongos BALB / c imunizados com as protenas recombinantes diludos 1:50. Depois de uma etapa de lavagem com Tween 20 0,05% em PBS, as tiras de nitrocelulose foram incubadas com conjugado com peroxidase anti-mouse e depois desenvolvido com diaminobenzidina e H2O2.

Ensaios imunolgicos. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) foi realizada essencialmente como descrito anteriormente (4). Clulas do bao coletados de imunizados camundongos BALB / c duas semanas aps a terceira dose imunizante foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 5? 10 5 M 2mercaptoetanol, 1 mM piruvato de sdio, 1% (vol / vol) soluo aminocido no essencial, e 1% (vol / vol), soluo de vitamina mnima essencial mdio (todos comprados Life Technologies);? 100 U de penicilina e estreptomicina (Sigma) por ml, e 10% (vol / vol) de soro fetal bovino (pH 7,4; HyClone, Logan, UT). As culturas foram mantidas a 37 C em uma atmosfera contendo 5% de CO2. A concentrao de clulas foi de 5 x106 clulas viveis por ml. O ensaio foi realizado em 96 poos de fundo plano placas (Costar), 0,2 ml de suspenso celular foi pipetado em cada poo, e os antgenos respectivos (protenas recombinantes) foram adicionados a uma concentrao de 10 g / ml?. Sobrenadantes foram coletados para determinao de citocinas aps 3 dias em cultura. Cada determinao foi feita em triplicado, os resultados so apresentados como meios? os desvios-padro (SD). A concentrao de interferon gama (IFN-) foi estimada por um ELISA de captura utilizando anticorpos disponveis comercialmente e citocina recombinante (PharMingen, San Diego, CA), como descrito anteriormente (23). A concentrao de citocinas em cada amostra foi determinada a partir de curvas padro executadas em paralelo com concentraes conhecidas de IFN-. O limite de deteco do ensaio foi de 0,2 ng / ml. Adeso nmeros GenBank. Os nmeros de adeso GenBank para o gene falta so as seguintes: AF363978.1, L. (V.) braziliensis; AF034804, L. (L.) maior; AF363974.1, L. (L.) donovani, L. (L . amazonensis), EU016104 e L. (L.) chagasi, EU016105. Os nmeros de adeso GenBank para o gene tsa so as seguintes: AF069386, L. (L.) maior; AF312397, L. (L.) chagasi, e AAL25847.1, L. (L.) donovani. Os nmeros de adeso GenBank para o gene Leif so as seguintes: Q25225, L. (V.) braziliensis e A81464, L. (L.) major. Os nmeros de adeso GenBank para o gene sti1 so as seguintes: AAB37318, L. (L.) grandes, e AAY88229.1, L. (L.) donovani.

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