D1003701

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA
DETERMINACION DE SELENIO EN SUERO POR ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCION ATOMICA
Memoria que para aptar al Grado de Doctor en Farmacia presenta
M~ VICTORIA SEIJAS MARTNEZ-ECHEVARRA Madrid, Junio 1992
FACULTAD DE FARMACIA QUIMICA INORGANICA Y BIOINORGANICA
Rafael Lozano Fernndez, Profesor Titular del Departamento de Qumica Inorgnica y Bionorgnica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrd, CERTIFICA: Que Da. Victoria Seijas Martnez-Echevarra ha realizado en el Departamento de Qumica Inorgnica y Bioinorgnica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid y en el Servicio de Bioqumica del Hospital Ramn y Cajal de la Seguridad Social de Madrid, bajo mi direccin, el trabajo que para optar al grado de Doctor en Farmacia presenta con el ttulo: DETERMINACION DE SELENIO EN SUERO POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA Y para que as conste, firmo el presente certificado. Madrid, Mayo 1.992
A mis padres, por su continuo buen ejemplo. A Luis, por ser mi mejor apoyo y estmulo.
AGRADECIMIENTOS
Al Profesor Rafael Lozano que desde cuando me imparta clases en la Licenciatura y durante todo el tiempo de este trabajo ha sabido contagiar su inters y entusiasmo y su acertada visin y entendimiento del campo de Investigacin en Qumica Bioinorgnica y el estudio de los oligoelementos. Su conocimiento ha sido claro en todas las preguntas, crticas y orientaciones. Tengo que agradecerle la dedicacin de su ya muy comprometido tiempo, y de una forma muy especial su carcter y simpata que han facilitado el trabajo.
A Asuncin Gil, a quien le debo mi primer inters en la Absorcin Atmica. Nunca olvidar que sin su empeo desinteresado nunca hubiese podido realizar este trabajo en el Hospit Ramn y Cajal.
A M~ Teresa Muoz por su apoyo.
As mismo agradezco la comprensin y el estimulo que me han prestado en todo momento los compaeros del Servicio de Bioqumica del Hospital Ramn y Cajal de la Seguridad Social de Madrid.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
A pesar de haber sido descubierto el selenio en 1817, no es hasta el ao 1957 cuando dicho elemento suscita un gran inters.
Anteriormente, el selenio era considerado un elemento que posea propiedades txicas en incluso mortales para la vida animal, sin embargo, a partir de la publicacin del artculo El selenio como parte integral del factor 3 contra la degeneracin necrtica heptica por Schawrz y Foltz en el cual informan de que una determinada dsis de selenio era capaz de prevenir la degeneracin necrtica del hgado, numerosos investigadores caracterizan diversos estados carenciales de selenio en el hombre, tanto de origen nutricional como patolgico, y la implicacin como factor de riesgo en el desarrollo de cnceres, de afectaciones cardiovasculares y de diversas enfermedades degenerativas.
Esta importancia que presenta el selenio en la vida humana, implica necesariamente el poder disponer de algn mtodo que permita analizarlo con gran exactitud.
Son muchos los mtodos descritos para la determinacin de selenio en materiales biolgicos y que permiten alcanzar los bajos niveles de selenio en suero o en sangre, con excelentes lmites de deteccin.
OBJETIVOS De todos ellos, el que presenta mayores garantas de exactitud y precisin es el anlisis
de activacin de neutrones, pero que no es practicable en un laboratorio clnico por precisar un reactor nuclear.
Otros de los mtodos publicados para el anlisis de selenio en material biolgico requieren una digestin cida del material orgnico, seguida por fluorometra o absorcin atmica con generacin de hidruros, para las cuales son necesarias grandes cantidades de suero poco practicables en la bioqumica clnica rutinaria y, desde luego, inapropiadas para las determinaciones procedentes de poblaciones peditricas.
Una de las tcnicas analticas que ms auge ha tenido en los laboratorios de anlisis clnicos en los ltimos aos es la espectrofotometra de absorcin atmica. Sin embargo, los reducidos niveles de selenio en suero humano se encuentran muy por debajo del rango analtico de la espectrofotometra de absorcin atmica en llama, cuyo lmite de deteccin es de aproximadamente 0, 5 ng/ml en solucin.
Respecto a los mtodos electrotrmicos de determinacin de selenio en suero con espectrofotometra de absorcin atmica, entre los cuales est la tcnica del horno de grafito, se pueden encontrar publicaciones contradictorias y confusas, probablemente ms que para ningn otro elemento qumico.
La tcnica de espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grailto wnsigue descender los lmites de deteccin al rango de partes por billn (p. p. b.) con una insirumen-
OBJETIVOS
tacin relativamente simple y sin los esfuerzos y prdidas de tiempo que conllevan las tcnicas de extraccin previa.
Por todo ello, uno de los objetivos que se han marcado en esta tesis doctoral ha sido el de poner a punto una metodologa que permita determinar el contenido de selenio en suero o sangre, mediante espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grafito, y que conduzca a la obtencin de unos resultados precisos y repetitivos.
Una vez puesta a punto la metodologa analtica necesaria y obtenidos los resultados, y en consecuencia haberse logrado nuestro primer objetivo, y con el fin de poder dar un uso clnico a las concentraciones halladas de selenio en suero humano, segundo objetivo de la presente tesis doctoral, se han debido establecer primero los valores de referencia entre una poblacin supuestamente sana.
Sin embargo, la salud no es una condicin bien definida, las fronteras entre la salud y la enfermedad son difusas, especialmente en el envejecimiento.
Para seleccionar una muestra de la poblacin de referencia hemos seguido los criterios del Comit de Expertos de la Federacin Internacional de Qumica Clnica.
Los individuos de referencia seleccionados provienen del Servicio de Medicina Preventiva del Hospital Ramn y Cajal.
OBJETIVOS Se han descartado todos aquellos individuos que sufren enfermedades sistmicas o
alteraciones fisiopatolgicas como la insuficiencia renal, enfermedad cardaca congestiva, enfermedad crnica respiratoria, enfermedad heptica o sndromes malabsortivos. en entrevista.
Otros criterios de exclusin han sido la obesidad, hipertensin y el alcoholismo.
PARTE GENERAL
PARTE GENERAL
L IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

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1.1.- INTRODUCCION
Descubierto en 1817 por Berzelius, el selenio ha sido considerado durante mucho tiempo como un elemento carente de toda propiedad biolgica. Es en 1957 cuando Schwarz y Foltz (1) establecen su papel esencial en la nutricin animal, y en 1973 Rotruck lo identifica como el centro activo del enzima glutation peroxidasa de los mamferos (2). A partir de este momento, el elemento no deja de suscitar un vivo inters entre los cientficos que caracterizan diversos estados de deficiencia humana en selenio, de origen nutricional o patolgico, y la implicacin como factor de riesgo en el desarrollo de cnceres, de afectaciones cardiovasculares y de diversas enfermedades degenerativas.
Algunos pases como Finlandia (3>, China (4)(5) y Nueva Zelanda (6) decidieron aportar suplementos de selenio a la poblacin como profilctico, y surgi la necesidad urgente de reunir de forma crtica y exhaustiva toda la informacin sobre las implicaciones probadas o potenciales del selenio en nutricin y en medicina humana.
L- IMPORTANCIA NUTRJCJON,4L DEL SELENIO 1.2.- IMPLICACIONES PROGRESIVAS DEL SELENIO EN BIOLOGIA
Antes de 1957, el selenio era considerado un elemento que posea propiedades txicas. Varios autores lo identificaron como el responsable de intoxicaciones agudas o crnicas mortales para los animales que pastaban en zonas con concentraciones particularmente elevadas de selenio en los forrajes. La forma aguda de intoxicacin fue descrita en animales que ingeran selenio en cantidad de 50 gglg. Los sntomas son: hipersudacin, taquicardia, hipertermia clicos y diarreas, cada de las crines y de la cola y lesiones en la crnea que pueden causar ceguera.
La forma crnica o enfermedad alcalina (se le atribuy a la alcalinidad de las aguas) resulta del consumo de dosis ms moderadas de selenio (10 30 zg/g). Se traduce en el ganado
-
ovino y bovino por : piel rugosa, lasitud, hipertrofia del hgado, del
knzQ,
del pncreas
inflamacin de los vasos linfticos, anemia, hiperbilirrubinemia y leucopenia
Es en 1957 cuando Schwarz y Folz (1) publican su famoso articulo: El selenio como parte integral del factor 3 contra la degeneracin necrtica heptica. Estudiando la etiologa de una enfermedad de carencia nutricional, descubrieron que el selenio era de hecho el llamado factor 3, el cual, asociado a la vitamina E y a los aminocidos azufrados, era capaz de prevenir la degeneracin necrtica del hgado.
Se puede asegurar una proteccin total de todos los animales con la administracin oral de 0, 0133 mg de selenito de sodio pentahidratado por 100 mg de alimento(de hecho (1. 04 ig/g
IMPORTANCiA N(JTRCIONAL DEL SELENIO
de alimento). Esta dosis es 100 veces menor que la dosis txica crnica situada entre 3-4 ppm de selenio. En ciertos casos la vitamina E se revela eficaz (7) pero a una dosis 500 veces superior a las de selenio (8). Lo mismo sucede para la L-cstina, pero a dosis 25. 000 veces superior (9).
El descubrimiento de Schwarz y Foltz supuso una revolucin en la profilaxis y el tratamiento de un cierto nmero de afecciones animales relacionadas con la deficiencia de vitamina E (10). La importancia econmica de estos descubrimientos es considerable. En un primer plano de estas afectaciones se sitan las distrofias musculares de jvenes rumiantes, de caballos, de cerdos, as como cardiomiopatas. Se encuentran igualmente lesiones hepticas en el cerdo, pancreticas e intestinales (11), as como el edema exudativo.
En 1966 estudios veterinarios informan de que un 50 -80% de las vacas francesas sufran el sndrome de la miopata que afecta principalmente a los msculos de la regin lumbar.
La responsabilidad del selenio qued claramente establecida por Klaus Schwarz en 1973 (12). Se estableci que una alimentacin equilibrada en vitamina E, con un mnimo de 1 ,glg de selenio es suficiente para evitar la aparicin de la enfermedad.
Por el momento, la incorporacin de selenio a los forrajes est prohibido, el elemento figura en la tabla de sustancias txicas. Sin embargo, la inyeccin de 3 mg de selenio como selenito sdico a las vacas jovenes, asociado a 250 mg de a-tocoferol, aporta una buena proteccin.
lo
IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO Durante todo este perodo, el modo exacto de accin no era conocido. Por analoga con
la vitamina E se estimaba su papel como antioxidante, particularmente en la peroxidacin lipdica. En 1973 Rotruck y cols. (2) demuestran la presencia de selenio en el centro activo del enzima glutation peroxidasa de los mamferos, interviniendo en el metabolismo del perxido de hidrgeno y de los perxidos lipdicos (10)(13fl14).
Posteriores estudios sobre la estructura, sntesis y funcin de la glutatin peroxidasa han sido publicados por Sunde y Hoekstra (15). Este descubrimiento clarifica las relaciones metablicas (16) entre el selenio y la vitamina E : el elemento asegura la destruccin de los perxidos que no pueden ser prevenidos por la vitamina E (17), demostrndose as su actuacin sinrgica en la quimioprevencin del cncer (18).
Un informe publicado en 1973 por el Comit de expertos de la OMS seala que
~i
selenio es un oli2oelemento esencial ciue no nuede ser reemniazado por otros nutrientes. la vitamina E por ejemplo ~
A partir de este momento el selenio despierta un vivo inters en la alimentacin humana.
1.3.- NECESIDADES Y APORTES DE SELENIO EN
HUMANOS
En los alimentos, el selenio se encuentra presente exclusivamente en forma de compuestos orgnicos (fundamentalmente selenometionina, selenocisteina y selenocistina). La
II
IMPORTANCIA NUTRICIONL4L DEL SELENIO
cantidad de selenio que se consume es funcin de la concentracin y de la disponibilidad biolgica del elemento en suelo. Muchas regiones del mundo producen alimentos que contienen cantidades del elemento perfectamente adecuadas para satisfacer las necesidades de los animales y del hombre (19), pero otras regiones producen nutrientes cuyo contenido en selenio es insuficiente para la prevencin de sntomas de deficiencia (inferior a 0, 1 gg/g). Estas regiones incluyen ciertas zonas de Estados Unidos (20), Finlandia (21), Noruega (22), Nueva Zelanda (6)(23) y algunas provincias de la Repblica Popular China (24)(25)(26) (zonas que sufren la enfermedad de Keshan).
En muchos paises del mundo, la nutricin de los animales lleva aportes de selenito o selenato sdico (27)(28) que implican un aumento mnimo en el aporte nutricional humano.
En las regiones donde el selenio del suelo no sobrepasa en mucho la concentracin mnima, o es poco disponible, el contenido en selenio de los alimentos va generalmente a la par con su riqueza en protenas.
Los granos y los productos cereales son particularmente ricos en selenio, pero solamente en ciertas regiones. Algunos autores dan una relacin directa entre la concentracin en selenio de los cereales y la concentracin sangunea media en los consumidores de estos productos (29).
De una forma general las carnes, pescados y los mariscos, as como las nueces y los huevos, son muy buenas fuentes de selenio. Por el contrario, las frutas y las legumbres (salvo
12
IMPORTANCIA AJUTRICIONAL DEL SELENiO
los championes y los ajos), la leche y los productos lcteos (salvo ciertos quesos), las materias grasa y las aguas de bebida son fuentes muy pobres (30).
En lo que concierne a las carnes, los contenidos varan entre
0, 10 y 0,
30 Mgg, segn
las publicaciones. En los animales que son convenientemente aprovisionados de selenio, sus protenas presentan aproximadamente l~g/g.
La leche de vaca slo aporta 0. 02 pg de selenio por litro (31).
Los pescados y mariscos tienen un contenido en selenio significativo desde el punto de vista alimentario; sin embargo, la disponibilidad biolgica del elemento (20 a 50%) es limitante, y varia en funcin de la unin al mercurio y otros metales pesados.
Contrariamente, la disponibilidad del selenio en los cereales, la cerveza y la mayor parte de los productos vegetales es elevada (85 a 100%).
El contenido de selenio es particularmente elevado en el ajo y la cebolla (0, 5 a 3 pg/g), los championes (1, 5 a 2 $g/g), las coles y los frutos secos (32). Estos diversos factores dan origen a importantes variaciones en la cantidad de selenio consumida por los hombres en las distintas regiones del mundo.
Estas diferencias se reflejan directamente en las tasas sanguneas de los individuos, como refleja la tabla siguiente.
13
IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO
TABLA DE CONCENTRACIONES SERICAS EN LAS DIFERENTES REGIONES DEL MUNDO:
PAISES
REF. BIBLIO.
CONC. Se jtg/l
China Nueva Zelanda Finlandia Noruega Blgica Francia Japn Polonia E.E.U.U.
4,5,33,34 6, 23 3, 21, 29, 35 22 36 37 38 39 20
<20 30 - 50 45 + 20 55-107 88+ 17 78+14 9 151 + 34 78 60-220
50
24 30 15 30 NO 99
Las necesidades de selenio en humanos ahora son relativamente conocidas. En 980, el Consejo Nacional de Investigacin de E. E. U. U. para la Comida y la Nutricin recomendaciones concernientes al aporte ptimo (inofensivo y adecuado) de selenio. pubhc las
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TABLA DE APORTES DIARIOS OPTIMOS DE SELENIO
EDAD (AOS)
APORTE OPTIMO sg/da
Nios jvenes
0-0,5
0,5-1 1-3 4-6 7-10
10-40 20-60 20-80 30-120 50-200 50 - 200 50 - 200
Adolescentes Adultos
11 - 20
El trabajo publicado por Levander (40) demuestra que los norteamericanos necesitan una dosis diaria de 1 ~g de Se por kilo de peso corporal para mantener constante su balance de selenio(en hombres unos 75 ~g;n mujeres unos 57 sg). Las necesidades humanas de selenio e marchan paralelas a la masa corporal media. Sin embargo, hay marcados contrastes con los consumos habituales de las regiones pobres en selenio (por ejemplo los 24 ~g de las mujeres neozelandesas) (6M41)(42) lo cual sugiere que la necesidad humana de selenio depende de la ingesta anterior del elemento.
IMPORTANCIA NUTRIClONAL DEL SELENIO La necesidad humana mnima de selenio, necesaria para evitar las manifestaciones de
deficiencia, se deben estudiar en las personas que viven en regiones selenoprivadas, como la poblacin neozelandesa, que consume de 28 a 32 ~g de Se por da, y no presenta signos clnicos de deficiencia (43).
Se puede establecer que la necesidad mnima en este pas es de 20 sg/da.
En China (24)(25)(26), la enfermedad de Keshan (enfermedad cuya etiologa es la deficiencia de selenio) no aparece si el aporte alimentario medio es superior a 30 ~g por da.
Los conocimientos son ms numerosos en lo que concierne al aporte alimentario en paises europeos, en los que se estima una ingesta de 50 a 60 ~g por da.
Estos valores deben ser transpiantables a Espaa, que, pese a tener un rgimen ajimentario distinto, en una primera estimacin, no est expuesta a una carencia de selenio.
Esta afirmacin debe ser reexaminada a la luz de los resultados de las investigaciones de diversos factores que estudien el estado selnico (8), que sern ms sensibles a una evidencia de dficit marginal.
Uno de estos parmetros estudiados debe ser, segn la bibliografa la actividad de la glutation peroxidasa plaquetaria, despus de un aporte suplementario de selenio (13)(44)(45).
IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO 1.4.- METABOLISMO DEL SELENIO
La mayor parte de las formas alimentarias de selenio (aminocidos selnicos y selenio inorgnico de los complementos nutricionales), son eficazmente absorbidos a nivel duodenal y en el leon anterior (46). Esta constatacin sugiere que los seres vivos no poseen mecanismo regulador de la absorcin. El selenito (11) no es distinguido del sulfito por los sistemas biolgicos. El selenato y el sulfato podran entre ellos entrar en competicin en la absorcin. Existe una competicin semejante para el transporte de la metionina y de sus anlogos selnicos (transporte activo).
En los animales monogstricos, como los hombres, la absorcin de la selenometionina es generalmente ms elevada que la del selenito (80% frente al 50%). En estos demuestran que la absorcin entrica del selenito est influenciada por las concentraciones alimentarias de vitamina A, E y C (47). El selenito, como la selenocisteina, no sigue transporte activo, y su absorcin no est inhibida por anlogos azufrados (23).
El selenio absorbido es rpidamente captado por el hgado y los eritrocitos y retorna al plasma como forma metabolizada (12).
En el plasma, el selenio est unido a protenas plasmticas no especficas: no se han descrito por ahora portadores propios (albmina, globulinas, lipoproteinas). Slo una pequea fraccin del selenio plasmtico se encuentra en forma de glutation peroxidasa (1 (6)(20)(4$.
-
2 %)
IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO El contenido total de selenio en el cuerpo humano se ha estimado entre 13 y 20 mg para
los americanos y entre 4 y 10 mg para los neozelandeses.
El metabolismo del selenio se opera en el organismo por reduccin: esto constituye una diferencia importante con respecto al azufre, dado que sus compuestos tienden a estar oxidados. El metabolismo hace intervenir reacciones enzimticas y no enzimticas utilizando el glutation reducido: 5e042 + ATP sulfurilasa
y
Me2~
Adenosina 5selenofosfato + PP~ GSSeO 3

-.
Adenosina 5selenofosfaro H2SeO3 + 4 GSH

-~
GSH
SeO3 + GSH
(3SSeSG + GSSG + 3 H20 GSH reductasa (35H reductasa 2 NADP + GSH + GSSeH 2 NADP + GSH + H2Se
GSSeSG + 2 NADPH GSSeH + 2 NADPH
El seleniuro de hidrgeno producido en la reaccin, lo mismo que los intermediarios de tipo selenopersulfuro (R-S-Se-S-R) o seleniodiglutation ( G-S-Se-S-G), se encuentran como base de los compuestos selnicos biolgicamentes activos. La sntesis de aminocidos selnicos a partir de selenito o selenato alimentario parece poco probable.
Ciertos autores se inclinan ms hacia una incorporacin post-transduccional de seleniuros en los residuos de aminocidos azufrados dejndolos unidos a las protenas. (49)
La selenocisteina es la forma ms corriente de presentarse el selenio en las protenas de actividad enzimtica (glutation peroxidasa y protenas bacterianas).
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iMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO La selenometionina es una forma importante de selenio alimentario, sobre la base
metablica de la metionina. Puede sustituir a este aminocido en las protenas.
La excrecin de selenio se realiza como seleniuro. Por metilacin, va metiltransferasas dando compuestos tipo ion trimetilselenonio ( Se(CH3)~ ) y dimetilseleniuro ( Se(CH3)2). Se convierte por tant.o en una importante va de destoxificacin, el seleniuro es ms txico que los derivados metilados.
El trimetilselenonio, muy soluble, se elimina por vas fecales y urinarias, que son las principales vas de eliminacin, mientras que el dimetilseleniuro, que es una sustancia voltil, con olor a ajo, se elimina por los pulmones.
Cuando el aporte alimentario no es exagerado, la excrecin urinaria representa el 55 al 60 % del total; la excrecin por el sudor el 5 %, y por los pulmones menos del 1
%.
Desde
el punto de vista homeosttico la eliminacin por va urinaria parece intervenir de manera significativa(5O) (51) (52).
1.5.-
TOXICIDAD DEL SELENIO
La toxicidad del selenio est particularmente bien documentada en los animales, en parte por los sndromes txicos antes descritos (la enfermedad alcalina, ceguera,
. .
) y de otra parte
por la puesta a punto de especialidades farmacuticas de uso teraputico y profilctico en la
19
medicina veterinaria. Las necesidades de los animales son de 0, 1 a 0, 2 ~g/g de materia seca alimentaria. El lmite de tolerancia se fija entre 2 y 5 ~g/g, situndose el nivel txico entre 7 y 15 ng/da.
Estos valores dependen de la va de administracin y de la forma qumica, de la edad del animal.
En el hombre, se han descrito intoxicaciones profesionales, as como intoxicaciones medicamentosas( se ha usado el sulfuro de selenio como antimictico y antiseborreico).
Los problemas clnicos son variables: dermatitis, alergias urticarias, edema pulmonar con el hidruro de selenio, y sintomatologa cardiaca, heptica y gastrointestinal en cienos casos. Las caries dentales son tambin hallazgos frecuentes en habitantes de zonas selenferas (20).
El tratamiento de las intoxicaciones se basa en el aporte de metionina, de vitamina E, de sulfato y de arseniato.
Los sntomas de seleniosis crnica en el hombre aparecen cuando las concentraciones se selenio en los alimentos son de 10 a 200 veces ms elevadas que las normales. (53)(54) (20)(SS).
Una ingesta de 500 ~g de selenio por da puede fijarse como mximo aceptable para la proteccin de la salud humana.
20
En humanos la DL SO por va oral se estima entre 0, 5 y 1 g en forma de selenito o de selenato de sodio.
1.6.- PAPEL ESENCIAL DEL SELENIO
Aunque la esencialidad del selenio para animales qued establecida en 1957 por Schwarz y FoIz, en los hombres tuvo que esperarse a 1979 para que se demostrara su necesidad vital.
En este ao, los investigadores chinos informaron del efecto profilctico del Se en la enfermedad de Keshan(24)(26). Se presenta como una cardiomionata congestiva con desenlace fatal por la insuficiencia cardaca, el aumento de tamao del corazn, la arritmia y las modificaciones electrocardiogrficas. Afecta principalmente a nios y a las mujeres jvenes que viven en ciertas regiones de China (bien delimitadas geogrficamente). Descubrieron que los valores de selenio estaban disminuidos en todos los pacientes. Esos investigadores consiguieron prevenir totalmente la enfermedad en los nios dando comprimidos de selenito sdico en una dosis de 150 a 300 ~g de selenio por semana. Aunque la carencia de selenio explica numerosas manifestaciones de la enfermedad, hay otros factores igualmente implicados, como el posible dficit de yoduros. (23)
Otros investigadores chinos han establecido una relacin causal entre la carencia de selenio y otra enfermedad endmica, la enfermedad de Kashin-Beck caracterizada por una necrosis del cartlago y una distrofia del msculo esqueltico.
21
Una segunda evidencia del papel esencial del elemento en el hombre se describi por primera vez en 1981, pacientes con nutricin parenteral a muy largo plazo (56).
Dado el contenido insignificante de selenio en las nutriciones artificiales de uso intravenoso, aparecen numerosos sntomas que responden a una ingesta suplementaria de selenio: el malestar muscular (53)(57) que se manifiesta a los 30 das de alimentacin parenteral la cardiomionatia con~estiva<58) y su desenlace fatal
Hasta el momento actual se han descrito siete casos de muertes en el mundo occidental por dficit de selenio en la nutricin parenteral (59)(60)(61)(62)(63)(64)(65). Cada da son ms numerosos los signos descritos de deficiencia de selenio en humanos (66ft67).
1.7.- FUNCIONES BIOLOGICAS DEL SELENIO
1- Constitucin de enzimas. 2- Interaccin con diversos metales. 3- Intervencin en el metabolismo heptico de xenobiticos. 4- Intervencin en la espermatognesis. 5- Otros derivados selnicos biolgicamente activos.
La mayora de las enzimas selnicas han sido descritas en las bacterias ( frmico deshidrogenasa, glicina reductasa, xantino deshidrogenasa, cido nicotnico hidroxilasa, tiolasa)
21
SELENOENZIMA GLUTATION PEROXID ASA
Esquema de una subunidad
22
En los mamferos, la enzima conocida es la glutation peroxidasa, que cataliza la reduccin del perxido de hidrgeno por el glutation y as protege a los eritrocitos de la
oxidacin de la hemoglobina y la hemlisis consecuente.
Rotruck en 1973 (2) descubri que contena selenio como elemento esencial.
Posteriores estudios realizados por Sunde y Hoekstra (15) han mostrado que la glutation peroxidasa posee 4 subunidades idnticas, y cada una de ellas contiene un tomo de selenio. El tomo de selenio ocupa el centro activo del enzima en forma de selenocisteina.
En el hombre existe una elevada actividad en el hgado y en los eritrocitos. (7fl10)(14).
El enzima toma parte del equipo celular comprendido por la catalasa, la suocrxido dismutasa y el a-tocoferol (9)(1O)(68).
En una deficiencia de selenio la actividad glutation peroxidasa est disminuida en numerosos tejidos.
La subsistencia de derivados oxigenados txicos en la clula, causa daos caractersticos: peroxidacin de los lpidos de membrana y otros compuestos sensibles a la peroxidacin. La mayora de las manifestaciones clnicas de la deficiencia de selenio se explican por los fenmenos de : hemlisis, necrosis heptica, degeneracin del pncreas, las cataratas y la modificacin de la resnuesta ininunitaria e inflamatoria
23
iMPORTANCIA NUTR CJONAL DEL SELENiO 1. 8. - EL SELENIO EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS
L 8.A. LOS DESORDENES MUSCULARES

-
La enfermedad de Keshan es la primera afectacin muscular en la que la
responsabilidad de una carencia de Se de origen alimentario ha sido demostrada de una manera definitiva.
Diversos casos de cardiomionata congestiva atribuibles a una carencia del elemento se han ido describiendo con posterioridad.
Las investigaciones sobre el papel del selenio en la etiologa de cardiomiopatas humanas ofrecen resultados discordantes.
Oster y cols. (58) han observado una correlacin positiva entre la concentracin de selenio en suero y la fraccin de eyeccin ventricular derecha.
En los pacientes que sufren infarto agudo de miocardio, estos mismos autores observan valores muy bajos de selenio en sangre. Esto coincide con los datos de Salonen (69) que afirma que las personas con un selenio en sangre inferior a 45 ~ig/ltiene un riesgo 2, 9 veces superior de sufrir una enfermedad de la arterias coronarias. Estas mismas conclusiones son obtenidas por Moore (70) y por Aro (71).
24
Por e] contrario Ja Dra. Robinson (6) as como Ikran (72) sealan que Nueva Zelanda, que tiene un ambiente pobre en selenio, y cuyos sus habitantes presentan bajas tasas de selenio en suero, no presenta un patrn de incidencia de enfermedades cardiovasculares diferente al que existe en Europa o en Estados Unidos.
Para Nve (73)(74) la deficiencia de selenio implica defectos cardiovasculares no slo por proteger el endotelio, sino tambin por intervenir en la sntesis de cido araquidnico. Johnson public uno de los casos de muerte por cardiomiopata (59) tras recibir alimentacin parenteral prolongada.
En la misma lnea se incluye el estudio de Ringstod (75) sobre la incidencia de cardiomiopatas en poblacin deficitaria de selenio.
Otros investigaciones, como las de Kok (76), Nan (77), Bukkens (78) y Schaffer (79) establecen tambin el carcter de factor de riesgo para la cardiomiopata para la poblacin con niveles bajos de selenio en suero.
Tambin demuestran (8O)<SI) que las personas que padecieron un infarto de miocardio tenan menores concentraciones de selenio.
La distrofia miotnica es otro desorden muscular muy caracterstico que puede ser tratada con selenio, en asociacin con vitamina E. Tambin se ha observado un cierto xito en el tratamiento de la Distrofia muscular tino Duchenne (82).
25
1.8. B. LOS DESORDENES SANGUNEOS

-
La deficiencia de selenio puede jugar un cierto papel en la patognesis de la anemia hemoltica en cierto tipo de nios con desnutricin calrico-proteica.
1.8. Ci- LAS ENFERMEDADES NEUROLOGICAS DEGENERA 7IVAS
La administracin de selenio (al mismo tiempo que vitamina E, B6 y B12 ) permite mejorar cienos sntomas de la lipofucsinosis ceroide neuronal.
La trisoma 21 (mongolismo o Sndrome de Down) est tambin asociada a un proceso oxidativo que causa un envejecimiento creciente y una demencia con degeneracin cerebral. La accin oxidativa se explica por la generacin aguda de perxido de hidrgeno en las clulas debido a un aumento de la actividad de la superxido dismutasa que est portada genticamente por el cromosoma 21.
Un aporte marginal de selenio limita su actividad (83)(84).
Para explicar el proceso del envejecimiento muchos autores han emitido hiptesis sobre una generacin aumentada de radicales libres (85). El recurso del selenio y otros antioxidantes es tentador.
26
En las enfermedades psiquitricas se ha tratado de buscar una relacin entre la depresin neurtica y el dficit de selenio sin que los resultados sean muy claros por ahora (37)(86).
L8.D.- LOS DESORDENES DIGESTIVOS
Los pacientes que sufren malabsorcin de etiologas diversas presentan generalmente un dficit de selenio.
En la fibrosis quistica, la malabsorcin es debida a un dficit de la secrecin pancretica y biliar y entraa una carencia marginal en selenio. (37)(87).
La enfennedad celiaca y la enfermedad de Crolin tambin influyen de forma negativa en el balance de selenio.
De las enfermedades hepticas tiene panicular inters la cirrosis, en la que el balance de selenio es poco adecuado(88).
El aumento de la lipoperoxidacin heptica que resulta contribuye al agravamiento de la enfermedad (19) (21).
En la cirrosis biliar primaria se repite esta misma situacin (89).
27
IMPORTANCiA NUTRICIONAL DEL SELENIO
Existe una posible correlacin entre el selenio y las protenas de sntesis heptica (albmina, transferrina, etc.. .)(90).
La mgesta de alcohol (etilismo crnico) agrava el fenmeno por aumento de la produccin de perxidos e induccin de una deplecin de glutation reductor en las clulas (37)(91).
1.8. E. LOS DESEOUILIBRIOS ALIMENTARIOS

-
Los prematuros y los neonatos son un grupo de poblacin expuesta a carencias diversas en selenio en razn de la pobreza de este elemento en los alimentos que consumen (leche en polvo, frmulas preparadas(31)(56), alimentacin parenteral(92).
En lo que concierne al selenio, se aconseja la alimentacin maternal de los neonatos segn el informe de la OMS (93).
Un aporte suplementario de selenio a las madres lactantes mejora ostensiblemente el status selnico de sus hijos (94)(95)
Los nios tratados por enfermedades metablicas como la fenilcetonuria y la enfermedad del jarabe de arce son sometidos a regmenes excluyentes de protenas habituales, reciben mezclas pobres en selenio, por lo que su estado selnico puede estar deprimido. (96).
28
L8.F.- EL CANCER
Paradjicamente el selenio ha sido considerado durante mucho tiempo como un elemento capaz de inducir cncer.
De 1960 a 1970 se oper un cambio en la manera de pensar de los investigadores, paralelamente a la puesta en evidencia de su carcter esencial.
Las primeras indicaciones a partir de Schrauzer (97)(98) que mostraron que el contenido de selenio en el suelo, los alimentos y la sangre humana estaban inversamente correlacionados con la tasa de mortalidad debida al cncer.
En investigacin animal estos autores demostraron las fuertes relaciones entre el cncer de mama y una dieta carente de selenio.
Estos estudios fueron ampliamente discutidos por haberse realizado en animales.
En el ao 1981 aparecieron numerosos estudios que demostraban que se poda reducir la incidencia de diversos tumores animales mediante un aporte de selenio: los que son espontneos reduce la incidencia entre un 10 y un 45, en la rata el tumor de mama inducido por virus (99) o qumicamente con dimetilhidrazina (100)(1O1) son casi totalmente prevenidos (88%) y adems demuestran una disminucin de la velocidad de crecimiento del tumor mamario trasplantado en rata (98)(102)(103)(104)(1O5).
29
En el hombre, se ha comprobado despus de aos, que los pacientes con cncer haban tenido concentraciones sanguneas de selenio inferiores a las normales; sin embargo es delicado afirmar que tasas pobres de selenio sean la causa de la enfermedad.
Existen estudios prospectivos epidemiolgicos mucho ms edificantes publicados a partir de 1987, presentan el hecho de que tasa sanwneas de selenio en cantidades biolgicas elevadas previenen el diagnstico del cncer
El primer estudio fue publicado en 1987 por Willet (106) en la Universidad de Harvard, EEUU, comenz en 1973 sobre 10940 sujetos con aparente buena salud procedentes de 14 regiones de los EEUU. La sangre se guard congelada. Durante cinco aos aparecieron 1 11 casos de cncer. El anlisis de selenio en suero de los pacientes comparados con los que no desarrollaron cncer pareci demostrar que de una forma general existe una asociacin entre las concentraciones sanguneas de selenio y el riesgo de cncer.
Esta asociacin entre bajo contenido de selenio en sangre y riesgo de cncer es particularmente significativa para ciertos cnceres (107). Parece clara la relacin con el cncer de cuello (54), eL cncer de mama en mujeres (108), el cncer de colon (109), el de pncreas (110), el de cavidad oral (111), la leucemia no linfoctica aguda (112) y el de tiroides (113).
Otros estudios epidemiolgicos como el de Salonen de 1984 (114) sobre 8113 personas, el de Clark (115) y el de Virtamo (116) demuestran que concentraciones de selenio inferiores a 35 Mg1 estn asociadas a un riesgo relativo de cncer de 3. 0.
30
Segn ciertos autores, la cantidad de selenio habitualmente conseguida por la alimentacin es insuficiente en la profilaxis nutricional del cncer(117)(l18).
La accin de prevencin del selenio se debe a su poder antioxidante, su accin potenciada la de la vitamina E (18)<119)(120).
Sin embargo hace falta todava algn estudio serio que demuestre cientficamente que la ingesta suplementaria de selenio tenga un efecto protector frente al cncer.
L 8.6. EL SELENIO EN LIS AFECCIONES REUMA T1CI4S

-
Las concentraciones elevadas de productos de peroxidacin que se encuentran en el lquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide parecen estar relacionadas con la patognesis de estas afecciones reumticas. El carcter antioxidante del selenio explica la correlacin que algunos autores encuentran entre el numero de articulaciones afectadas y las tasas de selenio en sangre (121)(122), pese a que no se han encontrado efectos teraputicas en el aporte de selenio.
I.8.H.- OTRAS ENFERMEDADES
En los ltimos aos, 1990, se han publicado diversos trabajos que encuentran niveles reducidos de selenio en suero en pacientes con ASMA (123), as como en el ACNE (124).
31
IMPORTANCIA NUTRJCIONAL DEL SELENIO
Otra lnea de investigacin importante es la referente a la alteracin del nivel de selenio en pacientes sometidos a hemodilisis (125) en los que la concentracin de selenio est muy reducida comparndola con los controles (126), estudindose las diferencias entre los pacientes hemodializados con y sin cncer (127), parece claro que en la insuficiencia renal crnica casi todos los elementos traza se encuentran alterados (51), as como es posible su correccin con aportes extras (125).
Ortos autores estn estudiando la influencia del aporte de selenio a las mujeres GESTANTES dado que sus niveles suelen ser reducidos <95)(128)(129) de esta forma parece disminuir algunos problemas que se presentan en neonatos hijos de madres con baja concentracin de selenio en sangre (28)<31)(92).
En las enfermedades INFECCIOSAS el selenio como otros elementos traza (cobre, zinc, hierro...) se encuentra modificado, en el caso del selenio hay una disminucin de su concentracin (128) (130).
1.9.- EL SELENIO EN LA TERAPEUTICA Y PROFILAXIS NUTRICIONAL
Los compuestos selnicos han sido relativamente poco utilizados en la teraputica humana hasta los ltimos aos. El sulfuro de selenio se us en el tratamiento de la ptiriasis versicolor y de la seborrea del cabello. Tambin se conoce su actividad contra la blefaritis escamosa como ungiiento oftlmico.
32
MPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO
En el tratamiento de las enfermedades carenciales humanas se recurre a:
Selenito sdico. Es bien absorbido, fcilmente disponible para la sntesis de glutation
peroxidasa, no se acumulan en el organismo. Es inestable en solucin para va oral o enteral.
Selenato sdico. Se trata de un derivado muy estable, pero sin embargo, no se usa en
teraputica humana.
DL- o L-selenometionina. Es un derivado bien absorbible, ms eficaz que los
compuestos de selenio inorgnicos. Sin embargo, tiene tendencia a acumularse en tejidos orgnicos.
Formas naturales. En la mayora de los estudios consultados recurren al pan
confeccionado con cereales ricos en selenio para el aporte suplementario de sclenio a humanos.
Levadura enriquecida con selenio. La forma predominante es la selenionietionina
(50%), el resto es selenioglutation, seleniodiglutation y selenocisteina. Da una excelente respuesta biolgica.
IL- ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
11.1.- INTRODUCCION
Hasta 1955 no se obtuvieron las primeras aplicaciones reales de la EAA que fueron realizadas por Alan Walsh en Australia y Alkemade en Holanda (131)(132).
Alan Walsh empez sus trabajos en Absorcin Atmica completamente solo, en 1952 con un equipo formado por un mechero de laboratorio, el atomizador de un fotmetro de llama, una lmpara de sodio y un monocromador que le prestaron.
En el ao 1954, en el Instituto de Fsica de Melbourne, en Australia, realiz la primen demostracin del equipo de absorcin atmica que haba diseado. Desde ese ao, la espectrofotometra de absorcin atmica se ha desarrollado fundamentalmente en Australia, Estados Unidos, Inglaterra y Alemania (133)(134)(135)(136)(137).
La gran popularidad y el rpido desarrollo de esta tcnica analtica se deben a las ventajas que ofrece (138)(139)(140)(141)(142):
34
ESPECTROFOTOMETRLI DE ABSOR ClON A TOMICA
Puede analizar directamente 82 elementos Sus lmites de deteccin son inferiores a la p. p. m. Tiene una precisin del orden del 1 % de C. y. Su manejo es sencillo
De todas estas ventajas, se debe destacar la gran sencillez de operacin.
11.2.- PRINCIPIOS BASICOS
De todos es conocido que cuando se suministra una determinada cantidad de energa a un tomo cualquiera, que se encuentre en su estado fundamental (estado energtico que llamaremos E0), esta energa es absorbida por el tomo, de tal forma que se incrementar el radio de giro de sus electrones de la capa externa, pasando el tomo a un nuevo estado energtico E~ al que se denomina estado excitado:
Atomo en estado fundamental
Atomo en estado excitado
35
ESPECTROFOTOMETRL4 DE ABSORClON ATOMICA
La cantidad de energa necesaria para llevar un tomo de su estado fundamental al excitado la llamamos energa de excitacin E, y ser: E=E1-E~
Cuando un tomo excitado vuelve nuevamente a su estado fundamental, ste cede una energa cuantitativamente idntica a su energa de excitacin, emitiendo una radiacin a longitudes de onda determinadas:
E
El
EE1-EOhv
EO EO Ecuador de Planck
La representacin grfica de la intensidad de emisin de estas radiaciones, en funcin de la longitud de onda, se llama espectro de emisin.
Estudiando los espectros de emisin de todos los elementos del sistema peridico, se observa que presentan los mximos de energa a diferentes longitudes de onda:
422pm
Calcio
266nm 219pm 202pm SB2nm
Magnes~o
36
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCION ATOMICA
Experimentalmente se demuestra que la intensidad de emisin de cada elemento, a su longitud de onda caracterstica, es mayor, cuanto mayor sea su concentracin (143).
11.3.- ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA
Este principio que hemos expuesto, la ecuacin de Planck, es un equilibrio reversible, y lo podemos desplazar en un sentido o en otro, fundamentalmente en funcin de la temperatura o dicho de otro modo de la cantidad y forma de energa que suministremos.
Si el aporte de energa es grande, la mayora de los tomos se encontrarn en estado excitado. Si se mide la energa que emiten los tomos a su longitud de onda caracterstica, se obtendr un anlisis cuantitativo o cualitativo denominado espectroscopia de emisin (144)(145).
Sin embargo, cuando sobre una nube de tomos en estado fundamental incide una radiacin de frecuencia definida (luz cuantizada hv), se absorbe una cantidad de energa por unidad de tiempo y volumen que es proporcional al nmero de tomos libres por unidad de volumen, es decir, es proporcional a la concentracin de esos tomos en la muestra. Los aparatos diseados para realizar esta medida son los espectrofotmetros de absorcin atmica.
La proporcionalidad entre el nmero de tomos libres por unidad de volumen y la energa absorbida est regida por la ecuacin de Einstein: E.b. =B~kNS,WvJk
37
ESPECTROFOTOMETRA DE J4BSORCION ATOMICA
donde B~k es el coeficiente de probabilidad de absorcin de Einstein para la transicin j*k. El producto
B~k ~S
es una expresin para la fraccin de tomos en estado fundamental capaces de
absorber un fotn de energa por unidad de tiempo. 5, es la intensidad de la radiacin espectral.
Como fundamento de la tcnica de espectroscopia de absorcin atmica, queda establecido que la energa absorbida depende
-
de la frecuencia de la lnea de resonancia
t~k
de la intensidad de radiacin de dicha lnea
La intensidad de radiacin de la lnea de resonancia no es constante, pues se produce un ensanchamiento de la linea de forma natural debido al efecto Doppler y al efecto Lorenz. Para coseguir que la energa absorbida sea proporcional al nmero de tomos presentes es preciso referirse a anchos de lnea comprendidos entre 0, 0005 nm y 0, 003 nm.
Esta especificacin afecta de forma definitiva al tipo de fuentes de emisin que se pueden usar en absorcin atmica. Aunque las lmparas de espectro continuo producen una gran intensidad a lo largo de todo el espectro, es imposible separar una zona de 0, 0005 nm. Es preciso por tanto, usar una fuente de radiacin que emita el espectro del elemento analizado (146)(147)(148)(149).
La medida de la absorbancia se basa en la ley de Lambert-Beer, siendo sta proporcional a la concentracin, a la longitud (1) y al coeficiente de extincin molar (e): A
=
38
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORClON ATOMICA
11.4.- INSTRUMENTACION
La construccin general de un espectrofotmetro de absorcin atmica es simple como se muestra en el siguiente esquema (131)(132)(133):
S.L.E.
Consta de una mente de radiacin, que emite el espectro del elemento analito; un atomizador, como la llama o el horno de grafito, en el cual se forman los tomos de la muestra que se va a analizar; un monocromador para seleccionar la lnea de resonancia; un detector que permita la lectura de la intensidad de radiacin, seguido por un amplificador y sistema elctrico de lectura.
Este esquema es muy parecido al de un espectrofotmetro de emisin de llama con una fuente de emisin (132)(135). Sin embargo, en absorcin atmica, la llama debe ser una clula de absorcin en la cual se atomiza la muestra y slo se producen tomos en estado fundamental.
39
ESPECTROFOTOMETRA DE I4BSORClON ATOMICA
Aunque el nmero de tomos excitados en este tipo de llama es menor que el nmero de tomos en estado fundamental, en muchos casos los espectros de emisin de la llama interfieren con las medidas de absorcin. Se producen de esta forma las llamadas interferencias espectrales que afectan a la determinacin de muchos elementos (150).
Para eliminar estas interferencias debidas a la emisin de la llama, el espectrofotmetro de Absorcin Atmica acta con un chopped o radiacin pulstil. El haz de radiacin se modula mecnica o elctricamente a una frecuencia fija y el amplificador electrnico se empareja a esa misma frecuencia. As, slo la radiacin de la fuente primaria se amplifica mientras que la emisin de la lmpara, no modulada, aparece como desechable.
Otro sistema de eliminar las interferencias es el Espectrofotmetro de doble-hazque veremos ms adelante.
1L4.A.
FUENTES DE RADIA ClON
Muchas de las ventajas de la Espectrofotometra de Absorcin Atmica pueden relacionarse directa o indirectamente con el estrecho ancho de las lneas de resonancia del espectro, pues la absorbancia del elemento tiene lugar dentro de un rango espectral muy limitado.
Esta ventaja es todava mayor si la fuente de radiacin usada emite lneas todava ms estrechas que las lneas de absorcin.
40
Las lmparas de ctodo hueco y las lmparas de descarga sin electrodos son particularmente adecuadas para estos propsitos:
LAMPARAS DE CATODO HUECO
Actualmente son las ms usadas por su eficacia. Su tecnologa es antigua, pues datan de 1916, si bien las actuales presentan bastantes modificaciones.
Una lmpara de ctodo hueco consiste en un cilindro de cristal, con un ctodo y un nodo, lleno de un gas inerte (nen o argn) a una baja presin. No se debe de utilizar nunca xenn como gas de llenado porque emite un espectro continuo. Igualmente, se debe evitar la contaminacin con hidrgeno por esta misma razn.
ESQUEMA DE LCH
El nodo es un alambre fino de nquel o tungsteno. Al aplicar una corriente elctrica entre los electrodos, tiene lugar una descarga. Si el ctodo consiste en un cilindro hueco, en las condiciones adecuadas, la descarga tendr lugar casi exclusivamente dentro del ctodo.
41
ESPECTROFOTOMETRA DE L4BSORClON ATOMICA
En el gas interno de llenado, se genera una corriente de iones positivos que golpean la superficie del ctodo y liberan tomos del material que constituye ese ctodo. Estos tomos, al atravesar la zona de intensa descarga se excitan y emiten radiaciones de sus lneas espectrales. Dado que la mayora de la radiacin se emite dentro del ctodo el resultado es un haz relativamente bien enfocado.
Como la presin del gas de llenado es prcticamente 0, la temperatura no afecta el ancho de lnea, y al estar las lneas de absorcin en la llama sometidas a la presin atmosfrica se consigue que las lineas de excitacin sean menores que las de absorcin.
LAMPARAS DE DESCARGA DE VAPOR
Son las ms adecuadas para metales voltiles como el Hg, T, Zn y metales alcalinos. Se ofrecen comercialmente a bajo precio, si bien presentan la desventaja de que emiten lneas muy ensanchadas (15l)(152).
LAMPARAS DE DESCARGA SIN ELECTRODOS
Emiten una altsima intensidad radiante y presentan el menor ancho de lneas espectral en comparacin con otras posibles fuentes de radiacin (153)(154).
Su principal ventaja es que aumentan la intensidad de la radiacin varios cientos de veces en comparacin con las lmparas de ctodo hueco (LCH).
42
Consisten en tubos de cuarzo sellados de varios centmetros de largo y 5-10 mm de dimetro, lleno con unos miligramos del elemento analito bajo una baja presin de argn.
Ese tubo se monta dentro de un generador de alta frecuencia (2400 MHz) y se excita con unos 200 vatios.
Este tipo de lmpara es el adecuado para el rango del UV vaco, debido a las enormes prdidas que se presentan por la absorcin del aire, de la llama y de las lentes.
Sus principales desventajas son que sus vidas medias son relativamente cortas y adems, que requieren calentarse un largo perodo.
Se usan rutinariamente para elementos como el arsnico, el cesio y el rubidio.
IL 4.B. ATOMIZADORES
-
Para conseguir tomos en estado fundamental es necesario suministrar a la muestra una dosis de energa para disociar las molculas, romper sus enlaces y llevar los tomos al estado fundamental procurando no rebasar este estado energtico.
En el siguiente esquema, se refleja la obtencin de tomos en estado fundamental a partir de la nebulizacin de la muestra lquida.
43
ni ola Colas
excitadas
atomos en estado excitado
tomos en es tunds meo t al
otra anula
:parouas gaseosas
particulas tundidas
partculas solidas
evaporaciorl del solvente
Eco
44
ESPECTROFOTOMETRIA DE 14BSORCION ATOMICA
Las tcnicas desarrolladas para la atomizacin de las muestras y obtencin de tomos en estado fundamental son:
Tcnica de llama Horno de grafito Generacin de hidruros Tcnica del vapor fro.
TECNICA DE LLAMA
Los constituyentes de un atomizador de llama son:
It
Nebulizador Mechero
~.
Llama
1~
Drenaje
45
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSOR ClON ATOMICA
Nebulizador
Es el dispositivo necesario para convertir la muestra lquida en una disolucin en vapor, con un tamao de gota muy pequeo, con objeto de que pueda mezcarse perfectamente con el oxidante y el combustible antes de alcanzar la llama.
La muestra se aspira por efecto Venturi a travs de un tubo debido al gas que circula perpendicularmente a gran velocidad.
El caudal de aspiracin viene dado por la ley de Poiseuile (155):
R L
Q Caudal de aspiracin
=
R= Radio del capilar AP = Incremento de presin L= Longitud del capilar

=
Viscosidad
rIR4AP
StpL
46
El rendimiento de la aspiracin depende tanto de la longitud y dimetro del capilar, como de la viscosidad de la disolucin.
El nebulizador tiene una geometra calculada para que el dimetro medio sea lo menor posible.
Experimentalmente se comprueba que las lecturas aumentan segn aumenta el caudal de aspiracin hasta un cierto valor, y despus se mantienen prcticamente constantes (156).
Trabajar a caudales de aspiracin altos significa una mayor estabilidad, aunque no una mayor lectura. En contrapartida, el adicionar mayor cantidad de muestra a la llama equivale a enfriarla sensiblemente.
Cmara de uremezca
oxidante
combustible
mechero
LzEkrzzzzzi
-Ib
drenaje muestra
N ola de impacto
47
Nada ms salir del nebulizador el fino vapor de la muestra, penetra dentro de un recinto cerrado llamado cmara de premezca.
En la cmara, se separan la fase en estado de vapor de la fase en estado lquido, mezclndose la primera con el oxidante y combustible ntimamente, de tal forma que pueda alcanzar este conjunto el mechero, cuya llama suministrar la energa necesaria para romper las molculas en sus tomos y llevarlos al estado fundamental.
Casi todas las cmaras de premezca estn fabricadas de polipropileno, que es muy inerte, no contamina de elementos inorgnicos y es muy resistente a la mayora de los disolventes orgnicos.
Para evitar mayores problemas suele existir un dispositivo de seguridad por si explota la mezcla de oxidante y combustible. Cuando la geometra de la cmara puede permitir estas explosiones, los fabricantes colocan un anclaje al mechero para que no dae al operador.
Debido a que el rendimiento del nebulizador es del orden del 10% para la mayora de los disolventes orgnicos, el 90% restante se elimina por un drenaje, para evitar que la parte no nebulizada alcance la llama.
El drenaje ms habitual es el hidrosttico, consistente en tubo de 1,3 cm de dimetro exterior conectado por una parte a la cmara y por otra a un recipiente de plstico, que mantiene constante un nivel de agua.
48
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORClON A TOMICA
La bola de impacto, donde se produce la separacin de las fases es de cuarzo o tefln, y se encuentra situada a 0.5 mm del nebulizador.
Mechero
Generalmente estn construidos de titanio pues es una metal que posee un coeficiente de dilatacin lineal a altas temperaturas (157).
El camino ptico es uno de los trminos fundamentales de la ecuacin de Lambert-Beer.
Del mismo modo que en espectroscopia de Ultravioleta-Visible la muestra es contenida en una cubeta de longitud dada, en absorcin atmica la muestra es contenida de forma dinmica en la llama.
El mechero ms utilizado es el de llama de aire-acetileno. Su camino ptico es de unos 10 cm de largo consiguiendo una mxima sensibilidad.
Otro de los mecheros frecuentemente utilizados es el mechero de xido nitroso, y est diseado para trabajar a altas temperaturas.
Su camino ptico es de 5 cm de largo. En determinadas ocasiones, puede usarse tambin para aire/acetileno pero su sensibilidad es menor.
49
ESPECTROFOTOMETRA DE I4BSORCION ATOMICA
Llama
Son muchas las etapas que se realizan en la llama para obtener el mayor nmero de tomos en estado fundamental a partir de una disolucin (157)(158), evitando al mismo tiempo que se formen tomos en estado excitado.
Existen diferentes tipos de llamas: -aire/gas ciudad -aire/butano -aire/propano -aire/acetileno -oxigeno/acetileno -oxido nitroso/acetileno -oxido nitroso/hidrgeno -argn/hidrgeno
A la hora de elegir la ms conveniente, hay que tener en cuenta varios factores:

-
fcil disponibilidad manejo sencillo temperatura adecuada gran transparencia espectro de pocas lneas suficientemente seguras
so
______ _____ ge ea * g
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORClON A TOMCA

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.., iY ~ ~Siet~.t .~.<O~V~ ~
Aire Aire Aire Aire Oxigeno N20 Aire Oxgeno
Gas ciudad Butano Propano Acetileno Acetileno Acetileno Hidrgeno Hidrgeno
1980 2170 2200 2600 3300 3220 2275 2825
108. 5 687. 9 530. 5 106. 5 106. 5 1106. 5 58. 0 58. 0
Para trabajar entre 190 y 850 nm la llama de aire/acetileno es la ms ventajosa. Para elementos refractarios como el silicio, molibdeno, vanadio, cromo, aluminio y titanio a veces se recomienda la llama de nitroso/acetileno pues aporta ms cantidad de oxgeno que el aire, proporcionando por tanto una temperatura superior.
En determinados casos, como por ejemplo en la determinacin de arsnico y selenio, debido a que la llama de aire/acetileno presenta una fuerte absorcin a la longitud de onda caracterstica de estos elementos, es necesario recumr a otras llamas alternativas.
En la llama se distinguen perfectamente tres panes (142): la zona interna prxima al mechero, de temperaturas relativamente bajas, aqu es donde se volatiliza el disolvente; la zona
51
de reaccin es donde se produce la atomizacin y donde hay una mayor proporcin de tomos en estado fundamental; y la zona externa, que es la parte ms fra de la llama, y donde hay ms cantidad de oxgeno que se combina dando xidos refractarios poco convenientes para absorcin atmica.
HORNO DE GRAFITO
Los hornos de grafito son unos recintos en donde se produce la atomizacin y que estn calentados por resistencias elctricas (159)(160H161)(162). Tienen una eficiencia de atomizacin mayor que la llama, y en consecuencia, los limites de deteccin absoluta son mejorados 100 1000 veces en comparacin con los mtodos de llama.
Los hornos ms utilizados son:

-
Horno de LVov <137). Cubeta de Massman (162). Cubeta de Manning (156).
De todos ellos, el que se utiliza ms a menudo es el horno o cubeta de Massman.
Consta de un cilindro hueco de grafito situado en la trayectoria del haz luminoso procedente de la lmpara de ctodo hueco, que est en contacto con unos electrodos, tambin de grafito, situados en sus extremos, entre los que se aplica una corriente elctrica de 500 amperios y de 1000 voltios.
52
Entrada de gas
ventana
salida de agua
1
Entrada de agua
Tubo de
raflto
Horno de Massman
El cilindro de grafito est encerrado en una caja metlica con una ventana superior por la que se introduce la muestra (1-100 ~l) la cual va a parar directamente al centro del interior del tubo de grafito.
Por efecto de la corriente elctrica aplicada, la muestra primeramente se deseca a unos 100 C, luego se incinera, se atomiza y finalmente se volatiliza. Todo ello se logra programando temperaturas creciente a intervalos de tiempo previamente determinados. Terminado el ciclo del programador, que dura unos pocos minutos, el circuito se desconecta automticamente.
Durante todo el proceso circula por el interior de la caja metlica un flujo continuo de gas inerte (argon o nitrgeno), para prevenir la oxidacin del grafito a las altas temperaturas y
53
tambin para evitar la formacin de xidos refractarios, y por una camisa exterior a la caja metlica circula agua, refrigerando todo el sistema, para evitar el excesivo calentamiento del horno.
Los hornos de grafito generalmente proporcionan lmites de deteccin absoluta muy buenos (del orden de
10.12
g) y son capaces de vaporizar muestras muy pequeas. Han sido una
solucin satisfactoria para un conjunto de problemas analticos para los cuales los lmites de deteccin eran inadecuados con los atomizadores de llama, pero no son la panacea.
Sus principales incovenientes son la menor precisin y la presencia de mayores interferencias que en los atomizadores de llama. La falta de precisin es consecuencia de la utilizacin de micromuestras.
GENERADOR DE HIDRUROS
Se emplea este mtodo de atomizacin en aquellos elementos que originan facilmente hidruros voltiles y que mediante un pequeo calentamiento producen tomos en estado fundamental, como son arsnico, selenio, teluro, antimonio, bismuto y estao.
Generalmente se trata la muestra con una solucin de borohidruro sdico que genera los hidruros voltiles correspondientes. Se conducen los hidruros mediante un gas inerte hasta una clula de cuarzo, que se calienta electricamente hasta unos 1000 <C y que se sita en el camino ptico del haz procedente de la lmpara.
54
La ventaja que presenta este mtodo en comparacin con la atomizacin de llama es que se consiguen resultados ms reproducibles por no existir prdidas ocasionadas en la atomizacin por la formacin de compuestos voltiles.
TECNICA DE VAPOR FRO
Utilizada con exclusividad para la determinacin de mercurio, por la elevada volatilidad que presenta este elemento.
En esquema, la tcnica de vapor fro es muy semejante a la tcnica de atomizacin por generacin de hidruros.
En esencia, el mercurio presente en la muestra es qumicamente reducido a su forma elemental mediante borohidruro sdico, y es arrastrado por una corriente de aire a travs de una clula de absorcin de cuarzo de unos 15 cm de longitud colocada en el haz de muestra del espectrofotmetro de absorcin atmica.
La clula se calienta a 100 0C electricamente para evitar la condensacin del agua e incrementar la sensibilidad analtica.
La ventaja de la tcnica de vapor fro es que permite determinar cantidades de mercurio menores de un microgramo.
55
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCON ATOMCA
1L4.C.- SISTEMA OPTICO
CONSTITUYENTES
El sistema ptico de un espectrofotmetro de absorcin atmica est formado por los siguientes componentes:
Espejos Lentes Lminas plano paralelas Red de difraccin
Lentes y espeios
Conducen y concentran la energa emitida por la lmpara
En cualquier sistema ptico se intenta siempre simplificar al mximo el nmero de componentes, pues consumen una considerable cantidad de energa.
Los espejos tienen una prdida de la energa incidente de aproximadamente un 4% por reflexin, y de un 6% al atravesar su superficie. La lente pierde tambin un 10% de la energa incidente.
56
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCON ATOMCA
Los espejos presentan el inconveniente de que se deterioran facilmente, especialmente cuando en las proximidades est situada la lmpara de deuterio, pues genera ozono que dalia el aluminizado del espejo. Sin embargo, a las lentes no les afecta el ozono.
Igualmente, cuando se trabaja en la zona UV un espejo disminuye considerablemente su reflexividad al cabo de un ao, lo cual afecta considerablemente a elementos como el zinc, el selenio, el plomo, etc. y en general, a todos aquellos elementos que presentan lineas caractersticas por debajo de 250 nm.
Por el contrario las lentes no sufren deterioro y adems, pueden limpiarse con facilidad.
La enorme ventaja de los espejos es que son muchsimo ms baratos que las lentes y tambin, que no precisan correccin en la distancia focal con el paso del tiempo cosa que si que es necesaria para las lentes.
Lminas ulano paralelas
Estn formadas por una lmina de cuarzo transparente al U. y., y limitadas por dos superficies planas y paralelas.
Consumen un 10% de la energa y se utilizan en los sistemas a base de espejos con objeto de protegerlos del polvo y de los agentes externos.
57 Redes de difraccin
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCON ATOMICA
Se utilizan en todos los tipos de espectrofotometra para separar las distintas longitudes de onda de un haz policromtico.
Generalmente consisten en una lmina de aluminio en la que se practican unos surcos iguales y paralelos. La superficie reflectante se recubre de aluminio, oro o platino segn los rangos de longitud de onda en que se desee trabajar.
Para usarlas en absorcin atmica es preciso que tengan el suficiente nmero de lneas para trabajar en el espectro U.V., pero no demasiadas para que cubra tambin el visible.
Cuando se utilizan espejos, debido a que presentan un ngulo slido mayor y en consecuencia el haz de iluminacin es ms ancho que el de las lentes, es preciso que el tamao de la red sea mayor que en el caso de que se utilizaran lentes, para que recoja totalmente el haz de iluminacin.
RENDIMIENTO DE UN SISTEMA OPTICO
Es la relacin entre la energa emitida por la lmpara y la cantidad de energa que llega al monocromador durante un ciclo completo de modulacin. En la siguiente tabla, se observan los rendimientos pticos para los diferentes sistemas de espectrofotometra de absorcin atmica que existen actualmente.
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ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
~tt
RENDIMIENTO OYTIC ESPEJOS LENTES 72, 9% 14,7%
HAZ SIMPLE HAZDOBLE
43, 0% 4,4%
Se puede apreciar que son los aparatos con haz simple y con un sistema ptico de lentes los que presentan un mayor rendimiento ptico. Por ello, en la actualidad la mayor parte de los equipos que se comercializan poseen estas caractersticas.
Sin embargo, en los primeros aos de la absorcin atmica solo se dispona de haz doble porque las lmparas, la fuente de alimentacin y modulacin, eran en general bastante inestables y el doble haz eliminaba gran parte del problema.
11.5.- OVE ELEMENTOS PUEDEN ANALIZARSE POR AA
Existen condicionantes instrumentales que hacen que en el momento actual se puedan determinar 82 elementos.
Desde el punto de vista tcnico es perfectamente factible la fabricacin de cualquier lmpara de cualquiera de los elementos del sistema peridico. Desgraciadamente, no puede
59
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION A TOMCA
decirse lo mismo de los detectores, los cuales slo presentan una sensibilidad aceptable en un determinado intervalo de longitudes de onda.
Por otra parte, el sistema de obtencin de tomos en estado fundamental, es decir la llama, presenta una fuerte absorcin a longitudes de onda inferiores a 200 nm, lo cual impide trabajar por debajo de esas frecuencias, salvo con otras tcnicas como el horno de grafito.
Adems, a estas bajas frecuencias el oxgeno del aire absorbe radiaciones Uy, por lo que para trabajar en este rango es preciso purgar todo el sistema con gases inertes.
Los equipos de absorcin atmica actuales trabajan en el rango de frecuencias de 190 a 850 nm.
PARTE EXPERIMENTAL
PARTE EXPERIMENTAL
hL MATERIALES Y METODOS
-
111.1.- INSTRUMENTA ClON
Para la ejecucin de este trabajo se ha empleado un espectrofotmetro de absorcin atmica VARIAN SPECTRAA 30, con correccin de fondo con lmpara de deuterio, de fabricacin australiana, importado por la empresa Ces Analtica. El funcionamiento del espectrofotmetro y el procesamiento de los datos se ha realizado mediante el procesador DATA STATION 12 suministrado igualmente por Varian.
El horno de grafito empleado ha sido el modelo GT 45 manufacturado tambin por Varian. Los tubos de grafito utilizados son de Varian y presentan cubierta piroltica.
La lmpara de ctodo hueco para el selenio proporcionada por Varian result ser inestable. Se ha conseguido mejor reproducibilidad usando una lmpara Juniper (S&J Juniper & Co. ,Harlow, Essex, UK) trabajando a una intensidad de corriente de 7 mA, en la lnea de 196,0 nm, y con una rendija de 1,0 nm.
62 111.2.- REACTIVOS Y ESTNDARES
Ml TERALES Y METODOS
Acido clorhdrico concentrado. Merck Suprapur, Darmstadt, F.R.G.
Solucin estndar de selenio. Sigma Chemicals Co., St. Louis, U.S.A. Preparada a partir de la solucin de dixido de selenio que contiene 990 gg de selenio por ml disuelto en HCI concentrado. Se prepar una solucin madre de 10~ ggdiluyendo con agua desionizada.
Cloruro de paladio. Sigma Chemicals Co., St. Louis, U.S.A. Disuelto en HCl 5 N.
Yoduro potsico. Merck Suprapur, Darmstadt, F.R.G.
Seleno DL-metionina. Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.
El agua usada fue desionizada, destilada y filtrada en un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.)
Las muestras de sangre fueron extradas en jeringas desechables de polietileno con aguja de acero inoxidable.
Las muestras se centrifugaron a IOOg durante 5 minutos, y el suero obtenido se almacen a -20 0C hasta el momento del anlisis.
63
MATERIALES Y METODOS
111.3.- LIMPIEZA DEL MATERIAL
Todo el material de vidrio usado en el trabajo se ha tratado con solucin detergente ACATIONOX (distribuido por Scientific Products), que contiene menos de 0,002% de sodio, potasio, calcio o magnesio, estando libre de metales no inicos, recomendado para el lavado de material en el que se sospecha la presencia de metales.
Despus se limpi por inmersin en agua regia (tres volmenes de cido clorhdrico concentrado con uno de cido ntrico concentrado; es un enrgico oxidante, debido a la accin del ntrico sobre el clorhdrico se producen dos sustancias oxidantes el cloro y el cloruro de nitrosilo; por esta fuerte accin oxidante acta disolviendo a metales que no son atacados por otros cidos, y disuelve tambien sulfuros muy insolubles).
Por ltimo, se enjuag todo el material dos veces en agua destilada y en agua desionizada y secados a 70 <C.
RESULTADOS Y DISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSION
IV. - METODO DE DETERMINAClON
IV.1.- PROBLEMAS DE LA DETERMINACION DE SELENIO EN SUERO
Los reducidos niveles de selenio en suero humano se encuentran muy por debajo del rango analtico de la espectrofotometra de absorcin atmica en llama, cuyo limite de deteccin es de aproximadamente 0,5 sg/ml en solucin, con llama de aire-hidrgeno.
Son muchos los mtodos descritos para la determinacin de selenio en materiales biolgicos, que pueden alcanzar mejores lmites de deteccin, de todos ellos, el que presenta mayores garantas de exactitud y precisin es el anlisis de activacin de neutrones, pero que no es practicable en un laboratorio clnico por precisar un reactor nuclear. Muchos de los mtodos publicados para el anlisis de selenio en material biolgico requieren una digestin cida del material orgnico, seguida por fluorometra o absorcin atmica con generacin dc hidruros, para las cuales son necesarias grandes cantidades de suero poco practicables en la bioqumica clnica rutinaria y, desde luego, inapropiadas para las determinaciones procedentes de poblaciones peditricas.
66
METODO DE DETERMINA ClON
Respecto a los mtodos electrotrmicos de determinacin de selenio en suero con espectrofotometra de absorcin atmica, entre los cuales est la tcnica del horno de grafito (EAAHG), se pueden encontrar publicaciones contradictorias y confusas, probablemente ms que para ningn otro elemento qumico.
La tcnica de espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grafito consigue descender los lmites de deteccin al rango de partes por billn (p.p.b.) con una instrumentacin relativamente simple y sin los esfuerzos y prdidas de tiempo que conllevan las tcnicas de ex traccin previa.
Los problemas analticos asociados a la determinacin de selenio en suero pueden dividirse en dos clases
-interferencias espectrales -prdidas trmicas pre-atomizacin
IV. 1.A. NTERFERENCIAS ESPECTRALES

-
Se conocen dos tipos de interferencias espectrales para el selenio
a) Interferencia debida al hierro. b) Interferencia del fsforo
67
METODO DE DETERMINAClON
INTERFERENCIA DEL HIERRO EN LA SEAL DE ABSORBANCIA DEL SELENIO
El hierro, presente en la sangre total en una concentracin de 500 mg/l, exhibe lneas espectrales prximas a los 196,0 nm (lnea de resonancia del selenio) que pueden provocar interferencias.
Aproximadamente catorce lineas del espectro del hierro (163) pueden encontrarse en una regin de 196,0 nm + 1, de ellas las ms prximas son la de 196,014 nm y la de 196,32 nm. Es obvio que aunque seleccionemos monocromadores con rendijas muy pequeas no podremos excluir la totalidad de ellas, sin degradar la relacin seal-mido hasta perder la utilidad.
Esta presencia de hierro provoca una absorcin de radiacin continua dentro de la ventana espectral del monocromador.
La lnea secundaria del selenio a 204,0 nm est libre de cualquier interferencia espectral del hierro. Sin embargo, esta lnea secundaria presenta aproximadamente seis veces menos sensibilidad que la lnea principal de 196,0 nm, hacindola inapropiada para las valoraciones en suero, adems aunque no interfiera el hierro, silo hacen el cromo y el nquel (frecuentemente usado como corrector de matriz).
Las lineas de absorbancia del hierro entre 196 0 + 1 nm provocan una distorsin de la seal detectada de tal forma que no corresponde a la absorbancia de los tomos de selenio de
68
la muestra, si no que aparecen seales falsamente aumentadas. Hemos diseado un protocolo experimental para comprobar esta hiptesis en el que aadimos elevadas cantidades de hierro sobre una misma cantidad de selenio (y paladio como modificador de matriz como establecemos ms adelante).
En todas las inyecciones colocamos en el horno: -5 pl de estndar de selenio de 200 ~~g/l -3 d de modificador de 50 mg de paladio/l que corresponden a -l ng de selenio -1,5 pg de paladio
~g hierro de 0 2 5 6 10 15
absorbancias 0,244 0,264 0,276 0,434 0,495 0,618
69
0,7
Absorbancia
10
12
14
18
,jgFe
INFLUENCIA DEL Fe EN LA SEAL DE ABSORBANCIA DEL SELENIO.
Cuando la relacin Fe/Se supera la proporcin 5000/1 la seal de lectura registrada se encuentra aumentada en un 78% errneamente. Si la relacin es de 2000/1 el aumento de la seal de lectura es de un 8%.
Afortunadamente en las muestras biolgicas que estudiamos (suero) la cantidad de hierro existente es menor: admitiendo una concentracin media en sangre total de 5000 ~g de hierro por litro y de 100 gg de selenio, es decir una proporcin de 50/1. En suero la proporcin disminuye a 10/1.
70
En cualquier caso queda demostrada la necesidad de establecer un programa de tratamiento trmico que elimine la mayor parte posible de hierro. La temperatura en la que empieza a perderse el hierro en el horno de grafito es de 8000C.
INFLUENCIA DEL FOSFORO EN LA SEAL DE ABSORBANCIA DEL SELENIO
El aumento del fondo de absorcin continua provoca una absorbancia calculada que no corresponde realmente al selenio presente en el tubo, sino que disminuye su magnitud.
Modelo experimental:
En todas las inyecciones colocamos en el horno:

-5 ~1 estndar de 200 ~g de selenio/l de
-3 gI de modificador de 50 mg de paladio/l que corresponden a: -1 ng de selenio -1.5 ng de paladio.
~g CaMPO
4 (sl)
Absorbancias 0,276 0,219
0 (0) 1 (4)
METODO DE DETERMNACON
pg CaHPO4 (gl) 5 (20) 10(40)
Absorbancias 0,125 0,106
03
Absorbancia
2
u 76
0,25
0,2
0,2 0,15
n
0,106
Ol=~
0.1 0,05 -
8 .Jg de CaHPO4
10
12
INFLUENCIA DEL FOSFORO EN LA SEAL DE ABSORBANCIA DEL SELENIO.
La interferencia espectral causada por la presencia de fosfatos en la sangre se ha atribuido <164) a la absorcin del P2 y PO~ originados en la descomposicin trmica del fosfato clcico.
72
El ortofosfato clcico y el hidrgeno ortofosfato clcico causan interferencias en la lnea de 196 nm del selenio, la absorcin inespecfica del fondo provoca problemas de sobrecompensacin, siendo tanto mayores cuanto ms compleja es la matriz del suero, provocando seales negativas que no son representativas del contenido de selenio.
IV.l.B.- PERDIDAS TERMICAS PRE-ATOMIi4CION~
El selenio es un elemento relativamente voltil (punto de ebullicin 685 0C) que se une al azufre dando diversos compuestos estables.
La medida de selenio con EAAHG en matrices difciles requiere una estabilizacin previa del elemento. Sin esta estabilizacin el selenio se pierde en numerosas formas a bajas temperaturas de calcinacin.
FORMA
PUNTO DE EBULLICION 0C
SeO
180 ( se descompone)
130
54C12
( se descompone)
SeCl4 SeOCl2
288 (se descompone) 176 ( se descompone)
73
IV.2.- ABSORCION DE FONDO DEL SUERO
IV. 2.A. CURVAS DE ABSORCION DE RADIA ClON CONTINUA CA USADAS POR

-
LA MATRIZ SERICI4
Para estudiar la absorcin del fondo (matriz srica) se inyectan 15 j1 de suero en el horno de grafito, se programa una lectura a 196,0 nm (lnea de resonancia del selenio) atomizando a 27000 C, previamente se incluye un paso de secado del tubo y otro paso de calcinacin de la matriz orgnica, estudindose el efecto del uso de temperaturas crecientes en este paso de calcinacin (expresadas en grados centgrados)
PARAMETROS DEL MUESTREADOR VOLUMENES (sl) ESTANDAR (SOOyg/l) 3 24 15 BLANCO MODIFICADOR MUESTRA
Para estudiar las absorciones del fondo el espectrofotmetro se programa para que slo registre las absorbancias del la lmpara de deuterio que emite un espectro continuo.
Se aade el estndar de selenio para homogeneizar las condiciones analticas, y evitar errores al comparar resultados.
74
El blanco (HCI 0,5%) se utiliza para igualar los volmenes inyectados en el tubo de grafito.
Las absorbancias consignadas en la tabla representan las absorbancias medias (3 rplicas) registradas en la lmpara de deuterio.
El asterisco indica que la lectura de la lmpara de deuterio sobrepasa el valor de correccin permitido para esta fuente continua, en este aparato.
Temperaturas (0C) 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
Absorbancias 4,000* 2,456* 2,310* 0,948* 0,723 0,247 0,188 0,204 0,136
75
Abeorbanclas de la lampara de Deuterio 6
4)
3 2 2
1 x
2.31
x
0. 8
X
0.723 47 0.188 1200 0.204 1300 1400
o
600 700 800 900 1000
1100
Temperaturas de calcinacion
Curva de absorcion del fondo de 15,iil de suero,aln modificador de matrlz,atomlzaclon a 2700 0.
La correccin de fondo con lmpara de deuterio es practicable cuando la atenuacin del fondo es independiente de la longitud de onda.
Sin embargo, ste no es el caso de la absorcin de fondo que surge de este espectro de absorcin.
76
IV.2.B.- LIMITACIONES DE LA CORRECCION DE FONDO CONTINUA
1- Las atenuaciones fuertes de fondo conllevan un aumento del mido, debido a la segunda fuente de radiacin y el manejo de la seal, el mido aumenta dos o tres veces.
2- Debe mantenerse la absorcin del fondo por debajo de 0,5 unidades de absorbancia, valores superiores a 0,7 0,8 unidades no son completamente corregidos.
3- Hemos dado por supuesto que el fondo absorbe de forma continua dentro del paso de banda del monocromador.
Los correctores de fondo que emplean fuentes continuas son incapaces de corregir atenuaciones de fondo de espectros de excitacin electrnica, porque estos comprenden muchas lneas muy estrechas. As son, en general, los espectros derivados de transiciones electrnicas entre niveles rotacionales y vibracionales de un estado electrnico a otros estados electrnicos diferentes de una molcula.
El espectro de excitacin electrnica de la molcula de fsforo estudiado con una elevada resolucin espectral (165) est formado por un conjunto de lneas muy estrechas.
La lnea de resonancia del selenio est exactamente en la mitad de dos lineas rotacionales de la molcula de fsforo.
77
Debido a esto, existir poca atenuacin sobre la intensidad de la lmpara de ctodo hueco de selenio que emite exactamente a 196,0 nm.
Sin embargo, en la lmpara de deuterio si existir una atenuacin por absorcin detectada como continua.
Si la intensidad de la lmpara de ctodo hueco la intensidad de la lmpara de deuterio

(ILD)
(ILC)
disminuye en mayor proporcin que
se registrar una seal menor que la que
corresponde a la concentracin real de selenio, dado que la seal es la relacin de intensidades

1LC
1LD
seal.
En el caso de la absorcin de fondo del hierro suponemos que alguna de sus lineas coincide exactamente a 196,0 nm, con lo que las lecturas obtenidas son cada vez mayores a medida que aumentan las cantidades de hierro presentes.
Para ciertos autores estas interferencias slo son salvables con efecto Zeeman para corregir la absorcin del fondo, sin embargo el mtodo empleado por nosotros permite el empleo de una correccin rutinaria con lmpara de deuterio, exigiendo una adecuada optimizacin en el uso de modificadores de matriz, y en los parmetros programados para el calentamiento del horno.
Por otro lado se sitan algunos analistas que confan ciegamente en la correccin con lmpara de deuterio.
78
En esta memoria se demuestra que la correccin de fondo con lmpara de deuterio no es infalible. Sin embargo, conociendo sus limitaciones podemos establecer un mtodo que permita reducir la seal del fondo hasta conseguir un determinacin exacta y fiable.
IV.3.- OPTIMIZACION DEL PROGRAMA DE TEMPERATURAS
En el horno de grafito, sometemos a la muestra a una serie de pasos o rampas de temperatura creciente para liberar al selenio (elemento analito) de los diversos concomitantes hasta el mximo posible antes de pasar a la atomizacin final mediante un rpido incremento de la temperatura.
Cuanto mejor sea la separacin de elementos concomitantes de nuestro analito antes de la atomizacin, la determinacin estar ms libre de interferencias. La eficiencia de la separacin depende de la volatilidad del selenio en comparacin con los concomitantes.
IV.3.A.- PRE-TRATAMIENTO TERMICO. GAS DE PURGA
Para la vaporizacin del agua plasmtica, hemos comprobado experimentalmente que elevando la temperatura justo debajo del punto de ebullicin (900C) y mantenindola un tiempo prolongado (70 segundos) conseguimos llevar a sequedad la muestra sin que los problemas de chisporroteo y evaporacin brusca nos hagan perder muestra, consiguiendo con este tiempo
80
Manteniendo el horno 70 segundos a 90 0C se consigue una sequedad completa en el interior del tubo de grafito.
A 120 0C se eliminan completamente las sales ms voltiles.
Elevando la temperatura a 300 0C y mantenindola durante 20 segundos favorecemos la eliminacin de componentes con altas temperaturas de ebullicin como los oxocidos (166).
GAS DE PURGA
El gas de purga inerte (argn) juega un papel significativo en el rendimiento del horno
de grafito.
Su funcin primaria es prevenir el contacto del oxgeno atmosfrico con los componentes del grafito calientes que provocaran su combustin. Dado que el selenio atmico reacciona rpidamente con el oxgeno a altas temperaturas, la atmsfera de gas inerte se hace imprescindible.
Adems de esta funcin de proteccin, el argn transporta los concomitantes vaporizados
durante los pasos previos de pretratamiento trmico, evitando que se condensen en zonas fras.
Una corriente de gas bien controlada nos ha permitido reducir la atenuacin debida a la absorcin del fondo.
81
SENAL DE FONDO PRODUCIDA POR 10 4 DE SUERO, MIDIENDO LA ABSORBANCIA DE LA LAMPARA DE DEUTERIO:
SI(N~L (RAPM(S_ 3888

/
r
E
PI p
___________________
-$18
.....~.,....
...
e
42
TIME (se:: TEMF
12
TIME
SUP NO.
FLUJO DEL GAS DE PURGA DE 0,5 L/MINUTO
SI~N~L ~RhPhI(S
288
1
3888
r
E PI P
$28 8 TEMP
TIME (s?:~
e
4.3 SUP NO.
12
TIME
2FLUJO DEL GAS DE PURGA DE 3,0 L/MINUTO
82
El flujo de argn dentro y alrededor del tubo de grafito sirve para eliminar los componentes volatilizados en cada paso del anlisis, el flujo durante los pasos previos programados es el mximo permitido, de 3,0 1/minuto, para que la eliminacin de productos sea ms eficiente. As lo hemos comprobado:
Inyectamos 40 jA de suero diluido (1 parte de suero + 3 partes de Kl 10 mM), con flujo de 3,0 1/minuto.
Produce una absorbancia
= 0,164 registrada nicamente en la lmpara de espectro
continuo de deuterio. Corresponde por tanto a la absorcin molecular inespecfica.
Durante los pasos de atomizacin el gas debe reducirse a un flujo de O 1/minuto como veremos ms adelante para mejorar la sensibilidad del analito.
Si inyectamos igual cantidad de suero diluido en igual proporcin, con un flujo de 0,5 1/minuto de argn, la absorbancia
=
0,461 registrada tambin en la lmpara de deuterio.
En ambos casos se emplea una temperatura de calcinacin de 1200 0C y un estado de atomizacin de 2700 <C.
El gas usado durante este proceso de altas temperaturas debe ser de la mxima pureza posible, para evitar reacciones con los elementos de la matriz.
83
IV. 3.11.- CALCINA ClON. MODIFICADORES DE MATRIZ
Se han publicado diversos trabajos sobre la estabilidad trmica del selenio (163)(167). La tcnica ms popular es la que adiciona una solucin de nquel a la muestra antes del anlisis o en el horno de grafito.
Gracias al nquel se consigue evitar en cierto modo que el selenio se volatilice en los pasos previos.
CURVA DE VOLATILIDAD PARA 2.5 NG DE SELENIO EN SOLUCION ACUOSA SIN MODIFICADOR DE MATRIZ
Para este estudio hemos empleado el muestreador automtico programado para inyectar 5 1 de una solucin patrn de selenio de 500 jig/l (equivale a 2,5 ng de selenio en el tubo) y 25~l de HCI 0,5%. Se han realizado 5 rplicas por punto.
PARAMETROS DEL MUESTREADOR

VOLUMENES (M)
ESTANDAR .
BLANCO
MODIFICADOR ...
MUESTRA
25-
84
ABSORBANCIAS MEDIAS DE LA LAMPAR DE CTODO HUECO (5 rplicas) Abs. Medias C. y. (%)

T~ Calcinacin (0C)
0,126 0,130
0,137 0,106 0,089 0,078
17,4 10,8
5,3 5,9 8,2 9,8
400 450
500 550 600 700
Abcor a nc a 0.36 0.31
0.25
0.21 016 z 0.11 L
......
....
0.06 400
450
500
550
500
650
Curva de calcir 2,5 ng de se W r AtornEzacion a
Temperatura (00
85
Sobre una solucin acuosa, el selenio se pierde del tubo a temperaturas tan bajas como 600 0C, a las cuales, veamos antes, la absorbancia debida al fondo de la matriz srica es muy elevada, impidiendo la correccin adecuada con una lmpara de deuterio.
ESTABILIZACION TERMICA DEL SELENIO USANDO SOLUCIONES DE NIQUEL
Hemos programado las inyecciones automticas de 2 jfl de solucin estndar de selenio de 1000 ~g/l corresponde a 2,0 ng de selenio en el tubo de grafito) y 22 1 de HCI 0. 5% como blanco.
La influencia del tipo de sal de nquel empleada para la estabilizacin trmica se evidencia comparando las absorbancias obtenidas al usar:
-
Solucin de cloruro de nquel (NiCl
2. 6H20) 16,82 M que contiene 4 gramos de nquel
por litro; inyecta 5 ~1 corresponde a 20 yg de Ni. que

-
Solucin de nitrato de nquel (Ni(N03)2. 6H20) 19,80 M que condene tambin 4
gramos de nquel por litro; inyecta 5 jd que corresponden a 20 ~g de Ni.
PARMETROS DEL MUESTREADOR VOLUMEN (pl) ESTANDAR BLANCO MODIFICADOR
22
86
Nmero de rplicas por inyeccin = 10 Se ha usado una temperatura de calcinacin de 1000 0C y de atomizacin de 2700 0C.
Absorbancias (x S.D.) Modificador NiCI
0,35 0,014 0,72 0,077
Modificador Ni(N03)2
Se comprueba que en presencia de cualquiera de las sales de nquel el selenio se estabiliza 0C), siendo significativamente superior a la temperatura de calcinacin empleada (1100 (p<0,001) la cantidad de selenio que permanece sin volatilizarse al emplear Ni(N0 3)2 que cuando se emplea la misma cantidad de nquel (20 gg) en forma de cloruro.
CANTIDAD OPTIMA DE Ni(N0116H,O PARA ESTABILIZAR 25 uG DE
SELENIO
Inyectamos automticamente 5 1 de una solucin de estndar de selenio de 500 ~g Se/1 que corresponde a 2,5 ng del metal.
Empleamos, como blanco, HCI 0,5% y como modificador, nitrato de nquel.
Se han realizado 10 rplicas por medida.
87
~gNi 20 10 5 4 3 2,5
Abs. (x s. d.) 0,606 0,019 0,719 0. 011 0,799 + 0 022 0,835 + 0 088 0,793 + 0 063 0,119 + 0016
N0 rplicas 10 10 10 10 10 10
1
0,8
Abaorbanclas
0,6
0,4
0.2
10
15
20
25
pg de niquel
Cantidad optima de nitrato de nque para estabilizar 2,6 ng de selenio
88
Empleando soluciones que permitan una presencia de 4 yg de nquel en el tubo de grafito se estabilizan los 2,5 ng de selenio a los 11000 C empleados como temperatura de calcinacin.
CURVA DE CALCINACION DE 2.5 NG DE SELENIO CON MODIFICADOR DE NIOUEL
Para su estudio hemos programado una inyeccin automtica de 5 tI de estndar de selenio de 500 ~g/l de concentracin que corresponde a 2,5 ng de selenio), con 10 rplicas por punto,4 ti de una solucin de nitrato de nquel que contiene 1 gIl de nquel corresponde a 4ng de nquel.
Como blanco empleamos HCI 0,5
%.
PARMETROS DEL MUESTREDOR VOLUMENQd)

ESTAiNDAR BLANCO MODIFICADOR MUESTRA
19
El nquel en el tubo de grafito el selenio forma compuestos termoestables que le permiten permanecer en l sin volatilizarse hasta temperaturas muy superiores, incluso calcinando a 1100 ~C absorbancias de energa apreciables a 196,0 nm, debidas a los tomos hay de selenio liberados al elevar la temperatura del horno de grafito a 2700 0C.
89
Esta temperatura de atomizacin es la misma que la empleada en el experimento anterior.
bs. Medias 0. 220 0,215 0,252 0,329 0,335 0,361 0,369 0,402 0,213 0,174 0,095
fi
C. V. 96 4,6 7,5 2,8 4,4 5,9 6,6 3,2 2,1 3,2 6,0 4,2
T~ Calcinacin (0C) 200 300 500 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
90
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 200
300
500
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
Calcinacion de 2,5ng selenio en agua Atomzacion a 2700C Modificador de nquel.
El nquel estabiliza al selenio conseguindose un ptimo en la relacin seal/fondo cuando se calcina 1100 0C, pero a temperaturas superiores la prdida del analito es considerable.
Aunque estos resultados obtenidos con el nquel como modificador son satisfactorios y permiten la determinacin de selenio en solucin acuosa, la seal de absarbancia de fondo debida a la matriz srica es todava muy elevada a 1100 0C (0,247 unidades de absorbancia para 15 g de suero).
Esta elevada seal, dificulta la determinacin, provocando una sobrecorreccin del fondo, dado que la lmpara de deuterio no puede corregir correctamente la seal.
Otro dato importante es que el nquel pierde su funcin de estabilizador de los compuestos de selenio cuando est presente la glucosa (40 gg). Segn el estudio publicado por
Weibust (168) en 1981 hay diecinueve metales, incluidos el nquel y el cobre, que estabilizan
trmicamente el teluro inorgnico. De ellos slo nueve muestran efecto sobre la matriz orgnica. El paladio y el platino producen los mejores resultados, proveyendo una estabilidad a 1200 C.
Sobre la base de que el teluro es qumicamente similar al selenio hemos estudiado este efecto estabilizador trmico del paladio sobre el selenio:
CANTIDAD OPTIMA DE PALADIO PARA ESTABILIZAR 2.5 NG DE SELENIO
Inyeccin automtica de 5 tI de estndar de selenio de 500 tg/l de concentracin( 2,5 ng del metal). Empleamos como blanco HCl 0,5 % y cloruro de paladio (PdClD como modificador.
Las masas crecientes de paladio provocan un cierto retraso en el tiempo de aparicin de los tomos de selenio, as como un ensanchamiento de la seal de selenio. Hemos intentando emplear las cantidades mnimas de este elemento para modificar la matriz.
Preparamos una solucin de cloruro de paladio que contiene Pd 50 mg %, y programamos el muestreador automtico para la inyeccin de cantidades variables de modificador y blanco, igualando siempre el volumen final a 45 pI.
92
ME TODO DE DETERMINA ClON
Cada punto se estableci con 4 rplicas.
El programa de temperaturas establece una calcinacin a 1200 <C y la temperatura que alcanza para atomizar al selenio es 2700 0C.
M1 de solucin 1 3 6 9 12 14 16 18 20 25
gg de paladio 0,5 1,5 3,0 4,5 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 12,5 0768+0,040 0,848 0,037 0 901 + 0,021 0,843 0,041 0 921 + 0,033 1,049 0,026 0 963 + 0,022 0 928 + 0,038 0 764 + 0,052
De esta forma establecemos una ptima sensibilidad (mximo de absorbancia) con 16 ~I de modificador de paladio 50 mg% (8 ~g de paladio).
93
ME TODO DE DETERMINA ClON
1.2 1
Absorbancla
0.8
0.6
0.4
0.2 0.5
1.5
3.0
4.5
10
12.5
,ug Pd
de Pd necesarios para estabilizar 2,5 ng de selenio.
CURVA DE CALCINACION DE 2.5 NG DE SELENIO EN SOLUCION ACUOSA CON MODIFICADOR DE PALADIO. ATOMIZANDO A 2700 C
Inyeccin automtica de 5 pl de estndar de selenio de 500 ~g/l de concentracin(2,5 ng de selenio) con 16 gI de modificador de Pd 50 mg%(8 gg de PcI).
Se utiliza como blanco HCI 0,5 %.
94
PARMETROS DEL MUESTREADOR VOLUMEN (pl)
Las absorbancias de la nube de tomos de selenio formada al atomizar a 2700 C, con 4 rplicas por punto son:
Abs.Medias 0,708 0,703 0,703 0,737 0,730 0,870

0,855
C.V.% 5,5 6,3 10,5 6,5 8,1 16,3 7,5 8,4 18,4 7,1
Temperaturas(0C) 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
0,785 0,555 0,343
95
Absorba nc as
08
2
06
o .~
0.2
500
600
700
800
Temperaturas(00)
900
lODO
1100
200
1300
1400
Curva de calcinacion 2,3 ng Se en agua Atomizacion a 2700 ~C
Elegimos como temperatura ptima de calcinacin los 1200 oc, con modificador de 50 mg% de paladio.
96
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA (0C) DE CALCINACION SOBRE LA ABSORBANCIA DE 2.5 NG DE SELENIO
1.2
u-.-.
\
2.5 o
1.1
1 0.9
A b
8
4 -o o ~
0.8 0. T
0.6 0.6
o
1.5 p
o n d
o
1
0.4
0.3
0.2
0.1 0
0.5
-a
500 600 700
400
800
900 1000 1100 1200 1300 1400

Modificador Nl l5pi suero
Temperaturas Sin modificador Modificador Pd

1
-~
El tiempo necesario para alcanzar la temperatura de calcinacin de 1200 <>C se fija en 10 segundos, lo cual implica una velocidad de calentamiento de 90 0C por segundo, que permite la eliminacin de los compuestos volatilizados, manteniendo a 1200 <C durante 35 segundos.
El empleo de tiempos inferiores deteriora la reproducibilidad de la tcnica; aunque al prolongar los tiempos disminuye ligeramente la sensibilidad, hemos aceptado esos niveles de sensibilidad, obteniendo as una reproducibilidad aceptable para el mtodo.
97
REACCIONES DEL SELENIO EN EL HORNO DE GRAFITO
Existe una correlacin entre la estabilidad trmica de los seleniuros que se forman en el horno de grafito con los datos termodinmicos disponibles, probablemente debido a la formacin
98
de ms de un seleniuro con el modificador de matriz (169). La formacin de los seleniuros es funcin de la temperatura, lo cual explica la discrepancia entre los resultados expuestos por los distintos autores al emplear modificadores de matriz con compuestos de nquel o de magnesio.
No debe de olvidarse la influencia capital del estado de valencia del elemento selenio:
El estndar de selenio que hemos empleado es una solucin inorgnica de SeQV). Se observa una prdida en la seal de absorbancia a temperaturas relativamente bajas de 3000 a 6000C. Estos menores valores indicaran o que parte del analito no est atomizada, lo cual es muy improbable pues a una temperatura de atomizacin de 2700 >C es prcticamente imposible el que permaneciesen compuestos estables de selenio-paladio; o bien significa que una parte del selenio(IV) introducido en el horno se volatiliza como molcula a temperaturas inferiores.
Hemos inyectado automticamente 5 1 de estndar de selenio de 100 gg/l (para este estudio empleamos 0,5 ng de selenio en cada inyeccin).
Como modificador hemos empleado 3 tI de solucin de PdCI 1,5 pg de paladio).
2 50 mg% (que contiene
Las temperaturas de atomizacin en cadapunto son las especificadas en la tabla .En todos los casos mantuvimos como temperatura de atomizacin los 2700 C.
Se han realizado cuatro rplicas por punto.
99
Abs.Medias 0,22 0,192 0,183 0,145 0,156 0,183
C.V.% 2,1 3,5 4,4

5,9
Temperatura 0C 250 350 450

550
3,1 5,6
650 750
Abs.
0.1 250
380
480 850 Temperatura C
660
760
calclnacion 0.5 ng de Be<iV) ModIficador l.B~pg de Pd Atomizacin a 27000
de
60
Cuando se aade directamente la muestra de suero que contiene fundamentalmente Se(II) (seleniometionina) y se aade estndar inorgnico con Se(IV), parte del Se(IV) se pierde, mientras que el Se(II) se retiene cuantitativamente.
Inyectamos automticamente en el horno 5 il de selenia(l1) como selenio-metionina (0,5 ng de selenio). Usando el mismo modificador de matriz: 3 gI de PdCI2 50 mg% (1,5 pg de paladio).
Realizamos cuatro rplicas por punto, y repetimos las temperaturas de calcinacin della prueba anterior.
Abs.Medias 0,310 0,315 0,273 0,260 0,255 0,263
C.V.% 10,0 8,2 5,7 12,4 13,4 6,6
Temperaturas 250
650 750
101
Abs.
0.34
0.3 0.26 0.22 0.18 0.14
0.1
250
350
460 560 Temperaturas
660
760
Caloinacion de 0,6 ng de S.<Il> Modificador 1.Spg Pd Atomizacin a 27000
Es posible que exista Se(VI) en la muestra, pero su concentracin es normalmente muy inferior al Se (II).
Estos comportamientos variables del selenio segn el estado de oxidacin nos conducen a resultados demasiados altos para el Se(ll) de la muestra cuando lo medimos frente a un estndar de Se(IV), an cuando apliquemos la tcnica de adicin de estndar.
La cuantificacin del analito deber realizarse en igualdad de condiciones entre el selenio existente en el suero y el selenio inorgnico usado coma estndar; proponemos el tratamiento con un reductor potente que transforme todo el elemento dentro del tubo de grafito a un nico estado de valencia.
102
De todos los reductores probables hemos seleccionado el yoduro potsico porque no produce, a la concentracin utilizada, precipitacin de las protenas sricas, lo cual se presentana como un inconveniente, por obstruir el capilar del muestreador automtico.
Los selenitos, en medio cido, pasan a selenio elemental con los siguientes reductores:
-
metabisulfito sdico en caliente. sulfato ferroso en solucin clorhdrica yoduro potsico en medio clorhdrico en fro hidroxilamina en medio cido caliente tiourea en fro.
Otra posibilidad es el empleo de gas reductor: 5% 112 -95% Ar. Presentan el inconveniente de producir malas rplicas y su delicado manejo para evitar las explosiones, que lo hacen poco adecuado para el laboratorio clnico.
Adems, la alta termoestabilidad del H2Se es otro factor importante en la atomizacin, haciendo desaconsejable el uso de la mezcla H2/Ar porque se formara hidruro de selenio a 0C. 1500
Los compuestos selenorgnicos como la selenometionina y la selenocisteina son eficazmente reducidos por el Kl.
De todas formas, en el proceso de calcinacin se debe formar hidrgeno en la reaccin:
103
C( + 11,0
-*
CO<~ +
y la cantidad de hidrgeno formada es lo suficientemente grande como para afectar la eficiencia de la atomizacin, si se usan temperaturas para este proceso inferiores a 1800 0C (temperatura de disociacin del H,Se).
SOLUCION REDUCTORA DE Kl
Diluimos 230 ~dde suero con 250 d de Kl a distintas concentraciones; aadiendo 5 pI de estndar de selenio de 500 ~g/l, y 16 ~1 e Pd 50 mg% d
La presencia del yoduro aumenta la sensibilidad, pero en concentraciones altas provoca unos coeficientes de variacin altos, y un pico de atomizacin ensanchado.
Conc. Kl 0,5(M) 0,25(M) 0,125(M) 60(mM) 10(mM)
Coef. variac. % 28 30 16 8 4,5
Abs. 0,749 0,887 0,822 0,876 1,099
104
El objeto de aadir Kl no es slo reducir al selenio, si no tambin al modificador de paladio, ya que es necesario que se encuentre en estado reducido para formar el seleniuro termoestabte. Con Kl 10 mM tenemos equivalentes suficientes para reducir al selenio y al paladio, depositados en el tubo.
De esta forma, establecemos como diluyente ptimo para los sueros Kl 10 Mm.
11<3. CX- A TOMIZA ClON
Para la atomizacin de selenio necesitamos un rpido incremento de la temperatura,para obtener una densidad de nube de tomos que haga posible una sensibilidad adecuada a las bajas concentraciones del elemento en el suero humano.
Sin embargo, tampoco es conveniente exceder en mucho la temperatura de atomizacin, porque a ms altas temperaturas la expansin del gas y las prdidas por difusin en todo el volumen del tubo deterioran la eficiencia de la medida.
En todo caso se recomienda que la velocidad de aumento sea tan rpida como permita el instrumento; el Varian AA3O permite una velocidad mxima de 2000 <C/segundo.
La principal ventaja de un calentamiento rpido es que permite menores temperaturas de atomizacin y aumenta la sensibilidad.
los
El modelo experimental diseado estudia el efecto de la velocidad para alcanzar la temperatura de atomizacin (2700 0C) a partir de una temperatura de calcinacin de 1200 ~C, sobre 1 ng de selenio. Tiempo(segundos) 0,8 (mnimo permitido) 1,3 1,6 Absorbancia 0,553 0,443 0,379
~i
PR 1H11 NG
STflHUARD 1 REPLIUflIE ~BSOR~NCE S~$PLER P.UTOPIIX CONCENTRIION FE~K HEIGHT 1.8 (seO BC QN
SItWAL Gfl?hItS d 889 A, r N p
1.29
-~ 28 L
8. 443~ n8SOR8~NCE FEAK NEIGHT PRII4 It NG

1.20
CONCENTRATION 1.8 (seO BC QN

3808 A y 1 Ip
SIGNAL GRAMilES
~1.
8 28
106
ST~ND4~D 1 ES GR E A~C E FEAK HEIGHT PR 1H11 NG
0
METODO DE DETERMiNAClON
REPLIUTE CON CENT R ~110 N 1.8 (s~c~
SMPLER ~UTQMIX EC OH 3006
-~t
~P
Esta disminucin de la seal de absorbancia registrada supone un deterioro en la sensibilidad de la tcnica a todas las temperaturas de atomizacin ensayadas.
CURVA A DE CALENTAMIENTO RAPIDO
A partir de la temperatura de calcinacin de 1200 0C se ensayaron distintas temperaturas
de atomizacin a una velocidad de 2000 0C por segundo.
Los parmetros del muestreador fueron:
VOLUMEN (pl)
ESTAiNDAR 12 BLANCO 19 MODIFICADOR 16 ~MUESTRA
107
Programamos la inyeccin automtica de 12 gil de estndar de 500 ~zg/lde selenio,16

gil de modificador de 50 mg de paladio % y 19 it de blanco HCl 0,5% MIV. Con 4 rplicas
por punto. T3 de calcinacin (0C) 1800 2100 2400 2700 3000 1,004 + 0003 1,043 0,002 1,082 0,006 1,064 +0 010 Absorbancia (x s.d.)
Los perfiles de absorbanciaitiempo muestran que a baja temperatura de atomizacin (18000) la nube de tomos se origina ms dispersamente dando un pico de absorbancia ensanchado en el tiempo:
0.365
PRINTING 1 .28
~
PE4K HEIGHT
REPLGITE 2 COHCENTRATION 1.8 (seO
SAMPLER nUTOMX SC OH 3999
SIGWAL GRAPIIICS
ji
7-
Y E II P
108
1.004
PRIHTING A
STAHDAPO 1 ABSORBAN CE PEA~ NEIGUT
PEPLICATE CO NC E N 1 PAT ION 1 6
SAMPLER AUTO SC OH 3686
SIGW*L URAPMIES
Y 8
It
P4
<it
1.043
PRINTING A
~~1k E
PEAK HEIGNT
PEPLICATE 2 CONCE NT PATIOFI
1.8
(seO
SAMPLER SC OH 3608
SItW~L GEAFI1It.S
9,
9,
Y E M P
-a n
1 .062
PRINTING 1 20
-
SINUARUI PEAK HEIGNT
REPLICATE 2 CO NC ENT RA1 0 14 1.8 (sec)
SANPLER AUTOMIX SC OH 3888
SUNL GEAPIIICS
7.
y.
A E
-1
7-:
FI P
~
6.38
109
1.064
PRIHTING
J
PEAK. HIFJHT
REPLICATE 2 GONCE Nf PAT OH 1.6 (seO
S?1PLER AUTOMIX 60 ON 3080
SIGW~L GR~PHICS
A E
c.
9,
36
CURVA B DE CALENTAMIENTO LENTO
Conservando los mismos parmetros del muestreador que en la curva A,aplicando una velocidad de calentamiento de 1000 0C por segundo:
T0 de atomizacin (W) 1800 2100 2400 2700 3000
Absorbancia ( x s.d.) 0 315 + 0,010 0 501 + 0,008 0 673 + 0,009 0 782 + 0,012 0,926 0,011
110
METODO DE DETERMINA CLON
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
Abs.
1500
1800
2100
2400
2700
3000
Temp. atomizacion
curva B curva A
Influencia de la rampa de atomizacion
111
METODO DE DETERMINACLON
El calentamiento a una mxima velocidad consigue unas mximas sensibilidades, mientras que con un calentamiento lento no se alcanzan esas absorbancias.
El selenio pertenece a los elementos que forman dmeros estables (Se2) a muy altas temperaturas (163).Claramente, se requieren temperaturas mucho ms elevadas para conseguir la disociacin.
Seleccionamos como temperatura ptima de atomizacin 2700 <C, alcanzados en 0,8 0C por segundo) a partir de la temperatura de segundos (velocidad de calentamiento de 2000 calcinacin de 1200 0C.
En el paso siguiente mantenemos a 2700 0C durante 0,5 segundos, tiempo necesario para que se complete la atomizacin del analito
Es en estos dos pasos del programa a 2700 0C, uno de rampa y otro de meseta,cuando establecemos el comando de lectura que permite al detector integrar las seales recibidas durante estos 1,3 segundos, evitando la lectura el resto del proceso.
Incluimos un ltimo paso a 2700 0C durante dos segundos para limpiar los posibles residuos del tubo y dejarlo preparado para una nueva inyeccin, durante estos dos segundos reinstauramos el flujo de gas inerte a 3 litros/minuto.
112
REDUCCION
DEL
FLUJO
DE
GAS
DURANTE
LA
ATOMIZACION
VARIACIONES DEL PICO DE ABSORBANCIA CON EL FLUJO DE ARGON DURANTE LA ATOMIZACION
Valores obtenidos para 2,0 ng se de selenio modificados con paladio. Empleamos una temperatura de calcinacin de 1200 <C y una atomizacin a 2700 0C.
Pico de absorbancia
0.8
0.6
0.4
0.2 88
0.5
1.5
2.5
litros Ar/min
Reduccion del flujo de gas en la atomizacian.
Debemos ser conscientes de que la reduccin del flujo de gas durante la atomizacin puede acortar los tiempos de vida del tubo, debido a la exposicin al oxigeno atmosfrico, por tanto es deseable que el flujo de gas sea reducido el menor tiempo posible.
113
Dado que el pico de atomizacin se produce en la rampa (0,8 seg) de elevacin de temperatura, y existe un retraso en la interrupcin del flujo, hemos intercalado un paso de 1 segundo a 1200 0C con un flujo de 0,0 litros por minuto, para permitir la interrupcin completa antes de la atomizacin.
PROGRAMA COMPLETO DEL HORNO OPTIMLZADO
PASO.
.
TEMPERATURA
TIEMPO
FLUJOGAS 1/mm
LECTURA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
75 90 120 300 1200 1200 1200 2700 2700 2700
5.0 70.0 5.0 20.0 10.0 34.0 1.0 0.8 0.5 2.0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0.0 0.0 0.0 3.0 SI SI
-
114 IN.4.- OPTIMIZACION DEL MUESTREADOR
Determinamos la concentracin de selenio en suero directamente, tras diluirlo con el agente reductor (Kl 10 mM) en una proporcin de suero:KJ de 1:3
El suero deja un residuo en el interior del tubo de grafito tras repetidas inyecciones, el factor de dilucin de la muestra srica puede minimizar el residuo encontrado en el tubo, este residuo de carbn aparece despus de 30 a 40 inyecciones y de esta forma afecta al secado de la gota, y a la reproducibilidad. El tubo debe ser limpiado rutinariamente cada 7-8 muestras (167).
El mximo permitido de dilucin es el lmite de deteccin de la tcnica por llegar a seales por debajo de las que es capaz de distinguir del cero de concentracin.
Esta dilucin establecida permite que la cantidad de sangre extrada al paciente sea mnima, (precisamos tan solo 100 gil de suero) haciendo este mtodo perfectamente adaptable a la poblacin peditrica y a enfermos de cuidados intensivos.
Algunos autores describen el uso de Tritn X100 como diluyente al 0,5 % para facilitar el pipeteo en el horno de grafito. Es necesario en anlisis de sangre total, pero no para suero, y adems, precisa aadir antiespumante (en nuestra experiencia Antifoam E de Sigma). La mezcla de estos dos componentes aumenta considerablemente la seal de fondo, como observamos en la grfica siguiente, por lo que lo hemos rechazado su uso.
JIS
2.~26
Rl 71>1 G
E SOR E A NC E PE4~. REIGHT
STANOARO AOONS SAMPLER AUTOM1~ 1 9 ke B ACKGROUNO ONU
SijAl. CRI1IIIICS
/
3626
A
-9
~1 E
~1
IV.5.- PRE-INVECCION
Si el paladio de aade directamente al muestra se observa una precipitacin de componentes orgnicos con posible prdida de analito, esto puede ser debido o bien al propio Pd o bien porque el modificador contiene cido clorhdrico al 0,5% y supone una acidez excesiva para las protenas sricas.
El modificador (16 g) es pre-inyectado en el tubo de grafito y sometido al primer paso del programa, en 5 segundos alcanza los 90 C, el paladio se expande sobre la superficie de grafito y as promueve una mezcla del modificador con la muestra en la siguiente inyeccin.
El programa del horno comienza de nuevo con el primer paso cuando inyecta el suero diluido y el estndar.
116
La principal mejora introducida con la pre-inyeccin es evitar la precipitacin de la muestra, pero tambin alarga la vida de los tubos; mediante comparacin visual del interior del tubo, tras una serie de inyecciones, se demuestra una menor existencia de residuos.
El empleo de la pre-inyeccin no conleva diferencias analticas: Inyectamos 3 ng de selenio,con 16 4 de PdCl2 que contiene 50 mg% y ajustamos un volumen total de inyeccin de 45 ~ilcon HCl 0,5%
Datos obtenidos: Sin pm-inyeccin Coeficiente de variacin Absorbancia media N 0 de lecturas 9,1% 0,564 10 0,052 Con pre-inyeccin 9,1% 0,585 10 0,053
Desviacin estndar
IV.6.- EMPLEO DE PLATAFORMA
Segn los principios de espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grafito, el uso de plataforma de grafito es beneficioso para obtener eficiencias de atomizacin mayores, ya que el analito se vaporiza a la fase gaseosa a temperaturas menores.
117
Al emplear la plataforma, las temperaturas son ms uniformes en toda la muestra que cuando se usa el tubo directamente, en el que la parte de la muestra que est en contacto con la pared se calienta ms rpidamente.
Al realizar el experimento, para 2,5 ng de selenio, con 16 pl de PdCl2, con plataforma de grafito, hemos comprobado que el pico de atomizacin del selenio se retrasa unas dcimas de segundo.
Esto conleva la ventaja de presentar una mejor separacin del mximo de absorcin del fondo, sin embargo, los inconvenientes son ms numerosos:
1.- Disminuye ligeramente la precisin: pasa de 6,7% sin plataforma a 7,6% con plataforma al repetir cinco aplicaciones
2.- Disminuye la sensibilidad pasando de una absorbancia media de 0,653 sin plataforma a 0,500 con plataforma
3.- Disminuye el volumen total que puede ser depositado sobre la plataforma sin desbordarse, con lo que disminuye el lmite de deteccin del mtodo.
Estos inconvenientes, aadidos al hecho de que conseguimos calcinaciones a 1200 C sin prdida del analito, nos inclina a no usar las plataformas de grafito para el anlisis de selenio en suero humano.
118
0.653 1 r:
2 88
0EP~ A E- $C~ R B A NC
~.e (se-CONCENTR-AI:N
Dr ~ SprnPR
~uTON~ 3888
SlCb4t gFdIl(S .2 yy
Sin plataforma
0.500
~
<-rif -e.
.
!t
.> tl
~~U14ICS
Con plataforma
IV.7.- MEDIDA ANALITICA Y LECTURA
De la EAA se pide velocidad, alta precisin y los menores lmites de deteccin. Estos dos ltimos puntos pueden alcanzarse con el sistema de medida elctrica capaz de registrar mnimas diferencias en la absorcin. Pero estas, slo tienen significado si las seales son
119
estacionarias y estables. La estabilidad depende primeramente de la estabilidad de la fuente de radiacin y de la calidad del sistema ptico.
Para medir cambios de absorbancia que dependen del tiempo (este es el caso del horno de grafito) se suele registrar el mximo valor (altura de pico) generado durante la medida;o a un tiempo de respuesta dado, o despus de una sede de ciertas integraciones.
La otra posibilidad, es registrar valores integrados calculados de medidas instantneas durante un perodo de tiempo seleccionado (rea de pico).
Las medidas de rea de pico (absorbancias integradas) suelen ser las preferidas. Dado que la matriz influye en la velocidad de atomizacin del analito, las medidas hechas de la altura de pico variarn al modificarse la matriz, mientras que la absorbancia integrada estar menos afectada, siendo mejor la precisin alcanzada con medidas en rea de pico.
Sin embargo, cuando se analizan seales bajas, cerca del lmite del mtodo, la experiencia demuestra que el ms razonable usar la altura de pico porque el mido electrnico influye ms directamente en el rea de pico durante la integracin total.
En nuestras experiencias, las medidas en altura de pico son, para la mayora de las muestras, mayores y ms precisas. La exactitud, sin embargo, es mejor para el rea de pico y hace seguro que el instante de formacin de la nube de tomos quede estrechamente incluido en el paso de lectura, y no se extienda despus de la atomizacin.
120
Las alturas de pico medidas son mayores, asegurando mayor sensibilidad.
115
P Rl N Ti NG 1
. 20
1 DEW PEFLI CATE SOPEAN CE 7A.NOARO ACON PE1~4 ~ Ir, SIGIHuL CUEPI(S
., -
0~IPfER
AUTOMi:~
SC OH .3008
14 b
c.
Y FI P
Area de pico
-9.29
O. 320
PR! HM Fi G 1.20
NO.IADDN. PEAF~ HEGHT
REPLICArE STANDARD ADDNS SAMPLER AUTONIX 1.8 (seO SC QN 3886

-y
SI(Ni~L (UPHICS
A
-y-y
Altura de pico
E FI P
9-
-1.? 8
IV.8.- TECNICA DE CALII3RACION
Cuando la composicin de la muestra afecta directamente a la composicin del analito se recomienda realizar siempre la calibracin con patrones que sean idnticos a la muestra analizada.
121
La corroboracin de este posible efecto de la matriz sobre la recta de calibracin se comprueba cuando se observa que la pendiente de la curva obtenida vara ms de un 10-15% al realizarel anlisis sobre matriz acuosa o sobre la matriz compleja.
En la determinacin de selenio se observan los siguientes resultados:
SOLUCION ACUOSA
-Solucin estndar de 250 ~il/l -Modificador: Pd, 50 mg % -Realizada cinco veces, los valores medios obtenidos son: a
=
0,044
=0,003 =903~10~
fi
=1 =7,13 lO~
Siendo & y j3 los coeficientes de la recta: Y= & + fi X, en la que la ordenada representa los valores de absorbancia medidos, y las abcisas las concentraciones de selenio (gg/l) de los patrones.
El coeficiente de correlacin medio obtenido fue de r= 0,9698 (ov=O,Ol6).
MATRIZ SERICA
Se realiza una tcnica de calibracin por adicin de estndares en las que se toman seis
122
porciones alcuotas de la muestra (suero) previamente diluido 1:3 con Kl lOmM, se aaden cantidades crecientes conocidas del analito (alcuotas de una solucin de referencia) y se diluyen las muestras con igual volumen con solvente (HCI 0.5% m/V). Una porcin alcuota de la muestra se trata nicamente con el solvente (y por tanto contiene O gigl de selenio).
De esta serie de soluciones se obtienen los siguientes valores de calibracin, estimados con cinco rplicas de cinco sueros diferentes: cx =77
=
0,1334
,
0,007
fi
5,11 10~
=648i0-~
Siendo & y ~ los coeficientes de la recta: Y= & +
j~
X, donde la ordenada son los
valores de absorbancia medidos frente a la abscisa, que representa las concentraciones aadidas de patrn de selenio.
El coeficiente de correlacin medio obtenido fue: r=0,9296 (o%=O,O23).
La pendiente de la recta de calibracin acuosa (7,13 la matriz srica (5,11

.
1(V) es un 28% mayor que la de
IO-~) por lo que una tcnica de calibracin sobre una solucin de
referencia acuosa conducira a errores de exactitud.
En la siguiente grfica se representan comparativamente ambas rectas de calibrado aprecindose el aumento de la pendiente para la recta de calibracin de la solucin acuosa.
123
i5
A bs
10
30
40
56
66
70
pgM Se
Rectas de cahbracron
Dado que la composicin del suero vara de paciente a paciente ,es necesario emplear la tcnica de adicin para cada muestra. El contenido de selenio en la muestra se obtiene por extrapolacin al cero de concentracin. A continuacin se tiene en cuenta la dilucin previa del suero en el agente reductor Kl 10 mM (dilucin 1:3).
La tcnica de adicin de analito elimina solo las interferencias que afectan al gradiente de la curva analtica, pero no las que provocan una deriva paralela.
124
Es necesario preparar patrones qumicamente emparejados para que el comportamiento durante la descomposicin del patrn y el de la muestra sean comparables, y esto afecta a la viscosidad y al contenido de sales disueltas.
La obtencin de muestras alcuotas de muestras, asf como la adicin de cantidades crecientes de patrn de selenio y de solvente (HCl 0,5%) se realizan automticamente, ajustndose al siguiente programa:
PARMETROS DEL MUESTREADOR VOLUMENES(iI) ESTNDAR Blanco Adicin 1. Adicin2 Adicin 3 Adicin 4 Muestra 4 6 8 . 40 40 40 40 40 MUESTRA.. BLANCO 45 6 4 2 0 10 ..MODIFIC. 16 16 16 16 16 16
] 1
10
El muestreador automtico pipetea exactamente los volmenes especificados a partir de la siguientes soluciones:
125
Estndar: 200 pg selenio/l Modificador: 50 mg paladio/l Blanco: HCl 0,5% m/V Muestra: Suero diluido 1:3 en Kl IOmM.
Obtenindose dos rplicas por cada adicin.
Las concentraciones a las que corresponden los cuatro puntos de adicin son: 20 gig/l 30 ~ig/l 40 gg/l 50 xg/l
Se han elegido estos puntos porque se recomienda que la concentracin del patrn sea tal que la tercera adicin tenga un mximo de absorbancia de aproximadamente 0,5 unidades.
Con esta tcnica de calibracin, la grfica se establece en la porcin lineal de la curva analtica.
La aproximacin de la regresin de mnimos cuadrados se aplica a los puntos de calibracin para producir una grfica lineal. Por esta razn, es necesario elegir los volmenes de muestra, longitudes de onda analticas y parmetros operacionales adecuados para asegurar que las medidas de absorbancia estn en la regin lineal de la curva analtica.
126
Las adiciones deben ser de tal magnitud que la adicin ms alta sea aproximadamente tres veces la de la muestra original.
IV.9.- LINEALIDAD DE LA TECNICA
LV9.A.- LINEZILLDAD EN SOL UCION ACUOSA
Programamos las inyecciones de estndar (selenio), modificador (paladio) y blanco adecuadas para conseguir las siguientes concentraciones:
Se/1 0 10 20 30 40 50 60
Abs.Medias 0,078 0,110 0,187 0,257 0,316 0,391 0,465
CV (5 rplicas) 3,2 9,2 3,4 9,1 2,0 10,6 2,1
127
ig Se/l 70 80
-90
AbtMedias 0,525 0,601

0,669
%C.V.(5 rplicas) 6,8 6,3

6,5
100 110 120 130 140 150
0,746 0,812 0,825 0,853 0,876 0,947
2,0 10,2 6,3 9,7 6,0 5,6
Hasta 110 ~g/lla tcnica puede considerarse lineal, pues los datos obtenidos presentan un modelo de regresin lineal con un coeficiente de determinacin 9=0,9914.
IV. 9. B. LINEALIDAD SOBRE MATRiZ SERICA

-
Programamos inyecciones con la tcnica de adicin de estndar sobre un pooV de sueros para obtener las siguientes concentraciones:
128
Conc.Se ig/l 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO 110 120 130 140 150
Abs, medias 0,075 0,120 0,176 0,226 0,273 0,345 0,380 0,464 0,484 0,557 0,572 0,581 0,609 0,612 0,636 0,673
%C.V. (5 rplicas) 4,0 12,0 8,0 6,3 11,0 3,2 7,1 6,4 6,3 12,3 8,9 6,2 4,1 6,6 7,8 4,7
129
Hasta 90 gIl se presenta como una recta con un coeficiente de correlacin r=O,9948. Nuestras adiciones de estndar elegidas como tcnica de calibracin, se mantienen dentro del rango lineal del mtodo, ya que sin este requisito, las concentraciones calculadas para las muestras serian inexactas.
Abs
0.8
0.6
0.4
0.2
1
I
20 40 60 80 100
~*- Acuosa
.~
Serios 140 160
120
,ug Se/I LINEALIDAD
130
TV.1O.- SENSIBILIDAD Y LIMITE DE DETECCION
Sensibilidad o concentracin caracterstica.
Aceptando las normas del Grupo de Espectroscopia de Absorcin Atmica de la Sociedad de Qumica Analtica (U.K.):la sensibilidad es un nmeroterico que equivale a la concentracin de analito en solucin acuosa que produce un 1 % de absorcin.
El factor fundamental que influye sobre la sensibilidad de un equipo de absorcin atmica es la intensidad media de la corriente de alimentacin de las lmparas. Experimentalmente se demuestra que a medida que disminuye la intensidad media de corriente, aumenta la lectura en absorbancia para una misma muestra (2,5 ng de selenio con paladio):
Absorbanclas
1-2
a
1
a
0.8
0.6
--~-
0.4
II
mA
131
Intensidad de la lmpara (mA) 4 5 6 7
Absorbancias medias S.D. (n 3) 1 120+0 089 1 092+0 087 0,9260,092 0897+0 097
Sin embargo, pese a esta prdida de sensibilidad elegimos 7 mA (mximo permitido) como intensidad de corriente, porque a intensidades menores la energa procedente de la lmpara de deuterio era excesivamente grande para aparearla con la energa de la lmpara de ctodo hueco de selenio.
Adems, dado que parte de la energa emitida por la lmpara es absorbida por el aire, para que llegue suficiente energa al detector, es necesario incrementar la intensidad media de corriente de la lmpara, pese a la prdida de sensibilidad.
La concentracin caracterstica es por tanto un nmero terico que depende de la eficiencia de la lmpara, atomizador y monocromador. Su mayor desventaja es que no tiene en cuenta el nivel de mido, por eso es de poco valor como gua en la menor cantidad de un elemento que puede ser detectada.
132
El 1 % de absorcin se obtiene de la siguiente forma:
I~ Ajustamos el instrumento con una solucin blanco (agua desionizada) y se registra la lectura de cero. Se comprueba que se cumple la ley de Beer (cuando la lmpara se oscurece totalmente, se obtiene una lectura de absorbancia de infinito). Existir una relacin lineal entre las concentraciones y las absorbancias registradas.
2o~ Se construye una curva de respuesta a la concentracin con una solucin de selenio,
y la concentracin que produce un aumento de la seal equivalente a una absorbancia de 0, 1 se lee en esta grfica. Si la ley de Beer se cumple: C01=K 0,1 (K=constante)
30
La densidad ptica y la absorbancia se definen como: log1<>10/10 donde l~ es la
intensidad de la luz incidente e 1 la intensidad de la luz transmitida. Si el 1 por ciento de la incidente ha sido absorbida (1% absorcin) entonces la absorbancia del medio est dada por: 1og10 100/99
=
0,0044
Aplicando de nuevo la ley de Beer: C1,=KO,0044 donde C1 ~ es la concentracin que produce un 1% de absorcin:
C1%=C0 -0,044
Partiendo de una solucin patrn de selenio de 250 gIl y cloruro de paladio <50 mg% de Pd) obtenemos una recta de calibracin:
133
METODO DE DETERMiNA ClON
0,044 + 7,l3~l0-3x
si y0,1 entonces x7,79 gil-. C C%
0~
C01 ~0,044= 7,79-0,044=0,343 gIl
Hemos inyectado 25 ~1de solucin, por tanto la sensibilidad absoluta ser de 8,57 pg.
Limite de deteccin
El lmite de deteccin se define como: La cantidad mnima de un elemento que puede ser detectada con un 95% de certeza. Esto es, la cantidad de un elemento que da una lectura igual a dos veces la desviacin estndar de una serie de al menos 10 determinaciones a/o cerca del nivel del blanco.
Esta definicin asume una distribucin normal de los errores.
Como la deteccin de errores no es siempre normal, este procedimiento puede que resulte un lmite de deteccin optimista.
Tomamos la recta que corresponde a la calibracin por adicin de estndar sobre suero, y
=
0,1334
5,11
y calculamos la recta paralela que pasa por el origen:
134
rabs &.Bx Bx
xcono. Se ugII
En esas mismas condiciones, y el mismo da que se obtuvo esa recta de calibracin, repetimos la lectura del blanco 20 veces:
n =20
y~ =0,0205
a =0,0025
y~
2a ~0.0255
si y
0,0255 entonces x
4,99 ~g/I
135
Dado que procede de una dilucin 1/4 del suero en Kl lOmM, la mnima concentracin que el mtodo es capaz de distinguir del cero es de 19 gIl.
Es preciso recordar que este es el lmite de deteccin establecido para la tcnica aqu descrita, es decir, con calibracin sobre matriz srica, con una intensidad de lmpara elevada (7 mA) y correccin con lmpara de deuterio, y que si se calcula este parmetro sobre solucin acuosa el lmite de deteccin es aproximadamente 100 veces menor (0,13 ppm).
IV.11.- INEXACTITUD E IMIPRECISION
Imprecisin
La imprecisin de la tcnica se evalu analizando el coeficiente de variacin intraensayo: en el da, y el coeficiente de variacin interensayo: en distintos das
Dado que en Espaa actualmente no existe ningn suero control comercial que tenga valorada la concentracin de selenio, hemos preparado un volumen de 50 ml formado por los excedentes de suero extrados en un da en el Hospital Ramn y Cajal de Madrid, a partir del cual preparamos alcuotas de 250 ~l, que se congelaron a -20 0C.
Estas muestras as obtenidas se procesaron como control con cada serie de sueros analizados.
136
Todas las muestras se analizaron por duplicado, dando como valor definitivo la media de las dos determinaciones,por tanto la desviacin tpica real ser la de las medias de cada dos:
k= n0 de parejas medidas x
=
2 (xx)2 k
media total de las k parejas
media de cada pareja
Imprecisin intraensavo
Determinando la concentracin del control 15 veces seguidas, con dos rplicas por determinacin, concluimos que el valor promedio del control es de 11,929 pgIl teniendo en cuenta la dilucin, correspondera a una concentracin en suero de 47,7 gIl.
La desviacin tpica es de 0,866 gIl y el coeficiente de variacin es de 7,26
%.
Imprecisin interensayo
Cada serie de sueros analizados inclua el control por duplicado, obteniendo como resultado:
137
11,3541
0,913
C.V.== 8,0%
Perfiles absorbancia/tiempoftemperatura obtenidos en el anlisis del suero control:
Adicin 1
1.28
3888
8 s
T E ti P
826 9
8 TIME <sec) 2.5
Adicin 2
138
126
2886
A S
T E FI P
8.26
TIP~E (sec)
2.5
Adicin 3
26
3896
A e 8
Y E FI
826 8
TIME (sec>
2.5
Adicin O
0.246
8
0.0
-
10.9
CONCENTRATION
77
Grfica de calibracin
139 Inexactitud
Para conocer la inexactitud de la tcnica hemos realizado un estudio de recuperacin consistente en aadir cantidades conocidas de selenio al suero control valorado y aplicar despus el mtodo analtico.
Sobre 500 1 de suero control diluido (contiene una media de 11,9 g/l de selenio):
1O~
Aadimos 50 1 de solucin patrn de 250 g/l (0,0 125 g de selenio)(volumen total
de 550 1). La concentracin esperada es 11,9g/l

-.
5,95-10~ g de selenio en
(5,95 + l2,5)~ t0~ ~~g/ 550l -. 33.5 pg/l
2o~ Aadimos 100 1 de solucin patrn de 250 gIl (0,0250 g/l)(volumen total de 600
1). Concentracin esperada: (5,95 +25110$g /600 1 -.51,6 gIl
Conc.terica
Conxabtenida (media n = 5)
Realperaci
Basal
+ 50 1 patrn
11,9 33,5 51,6 32,88 54,80 98% 106%
+ 100 1 patrn
140
[17.12.-COMPARACION CON OTROS METODOS
En la revisin bibliogrfica que hemos realizado para el desarrollo de este trabajo ,hemos encontrado otras tcnicas instrumentales aplicables al anlisis de selenio en fluidos biolgicos, en particular en suero humano. Exponemos aqu, razonadamente sus ventajas e inconvenientes:
Fluorometra. HPLC o CLAE (Cromatografa lquida de alta eficacia),con deteccin de fluorescencia. GCMS (Dilucin de istopos estables con cromatografa de gases y espectrometra de
masas).
-
Fluorescencia de rayos X. EAAGH (Espectrofotometra de absorcin atmica con generacin de hidruros). NAA (Anlisis molecular de activacin de neutrones). ICPMS (espectrometra de emisin con frente de plasma acoplado por induccin ,junto
con espectrometra de masas).

-
EAAHG (Espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grafito), correccin de
fondo con efecto Zeeman.
IV.12.A.- FLUOROMETRIA
Este mtodo est entre los ms antiguos y depende de las propiedades fluorescentes de los piazoselenoles (combinaciones de Se(IV) con diaminas aromticas, generalmente
141
diaminonaftaleno). Es ampliamente usado por los veterinarios, por razones de aplicabilidad y sensibilidad (en medios biolgicos y piensos).(5O)
Su principal desventaja es su mediocre reproducibilidad ,que algunos autores consiguen mejorar. (170)
Precisa personal entrenado,ya que es laborioso.Incluye una fase de extraccin ,generalmente con ciclohexano.El volumen de suero necesario es de 0,4 mililitros.ES un mtodo muy sensible,con un lmite de deteccin de 0,39 mmol.ltPudiendo usarse muestras de sangre o de orina. (169)
LV.12.B.- HPLC
Esta tcnica alcanza un lmite de deteccin de 0, 15 ng, con una precisin de un 1 % al nivel de 20 ng y de 3% al nivel de 1 ng.
Emplea volmenes de tan solo 50 1 de suero.
El inconveniente que presenta para el anlisis rutinario, es el complicado proceso de digestin y extraccin:somete la muestra una digestin cida con cido ntrico al 70% a una temperatura de 120 0C, despus a 150 0C y finalmente a 200 <C. Es preciso una saturacin con oxalato amnico, aadir HCI 6M para reducir los selenatos, adicionar cido frmico, separar
142
con pipeta Pasteur las sales amnica formadas y ajustar el pH. por ltimo se pasa a la fase de reaccin con el reactivo DAN(diamino naftaleno) con los consiguientes pasos de incubacin y extraccin con ciclohexano.(171)
IV.12.CI- GCMS
La cromatografa de gases con dilucin de istopos estables y espectrometra de masas (50) es uno de los mtodos que permiten exactitud, sensibilidad y precisin en la medida de la concentracin de selenio en fluidos biolgicos.
Precisa pequeos volmenes (unos 500 1 de suero), el coeficiente de variacin puede ser de tan slo un 1%.
Es un mtodo de referencia, pero no es aplicable a los laboratorios clnicos por sus elevados costes y la especializacin que requieren del personal.
IV.12.D.- FLUORESCENCiA DE RAYOS X
Hasta la dcada de los noventa, la fluorescencia de rayos-X no alcanzaba limites de deteccin adecuados a la valoracin de selenio en suero.
143
El mtodo consiste (172) en irradiar con un tubo de rayos-X de alta potencia (1 Kw para plasma) y usando una cmara de irradiacin cuya geometra permita incidir directamente en la muestra sin saturar el detector con los rayos-X que emite el tubo.
El tiempo de anlisis de cada muestra es algo superior al que empleamos en Espectrofotometra de Absorcin Atmica; con 500 segundos de irradiacin se consigue un lmite de deteccin de 20 ng/m, con un volumen de suero de 50 1.
El coeficiente de variacin descrito para una concentracin de selenio de 1 00.&g/l es de aproximadamente 11 % (50)
IV.12.E.- EAAGH
La espectrofotometra de absorcin atmica con atomizacin tras generacin de hidruros ha sido durante muchos aos la alternativa escogida para determinar selenio en orina, pudiendo practicarse en plasma, sangre total y tejido. (50)
Su principal inconveniente es el proceso previo de digestin de la muestra biolgica, que en muchas ocasiones es insuficiente.
La obtencin del hidruro consigue eliminar las posibles interferencias espectrales, alcanzndose medidas homogneas entre los diferentes laboratonos.
144
La cantidad de sangre requerida es de un gramo (173).
Este mtodo requiere que el selenio en la muestra se encuentra como selenio(IV), producindose errores cuando no es as (165) (174)
Los resultados obtenidos con generacin de hidruros son inferiores a los obtenidos con otras tcnicas, por problemas en la digestin previa (175).
Algunos procedimientos de digestin en cido ntrico, perclrico y sulfrico consiguen una exactitud aceptable (176).
Se han realizado estudios para comparar resultados obtenidos con tcnica de generacin de hidruros frente al horno de grafito, obtenindose una menor contaminacin en el horno de grafito (177).
La generacin de hidruros se usa frecuentemente para la determinacin de selenio, arsnico y mercurio en tejidos biolgicos (178).
LV.12.F.- NAA
El anlisis molecular de activacin de electrones es el procedimiento ms exacto y preciso, pennite determinar selenio total, el in trimetilselenio y el in selenito en suero y orina,
145
pudiendo cuantificarse todos los selenoaminocidos de la orina con una cromatografa de intercambio aninico previa (179).
Esta tcnica no es practicable en la mayora de las instalaciones, por requerir un reactor nuclear para irradiar las muestras.
Es el mtodo considerado de referencia.
IV. 12.0.- ICPM~S
La espectrometra de emisin con fuente de plasnia acoplado por induccin (ICP) realizada junto con la espectrometra de masas (MS) es una de las expectativas de futuro ms prometedoras.
Las primeras referencias emplean una generacin de hidruros de selenio previa, que requiere un volumen excesivo de suero (50 m), siendo el lmite de deteccin de 0,2 a 0,9 ng de 745e (170).
Posteriores modificaciones que emplean la tcnica de nebulizacin, necesitan volmenes menores (10 m) y consiguen una precisin del 1% (180).
Sin embargo, siguen siendo volmenes altos para la aplicacin clnica.
146
1V12.H. EAAHG
Muchos autores consideran la espectrofotometra de absorcin atmica en horno de grafito y correccin de fondo con efecto Zeeman como la tcnica idnea para cuantificar las concentraciones de selenio en medios biolgicos (181) (182)(183) (184) (185)(186).
La absorcin atmica con efecto Zeeman es la alternativa a la correccin con luz continua y est disponible en aparatos de las marcas Hitachi y Perkin-Elmer.
El efecto Zeeman consiste en la divisin de una lnea espectral atmica en presencia de un campo magntico. El campo magntico se aplica a la fuente de luz o al sistema de atomizacin. Si se usa un campo magntico modulado la absorbancia total se mide con el imn encendido y la absorbancia del fondo con l apagado (187).
Ventajas del Zeeman (163):
1.- Correccin para longitudes de onda visibles (no aplicable en el caso del selenio).
2. Correccin de absorbancias debidas a fondos estructurados, como la debida al fsforo en nuestro estudio.
3.- Correccin de interferencias espectrales, como las debidas a las lneas del hierro.
147
4.- Unica fuente de luz, sin posibilidad de mal alineamiento.
5.- Correccin de altas absorbancias de fondo.
Desventajas del Zeeman (188)(189) (190):
1.- Pobre sensibilidad, pues la separacin de las lneas atmicas es incompleta con las fuerzas del campo prcticas. Con el cobre por ejemplo, se obtiene un 53% de absorbancia.
2.- Las curvas de calibracin presentan una curvatura excesiva.
3.- El sistema de correccin no es lo suficientemente rpido para la continua variabilidad del fondo. La medida de absorbancia del fondo y la total estn espaciadas unos pocos milisegundos (8-10 milisegundos) con posibles errores originados por las rpidas seales obtenidas en el horno de grafito. La lmpara de deuterio realiza las dos medidas en dos milisegundos.
4.- Su elevado coste,
Existen tcnicas mejoradas para determinar selenio con Zeeman y una digestin cida previa (35)(191H.192)(193)(194)<195).
148
VALORES DEL RANGO DE REFERENCLA
y. VALORES DEL RANGO DE REFERENCIA

-
V.1.- POBLACION DE REFERENCIA
Para poder dar un uso clnico a las concentraciones halladas de selenio en suero humano deben establecerse primero los valores de referencia.
La IFCC (Federacin Internacional de Qumica Clnica) define los valores de referencia como aquellos que corresponden al conjunto de la poblacin supuestamente sana. Sin embargo, la salud no es una condicin bien definida, las fronteras entre la salud y la enfermedad son difusas, especialmente en el envejecimiento. Para seleccionar una muestra de la poblacin de referencia hemos seguido los criterios del Comit de Expertos de la Federacin Internacional de Qumica Clnica (196ft197)(19S).
Los individuos de referencia seleccionados provienen del Servicio de Medicina Preventiva del Hospital Ramn y Cajal, gracias a la colaboracin de la Dra. Pilar Rioboo.
Los individuos que sufren enfermedades sistmicas o alteraciones fisiopatolgicas como la insuficiencia renal, enfermedad cardaca congestiva, enfermedad crnica respiratoria, enfermedad heptica o sndromes malabsortivos han sido excluidos por examen clnico, investigacin de laboratorio y por cuestionario en entrevista.
Otros criterios de exclusin han sido la obesidad, hipertensin y el alcoholismo.
49
VALORES DEL RANGO DE REFERENCIA
Para evitar el efecto de las posibles variaciones circadianas (199) (200) (201) las muestras de sangre se recogieron en un tiempo fijo (8:00 a 10:00 horas), en ayunas doce horas, en tubos Venoject secos (Terumo Europe Nl, Leuven, Belgium) y se centrifugaron a 200g durante 10 minutos) para separar el suero. Las muestras se guardaron congeladas a -20 0C hasta el da del anlisis.
Hemos realizado subclasificaciones del grupo siguiendo criterios de edad y sexo.
La muestra presenta un total de 118 individuos comprendidos entre 15 y 65 aos, 49 varones y 71 hembras.
V.2.- DISTRIBUCION ESTADSTICA. TEST DE KOLMOGOROV-SMIRNOV
Cuando tomamos un nmero de individuos sanos (n=118) como muestra representativa de toda la poblacin sana, los valores hallados se distribuyen estadsticamente, en la mayora de los casos, dando lugar a lo que en estadstica se denomina distribucin eaussiana o distribucin norma] (202).
La representacin grfica de esta distribucin es la denominada currva de Gauss, cuya ecuacin es:
X
10
1K
150
-I,96
4
+I,9d
Vaiauu de rsfnnda
Debido a] azar, estos valores de referencia se agrupan en torno a la media, y la medida de la dispersin viene dada por la desviacin estndar (o), de tal forma que se admite que x + 1 ,96a es el intervalo que engloba al 95 % de todos los valores de referencia. De forma aproximada, se admite que en distribuciones normales o gaussianas, el intervalo est comprendido entre el lmite inferior ~2oy el lmite superior x+2u (1,962).
En aquellos casos en que la forma de distribuirse los resultados ng es gaussiana, aplicarse este intervalo de referencia.
ng puede
Para establecer cuales son los lmites que encierran al 95 % de la poblacin sana lo que debe hacerse es establecer los
fra~llln (fraccin de poblacin) que dejan
por debajo al 2,5 96
de la poblacin <fractil~,~) y por encima otro 2,5 96 (fractil0q75). Para ello, se ordenan todos los valores y se determinan cuales son los que ocupan estas posiciones.
151
Para saber si la distribucin de los valores de referencia de las concentraciones de selenio en sangre siguen o no una distribucin gaussiana aplicamos la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
Esta prueba se basa en el estudio de las diferencias existentes entre la distribucin de frecuencias acumulativas observada en la poblacin y la distribucin de las frecuencias acumulativas esperadas si la distribucin fuera gaussiana. Para ello, se busca cual es la mxima diferencia observada (D~) y se compara con el valor terico D~0 dado por la tabla de Lilliefors (202).
Esta tabla permite elegir entre varios valores D~<; uno de ellos es el D0,~ y otro valor de la tabla es el D01.
Si el valor de D~ encontrado es mayor que D0~, quiere decir que las diferencias encontradas son mayores que las que el azar explica, y se puede rechazar la hiptesis de curva gaussiana con una probabilidad de error menor de 0,05, es decir, con diferencia estadsticamente si2nificativa
Si el valor de D~, es mayor que D01, la probabilidad de error al rechazar la hiptesis de curva gaussiana sera de hasta 0,1 lo cual es un error algo elevado y si se aceptara la normalidad sea con un riesgo de error elevado.
Aplicado el test de Kolmogorov-Smirnov a la muestra completa se obtienen los siguientes resultados:
152 Media
64,2373
Desv.Tip.
19,7232
Err.Est.
1,8157
Mnimo
34
Mximo
116
Tamao
118
Diferencias tericas:
D01
0, 1252 (j,<0,05) 0,11231 (p<0,1)

=
Diferencia mxima observada: D~
0,12236
Como presenta una diferencia mxima observada mayor que la diferencia terica que el azar explica D0(,5, rechazamos la distribucin normal de las concentraciones de selenio en la poblacin adulta sana. Se considera aproximadamente normal (p <0,1) dado que D~
<
Los elementos traza que son controlados homeostticaniente (203) siguen una distribucin aproximadamente normal; en aquellos elementos cuya concentracin depende de factores como las diferencias geogrficas (25) (204) (205), composicin de los suelos (4), contenido en aguas y alimentos (27)(44)(98), forma mineral (208), contaminantes (206)(207), la distribucin se aleja de la curva gaussiana.
Para poder convertir los datos en una distribucin normal realizamos una transformacin logartmica mediante la omeba de Kolmogorov-Smirnov de bondad de ajuste de la distribucin de lo~<conc. Se~ a una curva ~aussiana
Realizando dicha transformacin logartmica los datos obtenidos se agrupan en las siguientes clases:
153
( Clase 1,57 1,62 1,67 1,72 1,77 1,82 1,87 1,92 1,97 2,02 2,07 (Iim.inf) 1,55 1,60 1,65 1,70 1,75 1,80 1,85 1,90 1,95 2,00 2,05 (d-x,) -0,24 -0,19 -0,14 -0,09 -0,04 0,01 0,06 0,11 0,16 0,21 0,26 ldt/s 1,89 1,50 1,10 0,71 0,32 0,08 0,47 0,87 1,26 1,65 2,05 rea 0,4713 0,4332 0,3643 0,2580 0,1300 0,0300 0,1800 0,3100 0,3946 0,4505 0,4798 esp. 0,03 0,04 0,07 0,11 0,16 1,97 0,13 0,08 0,06 0,03 0,02 esp* 3,44 4,57 8,27 12,76 19,20 18,00 15,60 10,15 6,71 3,44 2,42
f.~. obs. 5 10 13 22 16 16 11 9 4 8 2 1,56 5,43 4,73 9,24 -3,2 -2,0 -4,6 -1,15 -2,71 4,56 -0,42
Media
1,79
Desv. tip.= 0,13 Ex Ex2

= = =
214,54 385,49
=
1n
9,24/118 0,01
=
0,078
Diferencia mxima terica: D
0,09 (p <0,01)
154
Como la D~ es menor que D0,01 aceptamos la distribucin normal de la transformacin logartmica, con una probabilidad de error menor de 0,01.
Dado que el estudio de los datos estadsticos realizado con el selenio como variable dependiente presenta una distribucin no gaussiana para las concentraciones originales, los anlisis estadsticos realizados sobre la muestra, se han hecho aplicando mtodos no paramtricos en lugar de usar la transformacin logartmica para simplificar los resultados presentados, a pesar de s ser una distribucin normal dicha transformacin.
Distribucin de las conc.de Se en suero

30 26 20 16 lo
5
Frecuencias absolutas
15
25
35
46
56
66 75 85 Conc.Se ug/I
95
105 115 125 135
155
V.3.- PARTICION EN SUBCLASES SEGUN EL SEXO
Para comprobar si existen diferencias significativas entre los resultados procedentes de la poblacin masculina y los de la femenina hemos aplicado el test de Kruskall-WaWs (202), dado que hemos considerado los resultados como no paramtricos. Los resultados obtenidos fueron:
Sexo
E Rango 3105
Tamao 48 71
3916
El test se basa en ordenar crecientemente todos los datos, despus sumar los rangos correspondientes a las mujeres (SR2 =3916) y a los hombres (SR6 =3105), calcular sus medias mediantes las frmulas
~~2 =
SR2
y R6
SR6 ~hs.bres
calculndose adems la media total de los
rangos R=
N~+1
A partir de estos datos, se calcula el valor de H que viene dado por:

H.....L
Sn1(R1-R)
2(R2 -R) .en6(R6-R
156
Como hay empates, es decir a veces hay dos concentraciones de selenio iguales que al ordenarlas crecientemente tendran el mismo nmero de rango, se calcula el valor de mediante la frmula H~,,~=H/Factor de Correccin.
a
LT
Factor de Correccin
ti
-
a 1
(Sn.1)Sn(Sn.+ 1)
1 1
donde 7)
ti
siendo t~ el nmero de empates en cada grupo.
Efectuados estos clculos se obtiene: H

=
1,8608
=
2,6249
=
Factor correccin N0 de muestras

=
0,70891 118 Grados de libertad

=
Tamao global
Esta HC.,.,fl,d. se compara con un test x2 para ver su significacin. Probabilidad

=
0,10521 > 0,05
Las diferencias respecto al sexo no son significativas, pues la probabilidad de error al rechazar la hiptesis de que son dos grupos iguales es 0,10521 > 0,05.
En los datos procedentes de Nueva Zelanda (6)(23)(27)(209), Grecia (205) y Dinamarca (210)(211)(212)(213), tampoco se observan diferencias significativas entre los dos grupos; sin
157
embargo en Polonia (39) los hombres tienen mayores concentraciones de selenio en sangre que
las mujeres.
V.4.- INTERVALO DE REFERENCIA
El intervalo de referencia lo definimos mediante la fraccin que contiene el 0,95 central ( el 95 por ciento) de la distribucin de referencia.
Los lmites de referencia estimados son el fractil 0,025 y el 0,975. Estos lmites separan una fraccin de 0,025 (2,5 %) de los valores en cada cola de la distribucin de referencia:
Fractil Fractil
0,025
38 Mg1 111 ~g/l
0,975 =
La mediana de la distribucin (fractil
es 60 Mg1.
Asumiendo que el intervalo est hallado en unos valores de referencia obtenidos en un simple muestreo aleatorio, debemos acompaar estos fractiles de un intervalo de confianza (0,95
=
95%).
De esta forma el intervalo de referencia de la concentracin de selenio en suero en la poblacin adulta espaola es de 38
(3&42>
~g1 a 111
(07-112)
Mg1.
158
VALORES DEL RANGO DE REFERENCIA V.5.- VARIACION DE LA CONCENTRACION DE SELENIO EN SUERO CON
LA EDAD
Los anlisis de selenio efectuados a los 118 individuos sanos se han agrupado en 6 series, segn la edad.
Los resultados encontrados se muestran en la siguiente grfica, en la cual se incluye el 95% de confianza.
CONCENTRACIONES DE SELENIO POR EDADES

120 100 80 60 40
20
Conc.de selenio (pg/>
-.1
a
10 20 30
0
40 60
60
70
Aos
Cono, media
159
Hemos comparado las concentraciones de selenio halladas en los distintos grupos de edades con el fin de establecer si el factor edad establece diferencias significativas entre los
individuos de referencia. Para ello hemos aplicado el test de Kruskall-Wallis. Los resultados
obtenidos fueron:
Edad 0-19 20-29 30-39 40-49

50-59
SRango 260.5 2715.5 2669.5 971

228.5
Tamao 5 43 38 15
10
60-
176
Esta prueba utiliza como parmetros los siguientes valores calculados: H

=
23,3679 32,9633
=
Heorregido =
Probabilidad
3,82- 10~
La probabilidad encontrada es de 3,8 UY6, muy significativa, por lo que podemos deducir que la edad provoca unas diferencias significativas (p < 0,001) entre las concentraciones de selenio de la poblacin sana.
160
Se observa un aumento progresivo del contenido de selenio en suero hasta los 30-40 aos,
edad a partir de la cual comienza un descenso. Estos resultados concuerdan con los alcanzados
por otros autores (214ft215ft216)(217).
Con el nmero de individuos estudiados en nuestro trabajo no es posible establecer valores de referencia para cada grupo de edad como sera aconsejable en este caso, ya que algunos grupos, especialmente los ms extremos tienen tan solo 5 y 7 individuos, por lo que son claramente insuficientes.
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Se ha puesto a punto un mtodo de anlisis mediante espectrofotometra de absorcin
atmica con horno de grafito, que permite determinar selenio en suero humano eliminando las interferencias producidas por otros elementos, principalmente fsforo, presentes en el suero humano (absorcin de fondo del suero), y evitando las elevadas prdidas que se originan frecuentemente por la inestabilidad trmica del selenio.
Con objeto de disminuir la elevada volatilidad del selenio, y evitar las prdidas en el anlisis, se ha empleado una solucin de nitrato de nquel. Calcinando a 1100 0C, temperatura
idnea a partir de la cual la prdida de analito es considerable, y atomizando a 2700 0C se
obtienen resultados satisfactorios pero la elevada seal de fondo no queda anulada y dificulta la determinacin.
Se ha sustituido el nitrato de nquel como modificador de la matriz por cloruro de

paladio. Los resultados obtenidos calcinando a 120<) 0C, manteniendo dicha temperatura 35 segundos, y atomizando a 2700 oc muestran una seal de fondo apta para el anlisis pero igualmente indican que se pueden originar prdidas de selenio si ste se encuentra en diferentes
estados de oxidacin [Se(IV)y Se(IIfl.
163
CONCLUSIONES
Para evitar las prdidas debidas a los diferentes estados de oxidacin que puede presentar el selenio en el suero se ha utilizado como reductor yoduro potsico que no origina
precipitacin de las proteinas sricas. La presencia de Kl produce no slo la reduccin del
selenio sino que tambin reduce al modificador de paladio originando un seleniuro estable.
5a
.-
Empleando Tritn X100 como diluyente del suero y Antifoam B como
antiespumante, necesario por la presencia del Tritn, se produce un aumento considerable de la seal de fondo que dificulta la medida, por lo que hemos rechazado su uso. La dilucin del suero se realiza directamente con la solucin reductora de Kl en una proporcin 1:3. De esta forma se precisa tan slo 100 M1 de suero, por lo que el mtodo de anlisis es perfectamente
adaptable a la poblacin peditrica o a los enfermos de cuidados intensivos.
Empleando el mtodo de las adiciones de estndar se han determinado los rangos
de linealidad de la tcnica de anlisis. Los resultados obtenidos muestran que hasta 110 ~g/l de selenio la tcnica es lineal si el ensayo se realiza sobre disoluciones acuosas y hasta 90 ~g/l si se efecta sobre la matriz srica.
7a
.-
La sensibilidad del mtodo, utilizando una intensidad de corriente de 7 mA para la
lmpara, es de 8,57 pg. El lmite de deteccin o cantidad mnima de selenio que el mtodo de anlisis puede detectar es 19 ~g/l.
La imprecisin entre ensayos realizados en el mismo da intraensayos es de 0,866 ~g/l y entre ensayos realizados en das diferentes interensayos es de 0,913 gIl. La inexactitud
164
CONCLUSIONES
del mtodo, deducida mediante la recuperacin de cantidades conocidas de selenio, oscila entre un 2 y un 5
%.
9a~
Con objeto de poder dar un uso clnico a las concentraciones halladas de selenio en
suero humano hemos establecido los valores de referencia, que son aquellos que corresponden
al conjunto de la poblacin supuestamente sana. La muestra presenta un total de 118 individuos comprendidos entre 15 y 65 aos, 49 varones y 71 hembras.
El estudio de los datos estadsticos, realizado con el selenio como variable dependiente mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, presenta una distribucin no gaussiana para las concentraciones originales pues la diferencia mxima observada Dmx mayor que la diferencia terica que el azar explica D()()j
= =
0, 12236 es
0,11231.
11?.- Realizada una transformacin logartmica mediante la prueba de KolmogorovSmirnov de bondad de ajuste de la distribucin de log(conc. Se) a una curva gaussiana, con objeto de poder convertir los datos de las concentraciones de selenio en una distribucin normal, se ha encontrado que la D~
=
0,078 es menor que D001
0,09. Por tanto,
aceptamos la distribucin normal de la transformacin logartmica, con una probabilidad de error menor de 0,01.
12a~~
Los anlisis estadsticos realizados sobre la muestra, se han hecho aplicando
mtodos no paramtricos en lugar de usar la transformacin logartmica para simplificar los resultados presentados, a pesar de s ser una distribucin normal dicha transformacin.
165
CONCLUSIONES
Aplicado el test de Kruskall-Wallis, dado que se han considerado los resultados como no paramtricos, para comprobar si existen diferencias significativas entre los resultados
procedentes de la poblacin masculina y los de la femenina, se han obtenido unos resultados que nos indican que las diferencias respecto al sexo no son significativas, pues la probabilidad de error al rechazar la hiptesis de que son dos grupos iguales es 0,10521 > 0,05.
14a~~
El intervalo de referencia de la concentracin de selenio en suero en la poblacin

(3642>
adulta espaola es de 38
gIl a 111
(1~l2)
gil, considerando como lmites de referencia
el fractil 0,025 y el 0,975, que separan una fraccin de 0,025 de los valores en cada cola de la distribucin de referencia y acompaando a estos fractiles de un intervalo de confianza del 95%.
1?.- Comparadas las concentraciones de selenio halladas en los distintos grupos de edades y aplicando el test de Kruskall-Wallis, se encuentra una probabilidad de 3,8- lOt muy significativa, por lo que es posible deducir que la edad provoca unas diferencias significativas (p <0,001) entre las concentraciones de selenio de la poblacin sana. Se observa un aumento
progresivo del contenido de selenio en suero hasta los 30-40 aos, edad a partir de la cual
comienza un descenso.
16~.- No ha sido posible establecer valores de referencia para cada grupo de edad como sea aconsejable, pues el nmero de individuos estudiados en nuestro trabajo no lo ha permitido ya que algunos grupos, especialmente los ms extremos tienen tan solo 5 y 7 individuos, por lo que son claramente insuficientes.
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INDICE
INDICE
OBJETIVOS PARTE GENERAL

L - Importancia nutricional del selenio
1 6
7
1.1.- Introduccin 1.2.- Implicaciones progresivas del selenio en biologa 1.3.- Necesidades y aportes de selenio en humanos
1.4.- Metabolismo del selenio 1.5.- Toxicidad del selenio 1.6.- Papel esencial del selenio 1.7.- Funciones biolgicas del selenio
.
7 8
10 16
18 20 21 23 31 33 33 34. 36 38
. .
1.8.- El selenio en las enfermedades humanas 1.9.- El selenio en la terapetica y profilaxis nutricional IL - Espectrofotometra de absorcin atmica 11.1.- Introduccin 11.2.- Principios bsicos 11.3.- Espectroscopia de absorcin atmica 11.4.- Instrumentacion I1.5.-Qu elementos pueden analizarse por AA
58
182
INDICE
PARTE EXPERIMENTAL
hL - Materiales y mtodos
60 61
.
111.1.- Instrumentacion
61
62
.
111.2.- Reactivos y estndares
111.3.- Limpieza del material RESULTADOS Y DISCUSION

IV. - Mtodo de determinacin
63
64
65
65
IV. 1.- Problemas de la determinacin de selenio en suero IV.2.- Absorcin de fondo del suero
73 78
IV.3.- Optimizacin del programa de temperaturas

IV.4.- Optimizacin del muestreador IV.5.- Pre-inyeccin
114
115
IV.6.- Empleo de plataforma

IV.7.- Medida analtica y lectura IV.8.- Tcnica de calibracin IV.9.- Linealidad de la tcnica
116
118 120 126 130 135 140 148
IV. 10.- Sensibilidad
y limite de deteccin
IV. 11.- Inexactitud e imprecin IV. 12.- Comparacin con otros mtodos
y. Valores del rango de referencia

-
V. 1.- Poblacin de referencia V.2.- Distribucin estadstica. Test de Kolmogorov-Smirnov V.3.- Particin en subclases segn el sexo
148
149 1 ss
183
NDICE
V.4.- Intervalo de referencia

V.5.- Variacin de la concentracin de selenio con la edad
157
158
CONCLUSIONES BIRLIOGRAFIA INDICE
161 166 180

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

DETERMINACION DE SELENIO EN SUERO POR ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCION ATOMICA

Memoria que para aptar al Grado de Doctor en Farmacia presenta

M~ VICTORIA SEIJAS MARTNEZ-ECHEVARRA Madrid, Junio 1992

FACULTAD DE FARMACIA QUIMICA INORGANICA Y BIOINORGANICA

A M~ Teresa Muoz por su apoyo.

Otros criterios de exclusin han sido la obesidad, hipertensin y el alcoholismo.

L IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

inflamacin de los vasos linfticos, anemia, hiperbilirrubinemia y leucopenia

IMPORTANCiA N(JTRCIONAL DEL SELENIO

Un informe publicado en 1973 por el Comit de expertos de la OMS seala que

A partir de este momento el selenio despierta un vivo inters en la alimentacin humana.

1.3.- NECESIDADES Y APORTES DE SELENIO EN

IMPORTANCIA NUTRICIONL4L DEL SELENIO

IMPORTANCIA AJUTRICIONAL DEL SELENiO

En lo que concierne a las carnes, los contenidos varan entre

La leche de vaca slo aporta 0. 02 pg de selenio por litro (31).

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

TABLA DE CONCENTRACIONES SERICAS EN LAS DIFERENTES REGIONES DEL MUNDO:

4,5,33,34 6, 23 3, 21, 29, 35 22 36 37 38 39 20

<20 30 - 50 45 + 20 55-107 88+ 17 78+14 9 151 + 34 78 60-220

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

TABLA DE APORTES DIARIOS OPTIMOS DE SELENIO

APORTE OPTIMO sg/da

10-40 20-60 20-80 30-120 50-200 50 - 200 50 - 200

Se puede establecer que la necesidad mnima en este pas es de 20 sg/da.

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO 1.4.- METABOLISMO DEL SELENIO

los americanos y entre 4 y 10 mg para los neozelandeses.

Adenosina 5selenofosfato + PP~ GSSeO 3

Adenosina 5selenofosfaro H2SeO3 + 4 GSH

GSSeSG + 2 NADPH GSSeH + 2 NADPH

metablica de la metionina. Puede sustituir a este aminocido en las protenas.

TOXICIDAD DEL SELENIO

por la puesta a punto de especialidades farmacuticas de uso teraputico y profilctico en la

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

Estos valores dependen de la va de administracin y de la forma qumica, de la edad del animal.

El tratamiento de las intoxicaciones se basa en el aporte de metionina, de vitamina E, de sulfato y de arseniato.

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

En humanos la DL SO por va oral se estima entre 0, 5 y 1 g en forma de selenito o de selenato de sodio.

1.6.- PAPEL ESENCIAL DEL SELENIO

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

1.7.- FUNCIONES BIOLOGICAS DEL SELENIO

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

SELENOENZIMA GLUTATION PEROXID ASA

Esquema de una subunidad

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

En el hombre existe una elevada actividad en el hgado y en los eritrocitos. (7fl10)(14).

iMPORTANCIA NUTR CJONAL DEL SELENiO 1. 8. - EL SELENIO EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS

L 8.A. LOS DESORDENES MUSCULARES

La enfermedad de Keshan es la primera afectacin muscular en la que la

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

1.8. B. LOS DESORDENES SANGUNEOS

1.8. Ci- LAS ENFERMEDADES NEUROLOGICAS DEGENERA 7IVAS

Un aporte marginal de selenio limita su actividad (83)(84).

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

L8.D.- LOS DESORDENES DIGESTIVOS

En la cirrosis biliar primaria se repite esta misma situacin (89).

IMPORTANCiA NUTRICIONAL DEL SELENIO

1.8. E. LOS DESEOUILIBRIOS ALIMENTARIOS

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

Estos estudios fueron ampliamente discutidos por haberse realizado en animales.

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO

IMPORTANCIA NUTRICIONAL DEL SELENIO