UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

BIOLOGIA CELULAR

MICROSCOPIA II
 MICROSCOPIA II

La observación de las células vivas.

Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente
(como un láser), las ondas están en fase, o sea, los picos y los valles de las
ondas coinciden. Esto tiene el efecto de reforzar las ondas y crear una mayor
amplitud, que percibimos como un aumento en el brillo. Sin embargo, cuando
las ondas de luz están fuera de la fase, se interfieren entre sí reduciendo la
amplitud y el brillo.
Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se
difractan y sus trayectorias cambian ligeramente. Esta difracción altera las
relaciones de la fase de las ondas, dando como resultado cantidades variables
de interferencia. La cantidad de interferencia producida cuando la luz atraviesa
las diferentes estructuras de una célula no es grande, y el contraste que se
detecta es escaso cuando la célula se observa con un microscopio óptico
común, lo cual por su puesto, es la razón por la cual las células deben teñirse.
Sin embargo en los microscopios de contraste de fase y de interferencia
diferencial, sistemas ópticos especialmente diseñados intensifican la escasa
interferencia y proporcionan un mayor contraste. La resolución de estos
microscopios es limitada, como ocurre en un microscopio óptico común, pero
suministran una perspectiva diferente de la célula viva, mostrando aspectos
difíciles de detectar en otro sistema.
Otra técnica usada frecuentemente en las células vivas es la
microscopia de campo oscuro. El haz de iluminación llega a la muestra desde
el costado y los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por el espécimen,
que aparece como un objeto brillante contra un fondo oscuro. Los rasgos de las
células que son visibles en estas fotomicrografías, a menudo adquieren un gran
relieve en las de campo oscuro.
Actualmente, ocurre un rápido progreso en el uso de otras técnicas
microscópicas; por ejemplo, acoplando cámaras de televisión a los
microscopios ópticos es posible efectuar las observaciones en la pantalla y
grabarlas en una cinta de video. Ajustando los controles, como puede hacerse
en un aparato de televisión, el “ruido “ de fondo puede reducirse, mejorar el
contraste e intensificar aspectos particulares. Las técnicas de televisión
aplicadas al estudio de la célula viva están en su infancia, pero están
generando gran excitación, dado que revelan procesos no vistos previamente
dentro de la célula.
 Actividad Nº1

Si bien existen microscopios que incluyen en su mecánica la

alternativa de realizar observaciones por la técnica de microscopía de campo
oscuro, el propio microscopio de campo claro puede ser adaptado para realizar
una observación con esta técnica de manera muy simple.
Se le entregará una sección de cartón negro el cual Ud. deberá
recortar siguiendo la línea demarcada para obtener un circulo de papel negro.
Proceda a observar en una primera instancia la muestra que se le
entregará con su microscopio de campo claro normal (4X, 10X y 40X). Luego,
coloque el circulo negro sobre la fuente de luz en la parte inferior del
microscopio, de manera tal que la luz pase solo por los costados del círculo.
¿Cuál es la diferencia en la observación con el microscopio de campo
claro y el de campo oscuro? Describa este cambio observando con el objetivo
40X.

De la misma manera es posible jugar con la luz del microscopio de

campo claro de manera de “transformarlo” en uno de contraste de fases o de
interferencia diferencial.
En primer lugar, coloque su muestra en el microscopio y enfoque a un
aumento de 10X.
Con la ayuda de un cartón negro, interponga lentamente éste entre la
fuente de luz y la platina del microscopio. Observe que pasa con los contornos
de las células.
¿Cuál es el efecto obtenido? Describa.

Actividad Nº2

Dentro de las posibilidades de resolución del microscopio óptico, es

posible medir tamaños de células y estructuras (núcleo, nucleólo, vacuolas,
cloroplastos).
Para realizar estas mediciones, se necesita tener una reglilla en el
ocular del microscopio. Esta reglilla posee una escala que contiene 100 rayas
sin unidades. Por lo tanto, previo a medir una célula hay que calibrar esta
reglilla para cada aumento del microscopio.

La calibración se realiza usando un portaobjetos especial, el cual tiene

en su parte central una lámina de vidrio en el cual existe grabada una escala de
milimetros, apareciendo 2 a 3 mm. Un mm está dividido en 100 rayas ¿A
cuanto corresponde una de ellas?
 Para calibrar la reglilla ocular, se enfoca el portaobjetos de calibración
a un determinado aumento y se colocan en paralelo ambas escalas como
muestra la figura:
1 mm

1 2 3 4 5 6 7 85 9 10

0 5 10

Aquí se muestra que el cero de la reglilla coincide con 0.1 mm y el 10 con 0.6
mm. ¿Cuantas rayas corresponderían a 1 mm?
Si una célula medida con la reglilla (al mismo aumento de calibración)
corresponde a 20 rayas, calcule cuanto mide en mm. ¿Podría calcular cuanto
mide en cm?

Actividad Nº3
“Determinación del número de células”

En muchos aspectos de la biología celular, fisiología e incluso en patología

humana es necesario determinar el número de células en suspensión. Por
ejemplo, en hematología humana no tan sólo es importante conocer el tipo y
características de las células presentes en la sangre, sino que además el
número de cada una de ellas presentes en un volumen determinado (por ej.: 1
ml o 1 mm3).

Para este tipo de determinación se usa una especie de portaobjetos

especialmente diseñado y conocido como Hemocitómetro (o Hematocitómetro).
También es conocido como cámara de NEUBAUER.

1) Su ayudante le entregará una suspensión de eritrocitos cuyo número de

células por ml tendrá que ser determinado por Ud.
2) Saque una alícuota de 1 ml de la suspensión de células y llévelos a 10
ml con PBS (NaCl 0.15 M, NaH2PO4 10 ml). Agite bien para obtener una
mezcla homogénea.
3) Para determinar el número de células en una suspensión se usa una
cámara de NEUBAUER. Esta cámara presenta un retículo con una
superficie total de 9 mm2, dividida en 9 cuadrados de 1 mm2 cada uno.
Los cuadrados de las cuatro esquinas están subdivididos en 16
cuadrados y el cuadrado central en 25.
Para el recuento de células preparadas usaremos los 4 cuadrados de las
esquinas. La cámara se carga colocando primero un cubreobjetos sobre el
reticulado y posteriormente dejando deslizar una gota entre el cubreobjetos
y la cámara. Espere unos 5 minutos para permitir que las células
sedimenten. Enfoque el reticulado de la cámara, primero con el lente de
menor aumento del microscopio y luego cambie al objetivo 10X, lo cual
permite ver sólo un cuadrado de 1 mm x 1mm en todo el campo (16
cuadrados chicos). Cuente las células que ve y repita esta operación en los
otros tres cuadrados.

Saque un promedio de la cantidad de células en cada cuadrado. Para

obtener el número de células por ml hay que conocer el volumen de la
cámara: 1mm x 1mm x profundidad (la distancia que hay entre la cámara y
el cubreobjetos y que es igual a 0.1 mm).