Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

Protocolos generales para cortes histolgicos de ovarios de peces.

Este fichero incluye: Preparacin de formol Protocolo procesador de tejidos Protocolo de tincin H-E general Protocolos de tincin especficos

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

Preparacin de formol tamponado para gnadas:

3.6 % formaldehido: 1 litro formol (35/40) 9 litros agua 46.0 g Sodio dihidrogenofosfato 81.9 g Di-sodio hidrogeno fosfato

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

Procesador de tejidos
Etapa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Total Solucin Etanol 70 % Primer Etanol 96 % Segundo Etanol 96 % Primer Etanol 100 % Segundo Etanol 100 % Etanol-Benceno al 50 % Primer Benceno Segundo Benceno Benceno-Parafina al 50 % Primera Parafina Segunda Parafina P1 1h 2h 2h 2h 2h 3h 2h 2h 3h 4h 23 h Programa P2 P3 5 30 1 h 30 1h 1 h 30 1h 1 h 30 1h 1 h 30 1h 2 h 15 1 h 30 1 h 30 1h 1 h 30 1h 2 h 15 1 h 30 3h 2h 16 h 35 11 h 30 Tipo P4 45 1 h 30 1 h 30 1 h 30 1 h 30 2 h 15 1 h 30 1 h 30 2 h 15 3h 17 h 15 1h 2h 2h 2h 2h 3h 2h 2h 3h 2h 2h 23 h

NOTA: El Programa P2 se utiliza cuando se retrasa el comienzo ms de 40 minutos. Si el proceso comienza en el momento de poner en marcha el procesador entonces usar el P4

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

Protocolo de tincin de cortes histolgicos de ovarios

Etapa Solucin Tiempo Etapa Solucin 1 Primer Xileno 20 min 14 Carbonato de Litio 2 Segundo Xileno 20 min 15 Agua destilada 3 Primer Etanol 100 % 5 inmersiones 16 Etanol 70 % 4 Segundo Etanol 100 % 1 min 17 Etanol 80 % 5 Tercer Etanol 100 % 1 min 18 Eosina Floxina b 6 Etanol 96 % 3 min 19 Primer Etanol 96 % 7 Etanol 80 % 3 min 20 Segundo Etanol 96 % 8 Etanol 70 % 3 min 21 Tercer Etanol 96 % 9 Primera Agua destilada 5 min 22 Primer Etanol 100 % 10 Segunda Agua 5 min 23 Segundo Etanol 100 destilada % 11 Hematoxilina de Harris 4 min 24 Primer Xileno 12 Alcohol cido 4 inmersiones 25 Segundo Xileno 13 Agua corriendo 10 min 26 Tercer Xileno Tiempo 10 sg. 5 inmersiones 5 inmersiones 1 min 1,5 min 3 inmersiones 1 min 1 min 3 inmersiones 1 min 5 inmersiones 5 min 3 min

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

Hematoxilina-Eosina
Soluciones
Hematoxilina de Harris (Papanicolau) Alcohol cido: 5ml HCL concentrado en 1000 ml EtOH 70% Carbonato de Litio: Disolver Cabonato de Litio en agua destilada hasta saturar Eosina-Floxina: Solucin almacn de Eosina: Solucin almacn de Floxina B: 10 g de Eosina Amarillenta 1 g de Floxina B 1000 ml de agua destilada 100 ml de agua destilada Solucin de trabajo: 100 ml de Eosina almacn 10 ml de Floxina B almacn 780 ml de EtOH 95 % 5 ml cido actico galcial

Mtodo
1- Desparafinar, hidratar 2- Teir con Hematoxilina 3- Lavar y diferenciar con alcohol cido y Carbonato de Litio 4- Deshidratar con alcohl hasta 80% 5- Tratar los cortes con Eosina-floxina 6- Lavar 7- Deshidratar 8- Montar

Protocolo Autoteidor (programa 2)

Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 EXIT Estacin 16 1 4 W4 7 W1 15 (cub 15) W2 14 (cub 14) W3 5 6 3 2 17 18 Reagente Xileno Etanol 100 % Etanol 80 % Agua Papanicolau (Hemato. Harris) Agua Alcohol cido Agua Carbonato de Litio Agua Etanol 70 % Eosina Floxina b Etanol 96 % Etanol 100 % Xileno Xileno XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 4:00 2:00 0:10 3:00 0:10 1:00 1:00 2:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto N N N N S N S N S N N S N N N N

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

HEMATOXILINA-VOF
Soluciones
Hematoxilina de Harris Colorante VOF Se mezclan en un mortero 0.8 g de Verde luz SF amarillento 1 g de Orange G 1.2 g de Fucsina cida hasta obtener un polvo castao uniforme. Se aaden 200 ml de agua destilada a unos 90 y agitamos hasta disolver, luego se deja enfriar a la temperatura del laboratorio, aadiendo 3.0 g de cido fosfotngstico y despus de disolverlo se adicionan 8 ml de cido actico glacial y 400 ml de Etanol absoluto. El colorante as preparado se puede conservar por tiempo indefinido en un frasco de color topacio.

Mtodo
1.Se desparafinan los cortes 2. se llevan a agua destilada. 3. Hematoxilina .................................................................. 3-5 min. 4. Se viran con agua corriente, 5. Se lavan con agua destilada y despus de bien escurridos 6. Colorante VOF ............................................................... 3-4 min. 7. se lavan ligeramente 8. se pasan a etanol absoluto renovndolo tres veces y seguidamente se llevan a xilol donde despus de dos cambios se montan.

Protocolo Autoteidor (programa 5)

Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 EXIT Estacin 16 1 4 W1 11 W2 15 (cub 15) W3 9 W4 5 3 2 17 18 Reagente XILENO ETANOL 100% ETANOL 80% AGUA HEMATOXILINA HARRIS AGUA ALCOHOL CIDO AGUA VOF AGUA ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% XILENO XILENO XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 4:00 3:00 0:10 3:00 3:30 1:00 1:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto NO NO NO NO SI NO NO NO SI NO NO NO NO NO NO

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

CARMIN DE BEST
Soluciones
a. Carmn para guardar Aadir a 120 ml de agua destilada hirviendo: 4 g de Carmn 2 g de Carbonato de Potasio 10 g de Cloruro de Potasio Hervir durante 5 minutos (usar frasco grande para evitar salpicaduras) Enfriar y aadir 40 ml de amonaco concentrado Filtrar y guardar en un recipiente oscuro a 4C, donde se conserva varios meses. b. Solucin de Carmn para trabajar Solucin para guardar................160 ml Amonaco concentrado..............160 ml Metanol......................................160 ml c. Diferenciador de Best Metanol......................................120 ml Etanol.........................................240 ml Agua destilada...........................300 ml d. Hematoxilina (de Harris). Consejos Filtrar la solucin de Carmn para evitar que precipite en la preparacin.

Mtodo
1.Desparafinar e hidratar 2.Colorear el ncleo con la hematoxilina, y diferenciar en alcohol cido para que el fondo est claro. 3.Lavar en agua corriente 4.Teir con Carmn de 5 a 15 minutos (+tiempo cuanto ms vieja est la solucin). 5.Lavar bien en el diferenciador 6.Deshidratar en alcohol absoluto 7.Clarificar en Xileno

Protocolo Autoteidor (programa 6)

Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 EXIT Estacin 16 1 4 W3 11 W2 15 (cub 15) W1 13 14 (cub 14) 5 3 2 17 18 Reagente XILENO ETANOL 100% ETANOL 80% AGUA HEMATOXILINA HARRIS AGUA ALCOHOL CIDO AGUA CARMN DIFERENCIADOR ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% XILENO XILENO XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 4:00 3:00 0:10 3:00 5:00 10:00 1:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto NO NO NO NO SI NO SI NO SI NO NO NO NO NO NO

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

FEULGEN
Soluciones
a. cido clorhdrico 1 M cido clorhdrico concentrado...................... 17 ml Agua destilada...............................................183 ml b. Reactivo de Schiff c. Solucin de bisulfito Metabisulfito Potsico 10%.............................30 ml cido clorhdrico 1M......................................30 ml Agua destilada...............................................540 ml

Mtodo
1. Hidratar los cortes 2. Meterlos en ClH 1M a temperatura ambiente ...........................................1 min. 3. Meter las secciones en ClH 1M a 60C .................................................... 8 min. 4. Enjuagar las secciones en N-HCl a temperatura ambiente........................ 1 min. 5. Transferir las secciones a al reactivo de Schiff........................................ 45 min. 6. Sumergir las secciones en bisulfito, solucin (c)....................................... 2 min. 7. Repetir el lavado en bisulfito, solucin (c)................................................ 2 min. 8. Repetir el lavado en bisulfito, solucin (c)................................................ 2 min. 9. Lavar bien en agua destilada. 10. Contrastar si se requiere en 1% verde luz.................................................2 min. 11. Lavar en agua. 12. Deshidratar a travs de alcoholes gradados hasta xileno y montar. Notas a. El tiempo de hidrlisis es importante., y se debe usar el tiempo exacto de fijacin. b. El M-ClH debera estar precalentado a 60. c. Elas et al. Utilizan 5M ClH para la hidrlisis a temperatura ambiente. Pero el tiempo de hidrlisis debe ser mayor que a 60C

Protocolo Autoteidor (programa 7 y 8)

Paso 1 2 3 4 STOP 7 8 9 10 11 12 13 COMIENZO 14 15 16 17 18 19 EXIT Estacin 16 1 4 W1 campana campana campana campana campana campana campana W2 5 3 2 17 18 Reagente XILENO ETANOL 100% ETANOL 80% AGUA CLH 1M CLH 1M 60C CLH 1M REACTIVO DE SCHIFF BISULFITO K BISULFITO K BISULFITO K AGUA ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% XILENO XILENO XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 1:00 8:00 1:00 45:00 2:00 2:00 2:00 5:00 1:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto NO NO NO NO SI SI SI SI SI SI SI NO NO NO NO NO NO

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

AZUL DE TOLUIDINA
Soluciones
Azul de Toluidina: Azul de Toluidina 2.5 gr. Tampn actico-acetato pH 4.2 500 ml. Conservacin indefinida Tampn actico-acetato (pH 4.2): Acetato sdico 0.1 M 265 ml. 500 ml para el tinte, 500 ml para lavar cido actico 0.1 M 835 ml. Solucin acuosa de Molibdato Amnico Molibdato Amnico 20 gr. Agua 500 ml

Hay distintas maneras de hacerlo. Diluyendo el Azul de Toluidina en agua, o disolverlo en una sustancia
tamponada, como tampn actico acetato .

Mtodo 1- Desparafinar, no colodionar, hidratar

2- Teir con azul de Toluidina 5-10 minutos 3- Lavar con tampn 4- Tratar los cortes 10 minutos con molibdato amnico 5 Lavar con agua corriente 6- Deshidratar 7- Montar

Protocolo Autoteidor (programa 3)

Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 EXIT Estacin 16 1 4 W2 8 15 (cub 21) 14 (cub 19) W2 5 3 2 17 18 Reagente XILENO ETANOL 100% ETANOL 80% AGUA AZUL DE TOLUIDINA TAMPN MOLIBDATO AMNICO AGUA ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% XILENO XILENO XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 7:00 0:20 10:00 10:00 1:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto NO NO NO NO S S S NO NO NO NO NO NO

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,

Ecologa de la reproduccin y potencial reproductivo en las poblaciones de peces marinos

PAS
Soluciones
Acido periodico 2.5g de acido periodico 500 ml de agua destilada Reactivo de Schiff Hematoxilina de Harris Orange G-molibdico 10 g naranja G 500 ml Agua destilada 5 g cido fosfomolbdico

Mtodo (segn Marta Muoz)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Desparafinar e hidratar Oxidar con cido peridico 1% en agua destilada (10 minutos) Lavar con agua corriente (10 m). Agua destilada Tratar con el Reactivo de Schiff (10 m) Lavar con agua corriente (10 m). Agua destilada Teir con Hematoxilina de Groat (2 m) Lavar con agua corriente (5 m) Teir con Orange G-molbdico (3 m) Lavar con agua destilada Deshidratar y montar

Protocolo Autoteidor (programa 4)

Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 EXIT Estacin 16 1 4 W5 15 (cub 20) W4 12 W1 11 W2 10 W3 5 3 2 17 18 Reagente XILENO ETANOL 100% ETANOL 80% AGUA ACIDO PERIODICO 1% AGUA REACTIVO DE SCHIFF AGUA HEMATOXILINA AGUA ORANGE G AGUA ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% XILENO XILENO XILENO Tiempo (min:seg) 10:00 4:00 3:00 2:00 10:00 10:00 10:00 10:00 2:00 5:00 3:00 5:00 1:00 2:00 2:00 5:00 3:00 Exacto NO NO NO NO SI NO SI NO SI NO SI NO NO NO NO NO NO

Universidade de Vigo
Curso doutoramento do bienio 2003-2005
Fran Saborido, Instituto de Investigaciones Marinas, Vigo,