PRACTICA II

TINCIONES EN CELULAS
Objetivos:
Adquirir la destreza en el uso del microscopio ptico Aprender las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms utilizadas en el estudio microscpico Identificar las principales formas bacterianas.

Introduccin:
En el uso del microscopio ptico para observar clulas, las tcnicas de tincin de clulas son fundamentales, puesto que pueden ser usadas para definir y examinarlas, pues destacan estructuras y nos permite observar las a detalle y de una manera ms clara con el uso del microscopio, una herramienta esencial.

Justificacin:
Para poder llevar a cabo la identificacin de las estructuras de las clulas vegetales y animales, se necesitan aplicar ciertas tcnicas como las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y tincin que utilizadas con el microscopio permite lograr una buena observacin de ciertas caractersticas de dichas clulas.

Marco terico:
TINCIN La tincin o coloracin es una tcnica auxiliar en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.

Las tinciones y colorantes se usan con frecuencia en biologa y en medicina para destacar estructuras en tejidos biolgicos para observacin, a menudo con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Se coloca alguna sustancia de coloracin para crear contraste entre los diferentes orgnulos celulares de esa forma se pueden diferenciar unos de otros. Las tinciones pueden ser usadas para definir y examinar tejidos, poblaciones celulares (clasificando diferentes clulas sanguneas, por ejemplo) u orgnulos dentro de clulas individuales. Ejemplos de tinciones: * La tincin ms comn es la tincin de Gram que es el que se emplea para diferenciar una gran cantidad de bacterias. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. * Tincin de wright que sirve para diferenciar las clulas blancas en las sangre (todos los tipos de leucocitos) * La tincin de Zhiel Niensen para bacilos acido alcohol resistentes que una prueba que se usa para la deteccin del Micobacteryum Tuberculosis causante de la tuberculosis. *La tincin de auramina- rodamina.

MTODOS DE FIJACIN:

La fijacin de los especmenes citolgicos depositados en una laminilla es vital para evitar cambios en la morfologa celular que indiscutiblemente van a alterar e incluso nulificar la interpretacin de los hallazgos microscpicos. Actualmente se utilizan dos mtodos de

fijacin basados en el estatus de hidratacin de la clula al momento de la fijacin. Cada uno conlleva ventajas y desventajas sobre el otro; sin embargo, no se contraponen, ms an son complementarios. Aunque dependiendo la formacin del citopatlogo, este preferir alguno de los dos, ya que las tinciones y la interpretacin de los hallazgos microscpicos son un tanto diferentes entre uno y otro. Fijacin de las bacterias al portaobjetos: *Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases. *Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tincin. FROTIS Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber.

ACEITE DE INMERSIN: Sirve para posibilitar la observacin de diferentes muestras

en objetivo 100x.El aceite de inmersin ofrecer un ndice de refraccin similar al del vidrio, elimina el efecto reflector del vidrio exterior del objetivo. Eso permite lograr mayores aumentos con menor distorsin esfrica, menor aberracin cromtica y mayor luminosidad o "abertura de pupila"

Material empleado por equipo:

Microscopio ptico Cristal violeta 4 portaobjetos 1 mecheros asa microbiolgica Pizeta Aceite de inmersin Clulas epiteliales Clulas de tomate, cebolla y papa Cotonetes

Desarrollo de la prctica. 1.-Toma de muestra (clulas epiteliales de la mejilla):

Frotar con un cotonete el interior de la mejilla de alguno de los miembros del equipo. Colocar el cotonete en el tubo de ensaye con agua destilada

 Agitar la muestra.

2.- Clulas de tomate y cebolla: Separar la epidermis de cebolla y de tomate Colocar en el portaobjeto Teir Seguir el procedimiento similar al del frotis Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos: o Extenderla suavemente en un rea circular de 2 cm de dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire.

3.- Tincin simple Aadir unas gotas de cristal a las preparaciones y esperar 30 segundos. Lavar el exceso de colorante con la pizeta. Dejar secar la preparacin al aire.

4.- Clulas de tomate, papa y cebolla Clulas de cebolla (Allium sp): Tome con cuidado varias hojas de cebolla y, retire la delgada capa (epidermis) que est adherida a ellas. Depostelas en una placa portaobjetos, evitando que se enrollen y agregue una gota de azul de metileno.

Finalmente coloque el cubreobjetos y realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. Clulas de papa (Solanum tuberosum): Realice varios cortes (finos) de escasos micrmetros con la ayuda del bistur o navaja de un solo filo, esos cortes depostelos en una caja petri con agua y agrgueles azul de metileno. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. Clulas de tomate (Lycopersicum esculentum): Retire un trozo pequeo de pulpa de tomate con la ayuda de un bistur o cuchilla de afeitar, depostelo en el portaobjeto y cbralo con el cubreobjetos. Haga las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.

5.- Observacin al microscopio o Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X o Posteriormente pasar al de 40X. gota de aceite de inmersin sobre la preparacin o Para la observacin con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequea

Preguntas a responder:
1. Investiga cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. Da ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
El cristal violeta es una tincin de Gram, este colorante tiene molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos, se emplea para

diferenciar una gran cantidad de bacterias. Otros ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno y la safranina.

2. Qu es el aceite de inmersin? Por qu se utiliza?

Sirve para posibilitar la observacin de diferentes muestras en objetivo 100x.El aceite de inmersin ofrecer un ndice de refraccin similar al del vidrio, elimina el efecto reflector del vidrio exterior del objetivo. Eso permite lograr mayores aumentos con menor distorsin esfrica, menor aberracin cromtica y mayor luminosidad o "abertura de pupila"

3. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?

La tincin simple es bsicamente para diferenciar morfologa y organizacin celular y a diferencia de la tincin compuesta, no se podran dar diagnsticos avanzados, puesto que no permite diferenciar bacterias, formaciones de tejidos como colgeno, fibras, etc.

4. Al identificar las diferentes partes de las clulas animales y vegetales observadas, notamos algunas diferencias. Explique.
Si, en el microscopio principalmente se distingue que la clula vegetal tiene una pared celular y la animal no. el microscopio como: Existen varias caractersticas que las distinguen pero son muy difciles de ver incluso en

*La presencia de cloroplastos en las clulas vegetales *Las clulas animales tienen vacuolas y centriolos ms pequeos y numerosos. *Las clulas animales poseen centrosomas.

5. Qu funcin desempean los plastidios en los vegetales? Qu tipo de plastidios se conocen? Es posible identificar plastidios en clulas animales? Explique.

Los plastidios estn relacionados con procesos metablicos primordiales, pues son capaces de sintetizar y almacenar sustancias... Hay diversos tipos de plastidios, pero todos tienen en comn la existencia de una doble membrana. Pueden clasificarse segn su aspecto y funcin en: 1.- Indiferenciados; que pueden ser: *Proplastos: se cree que son el origen de todos los dems. * Etioplastos: provienen de proplastos que, en vez de diferenciarse en presencia de luz para dar cloroplastos, se diferencian en la oscuridad y dan etioplastos. 2.- Diferenciados; que se clasifican en: * Cloroplastos: son cromatforos y fotosintticamente activos. * Cromoplastos: son cromatforos y fotosintticamente inactivos. * Leucoplastos: son incoloros y fotosintticamente inactivos; estn especializados en el almacenaje de sustancias y existen varios subtipos, segn cual sea la sustancia almacenada: + Amiloplasto (almidn) + Oleoplastos (aceites) + Proteinoplastos (protenas) Los plastidios son orgnulos exclusivos de clulas vegetales

6. Se sabe que las grasas o triglicridos son las sustancias ms abundantes en la naturaleza. En qu rganos de las plantas y animales las podemos encontrar? Qu papel desempean y en qu proporcin estn en nuestro organismo?

Los triglicridos son el principal tipo de grasa transportado por el organismo para dar energa o para ser almacenados como grasa. Se encuentran principalmente en la membrana plasmtica, en la bicapa lipdica. Los lpidos forman, normalmente, el 50% de la masa seca de cualquier clula y, por extensin, de cualquier ser vivo. Los lpidos son un componente estructural clave en los seres vivos.

7. El almidn no es una sustancia simple, y est compuesta por cuales protenas.

ste es un polisacrido de reserva de los vegetales; est formado por miles de molculas de glucosa y se encuentra en semillas y tubrculos. Est integrado por dos tipos de polmeros: Amilosa (almidn no ramificado) y Amilopectina (almidn ramificado) Estructura: el almidn est formado por unas cadenas con ramificaciones formadas nicamente por glucosa unida una detrs de otra. Las protena estn formadas por aminocidos (hay 21) en diferentes combinaciones, las combinaciones son las que dan las diferentes propiedades de las protenas. Sntesis: las protenas son sintetizadas por ribosomas y el almidn por el almidn sintasa y el enzima ramificante. Distribucin: el almidn es bsicamente vegetal y las protenas en todos los seres vivos (incluso en virus) Funcin: las protenas tienen mltiples funciones (enzimas, estructurales, almacenamiento...) el almidn es solo un almacn de glucosas.

8. Mencione las principales caractersticas que presenta el epitelio de cavidad bucal.

En la cavidad oral se pueden distinguir varias zonas anatmicas, se describe un vestbulo exterior, que limita hacia atrs con los bordes alveolares que tienen las piezas dentarias, y

una cavidad oral separada del vestbulo por tales bordes y por las encas. Tendr como limites por superior al paladar blando, por inferior al piso de la boca que tiene la lengua, y por posterior a las amgdalas palatinas. Las distintas mucosas de la boca tienen funciones secretoras, sensoriales y de proteccin, y algunas de ellas se encuentran asociadas a glndulas salivales menores

9. Describa los principales tipos de tejido epitelial, sus propiedades, funcin y ubicacin en el cuerpo.
En si el tejido epitelial o epitelio son capas delgadas de clulas a manera de membranas que recubren superficies y sirven tanto para revestir como para absorcin de nutrientes (en el intestino delgado), como medios de secrecin (glndulas varias), difusin de gases (en los pulmones) o con funciones sensoriales (el neuroepitelio que est ligado al sistema nervioso). Puede ser interno (endotelio que abunda en todos los tubos del cuerpo) o como intermedio (mesotelio). Las superficies pueden ser hmedas (requisito indispensable por ejemplo en el epitelio pulmonar para que se d la difusin de gases a la sangre) o secas (la piel). La lmina basal es la base sobre la que descansa cualquier tipo de epitelio y sobre esta lmina estn las clulas que pueden ser: *simples (de una clula de grosor) *estratificadas (2 o ms clulas de grosor) o *pseudo estratificadas (clulas a diferente altura que da la apariencia de estar en estratos pero no hay lneas que lo definan). Las simples y estratificadas a su vez se dividen por forma en: planas (con forma de rombo aplanado..., como un mosaico), cbicas y cilndricas. En las estratificadas hay adems Epitelio de Transicin que es una mezcla de los 3. El EPITELIO SIMPLE PLANO abunda en: alveolos pulmonares (la superficie debe ser muy delgada y hmeda para que el gas pueda pasar fcilmente), sistema urinario. El EPITELIO SIMPLE CUBICO se encuentra formando muchas glndulas por ejemplo la de

la Tiroides, cubren el ovario y forman los tbulos renales en el sistema urinario. El EPITELIO SIMPLE CILNDRICO est en el sistema reproductor (en los oviductos, conductos eferentes de los testculos y tero), en el sistema respiratorio (en los bronquios), gran parte del tubo digestivo, en la vescula biliar y tubos grandes de algunas glndulas. El EPITELIO ESTRATIFICADO PLANO se divide en queratinizado (Con queratina) y no queratinizado (sin queratina). El Epitelio Queratinizado est por ejemplo en la piel, es estratificado porque por desgaste natural o friccin pues las clulas mueren y se caen y obviamente pues necesitan las de reemplazo. Las superficies queratinizadas suelen ser secas. El Epitelio No Queratinizado se localiza en la boca, epiglotis, esfago, recto y vagina (igual como son reas propensas a friccin por eso tienen epitelio estratificado para reemplazar al que se cae). Las superficies No queratinizadas suelen ser hmedas. El EPITELIO ESTRATIFICADO CUBICO se encuentra recubriendo glndulas sudorparas. El EPITELIO ESTRATIFICADO CILNDRICO se encuentra en la conjuntiva del ojo, conductos excretores grandes y algunas porciones de la uretra masculina. El EPITELIO DE TRANSICIN se puede localizar en la uretra y urter del pene y en la vejiga. Finalmente del EPITELIO PSEUDO ESTRATIFICADO es importante decir que siempre esta ciliado es decir que tiene micro vellosidades y las clulas superficiales tienen forma cilndrica. Las ms obvias de este tipo son las vellosidades del intestino delgado y que sirven para la absorcin de nutrientes pero tambin se pueden encontrar en la trquea, bronquios primarios, epiddimo y conductos deferentes, trompa auditiva y parte de la cavidad timpnica, cavidad nasal, sacos lacrimales y la uretra masculina.

10. planta?

Qu papel cumplen las clulas oclusoras del estoma en la

Son las clulas de los estomas (rganos de respiracin de las plantas ubicados generalmente en la cara de abajo de la hojas), las mismas hacen que los estomas se cierren o se abran segn la turgencia de las clulas (si necesitan transpirar o no.)

11.

El tejido epitelial de la boca es de qu tipo de tejido?

La mucosa oral tiene un epitelio plano estratificado en general, pero hay tres variantes: ortoqueratinizado (con un notable estrato crneo), paraqueratinizado (con un escaso estrato crneo, y en el que se conservan algunos ncleos celulares), y un epitelio no queratinizado derechamente.

Resultados:

Conclusiones:
Pude concluir que las clulas animales y vegetales son muy complejas, pues aunque sean pequeas a su vez tienen componentes. Reafirme el conocimiento del microscopio y su importancia adems de que incorpore diversas tcnicas las cuales permitieron observar de una manera ms precisa las clulas del tomate, cebolla, papa y la clula epitelial.

Discusin:
En nuestra prctica se observaron las clulas de manera ms clara gracias a las tcnicas que aplicamos. La tincin mejor el contraste en la imagen vista en el microscopio, puesto que sin esta tcnica no se podran observar las clulas tal cual lo pudimos hacer. Adems aplicamos la tcnica de frotis y la fijacin en nuestra muestra epitelial pues es importante para evitar cambios en la morfologa. Esta vez a comparacin de nuestra prctica anterior utilizamos el objetivo 100x, y por lo tanto usamos el aceite de inmersin, que posibilita la observacin en este objetivo. Esto nos permiti lograr mayor aumento al observar nuestras clulas, y as distinguir algunas de sus diferencias, la ms notoria la pared celular que poseen las clulas vegetales al contrario de la animal.

Bibliografa empleada
*Mendoza, Biologa I y II, Trillas (www.mendoza-sierra.org) *Gartner L.P. y J. L. Hiatt. 2001. TEXTO ATLAS DE HISTOLOGIA. 2 Edicin. Mc Graw Hill Interamericana. Mxico. 539 pp. *www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones