Universidad Católica de la Santísima

Concepción
Facultad de Medicina / Escuela de
Medicina
Bioquímica

PRACTICO Nº06
Glucogenólisis
en cortes de
Hígado
Integrantes / Pilar L. Navarrete Briones
Yael R. Oñate Antilao
María J. Pérez Fernández
Carlos Pino Contreras
Carrera / Medicina
Sección / Nº2
Docentes / Dr. Reginaldo Del Pozo, Ph. D.
BQ. Javier Grandon
BQ. Mirna Muñoz, M. Sc.
QA. German Rotter
Fecha / Jueves 7 de Junio de 2007
Introducción//

El glucógeno es un polisacárido muy importante, es la forma principal de reserva

de carbohidratos en los animales, ya que permite almacenar glucosa, para ser utilizada
en periodos de déficit: “hipoglicemia”, la cual puede deberse al ayuno o al ejercicio
intenso. Es abundante en el hígado y en el músculo, sin embargo debido a su masa
mayor, el músculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucógeno que tiene el
hígado como reserva. Al compararlo con el almidón, el glucógeno es más ramificado y
compacto. La función e importancia del glucógeno muscular es actuar como una
fuente de fácil disponibilidad de unidades de hexosa para la glucólisis dentro del propio
músculo. El glucógeno hepático sirve en gran parte para exportar unidades de hexosa
para la conservación de la glucosa sanguínea, en particular entre comidas.
Los animales son capaces de realizar tanto la degradación como la síntesis de
glucógeno según las necesidades del organismo. La síntesis de glucógeno denominada la
glucogenogénesis, se produce en la mayoría de los tejidos, pero principalmente en el músculo
esquelético y en el hígado. Su degradación, para exportar glucosa al resto del cuerpo, la
glucogenólisis, se produce cuando las necesidades energéticas de los tejidos demandan
glucosa para obtener ATP por la vía glucolítica y contribuyendo así a la mantención de la
glicemia. La velocidad de la degradación o síntesis de glucógeno define la concentración de
una u otra molécula en un momento dado, ya que ambos fenómenos ocurren de manera casi
simultanea en el hepatocito. A su vez, la velocidad de estos fenómenos está definida por la
concentración de glucosa en la sangre y la actividad de diversas glándulas endocrinas
(páncreas, suprarrenales, hipófisis).
En las células hepáticas, el glucógeno aparece en forma de grandes gránulos,
constituidos por agrupaciones de simples moléculas, muy ramificadas, por lo que tiene
un peso molecular muy elevado; por lo que para observar estos fenómenos podemos
simular las condiciones en las cuales se producen, o sea si introducimos un trozo de
hígado a una solución similar al plasma, como lo es la solución de Krebs, simulamos las
condición fisiológica de hipoglicemia. El tejido hepático responderá degradando
glucógeno a glucosa mediante la glucogenólisis, estas reacciones involucran la
participación de enzimas, que pueden actuar como reguladoras del proceso, como en
todas las vías metabólicas, ya que no se han modificado sus condiciones.
Los métodos espectrofométricos nos serán útiles una vez más para determinar
las concentraciones hepáticas tanto de glucógeno como de glucosa.

Objetivos //

Estudio del proceso de Glucogenolisis y aparición de glucosa en cortes de hígado de rata,

incubados en un medio salino apropiado.
Determinar cuantitativamente concentraciones de glucógeno y glucosa hepáticas en el
hígado de rata
Visualizar la relación entre la degradación de glucógeno y la producción y liberación de
glucosa.
Materiales//

Hígado de ratón Vidrio reloj Balanza

Gradilla Espectrofotómetro Cubetas

Puntas para micropipetas Papel Filtro Embudo

Bagueta Baño Termorregulado Cronómetro

Pipeta de vidrio (2ml) Propipeta Vortex

Mortero de cerámica y Micropipetas (5-50 µl y Tubos de ensayo

martillo 200-1000 µl)

Reactivos
 • Solución de Krebs

• Acido Tricloroacético 5% (TCA)

• Reactivo de Lugol

• Kit para determinación enzimática de glucosa (GOD- PAP)

Método//

El método a seguir en esta experiencia fue la incubación de trozos de hígado

(provenientes de ratas bien alimentadas) a 37ºC en Solución de Krebs durante tiempos
predeterminados, luego de los cuales se medirá el contenido de Glucosa liberada al medio
extracelular y la cantidad de Glucógeno presente en el tejido analizado. Esto para poder
evidenciar que el fenómeno de Glucogenolisis está siendo llevado a cabo por las células
hepáticas de nuestras muestras de tejido y que presenta además una evolución en el tiempo.

La metodología empleada fue la siguiente:

1. Obtención de la muestra de tejido hepático de ratón.

Se sacrificó una rata sana, bien alimentada y que no ha pasado periodos de

stress recientemente. Luego de extraerle el hígado a la rata, se cortó el tejido en láminas
relativamente delgadas.

2. Preparación de los tubos a incubar

Se pesaron tres trozos de hígado de peso similar (250 mg), los cuales se depositaron en tres
tubos de ensayo distintos (rotulados como 0’ – 10’ – 30’). Luego se agregaron 2ml de solución
de Krebs a cada tubo.

3. Incubación
Los tubos fueron incubados a 37ºC en un
baño Termorregulado, durante 0, 10 y 30
minutos respectivamente.

5. Determinación de la concentración de Glucógeno

Se toman las tres muestras de tejido separadas del sobrenadante y a cada una
se le agregan 5 ml de solución TCA (cabe destacar que el tubo 0’ no fue incubado, ya
que es nuestro tiempo cero por lo que de inmediato se le agrego tal solución), para
detener las reacciones enzimáticas de la glucogenolisis y extraer el glucógeno. Como
siempre, la mezcla se agita en el vortex. Posteriormente se vació la mezcla sobre un
mortero y se trituró el tejido hasta homogenizarlo. Finalmente luego de ser filtrada, la
mezcla obtenida correspondiente se emplea para preparar los tubos que serán
empleados en la determinación del contenido de glucógeno. Esto se realiza mediante la
reacción entre el glucógeno y el reactivo de Lugol, de la que se obtiene una coloración
caoba, medible por espectrofotómetro.
 Tabla resumen de tubos para determinación de Glucógeno
Tubos 0’ 10’ 30’ Estandar (x2) Blanco
Filtrado (ml) 0.5 0.5 0.5 ----- -----
TCA 5% (ml) 1.5 1.5 1.5 1.0 2.0
Glucógeno (ml) ----- ----- ----- 1.0 -----
Reactivo de Yodo (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

Una vez preparadas y agitadas las soluciones, se dejan

reposar por cinco minutos y luego se leen al espectrofotómetro
a 540nm de longitud de onda.

6. Determinación enzimática de Glucosa liberada desde el tejido hepático

Con el sobrenadante obtenido anteriormente de cada tubo, se preparan las
soluciones con el reactivo enzimático, para obtener un complejo coloreado, el cual de
acuerdo a la intensidad del color obtenido, revelara la concentración de Glucosa en la
solución.
Tubos 0’ 10’ 30’ Estandar (x2) Blanco
Sobrenadante (µl) 100 100 100 ----- -----
Estándar 20 mg% (µl) ----- ----- ----- 100 -----
Reactivo Enzimático 1 1 1 1 1
(ml)
Agua destilada (µl) ----- ----- ----- ----- 100

Luego de preparar las soluciones, los tubos deben incubarse por 10 minutos a 37ºC en
el baño Termorregulado.
Transcurridos los 10 minutos, las muestras se leen al espectrofotómetro a 500nm.

Resultados//
Obtención de Glucosa
Obtención de Glucosa
0,35
mg/ml de glucosa Absorbancia 0,3
Blanco 0 0 0,25
0’ 0.06 0.162
mg/ml

0,2
10’ 0.26 0.714 0,15
30’ 0.32 0.863 0,1
0,05
0
0 10 20 30 40
tiempo (min)
Std1 0.2 0.549
Std2 0.2 0.547

Obtención de Glucógeno
mg/ml de glucógeno Absorbancia Obtención de Glucógeno
Blanco 0 0 1,2
0’ 0.97 1.420 1
10’ 0.93 1.361 0,8

mg/ml
30’ 0.72 1.050 0,6
Std1 0.25 0.369 0,4
Std2 0.25 0.365 0,2
0
0 10 20 30 40
tiempo (min)

Discusión//

Respecto de los procedimientos y reactivos:

Puntos críticos del procedimiento:

Uso del Vórtex:

>> Vorterear vigorosamente en todos los pasos de este experimento tiene
como objetivo romper la microestructura del hepatocito, exponiendo su
contenido citoplasmático, para así poder medir las concentraciones de
glucosa y glucógeno.

>>El TCA es utilizado para detener la reacción enzimática. Su efecto especifico es e lataque a
las enzimas promotoras de la reacción “glucogenolisis”, denaturandolas y variando el medio al
cual ellas trabajan de manera optima, a esto se suma el hecho de que la reacción sea detenida
en el tiempo exacto obteniendo solo así es posible obtenre datos fidedignos para cumplir los
objetivos planteados.

>> Uso del mortero, el objetivo de esta operación es básicamente: liberar el contenido de
glucosa al medio, para ser cuantificada (sacrifico de los hepatocitos).

>> Nuevamente los métodos espectrofotométricos son el instrumento indispensable que nos
permite inferir a través de la medida de la absorbancia la concentración de los analitos de este
práctico Glucosa y Glucógeno.

Reactivos:
>>La solución de Krebs-Henseleit: tiene una composición similar a la del plasma, la
osmolaridad, la composición iónica y el valor de pH muy similar, la idea es mantener a los
hepatocitos en un medio idóneo para que se siga produciendo los fenómenos de glucogenolisis,
una especie de "microengaño celular”.

>>La incubación a 37º se suma al objetivo planteado anteriormente.

>>Detalle de la composición de la solución en milimoles por litro:

NaCl 118.3, KH2PO4 1.2, 316 mOsm.

KCl 4.8, CaCl2 2.5, pH 7.4
MgSO4 1.2, NaHCO3 25.0, Glucosa 11.0
Este (valor glucosa) corresponde al valor estándar de la solución de krebs, el que se modificó
en el practico, para así lograr artificialmente una situación de hipoglicemia. “Recordemos que
la hipoglicemia es uno de factores que puede promover la glucogenólisis en el hepatocito”.

>>Los resultados de la absorbancia nos entregaron que a medida que el tiempo transcurría, la
concentración de glucosa iba aumentando, (se visualiza en grafico Glucosa v/s Tiempo),
producto de la degradación del glucógeno, por lo cual podemos concluir que el glucógeno es la
fuente inmediata de glucosa sanguínea. La degradación de glucógeno se encuentra a cargo de
la enzima glucógeno fosforilasa, que al igual que la glucógeno sintasa se encuentra regulada
por medio de fosforilación-desfosforilación.

Dato interesante Ratas con stress:

>>El organismo responde a los periodos de stress liberando diversas Sustancias

(hormonas por ejemplo) que permitan la adaptación orgánica a estos periodos de alta demanda
energética, este es el caso de la ADRENALINA secretada por la médula suprarrenal ante el
stress. La adrenalina promueve el paso de glucógeno hepático a glucosa, para dar abasto a la
demanda del momento, si nuestros ratones hubiesen estado estresados (por miedo), la
adrenalina se habría encargado de movilizar las reservas de glucógeno hepáticas y nuestro
experimento habría sido un fracaso…por falta de reactivos.

Factores que promueven al glucogenólisis en el hepatocitoTABLA RESUMEN:

Hormona pancreática Glucagón
Hipoglicemia

Determinación de glucosa:

Método GOD-PAD:

Determinación de Glucógeno Hepático:

El glucógeno es detectado al reaccionar positivamente con el yodo, el cual en nuestro
experimento se encuentra en el reactivo de lugol, esta reacción nos entregará un color caoba.
Es precisamente esta propiedad colorimétrica la que nos permite reconocer el glucógeno a
traves del método espectrofotométrico

>>Alteraciones en el balance glucogenólisis y gluconeogénesis con importancia clínica:

Las "enfermedades por almacenamiento de glucógeno" son un grupo de trastornos
hereditarios que se caracterizan por movilización deficiente del glucógeno y depósito de
formas anormales del mismo, conduciendo a debilidad muscular e inclusive muerte.

Conclusión //

 En parámetros fisiológicos normales, el hígado es el encargado de mantener los niveles de

glucosa en la sangre de acuerdo a los requerimientos de las células. Este proceso es
regulado por la actividad de varias hormonas, entre ellas la insulina y el glucagón. Al simular
un ambiente hipoglicémico e introducir un trozo de hígado en él, los hepatocitos responden a
la falta de glucosa en el medio realizando la glucogenólisis, para aumentar los niveles de
glucosa y así suplir la necesidad de energía del medio. De acuerdo a esto, en el experimento
los niveles de glucosa irán en aumento y los niveles de glucógeno van en descenso, ya que
este se degrada para producir glucosa, como lo indican nuestros gráficos.

 La relación glucógeno y glucosa es inversa a medida que disminuye el polímero glucógeno

(formado por unidades de D-glucosa) aumenta la concentración de glucosa libre, los valores
que obtuvimos se grafican en las curvas de concentración.

 Al momento de analizar nuestros gráficos, se presentó la cuestión de que si bien los gráficos
reflejan una relación inversa esta no se ajusta a ningún comportamiento matemático
específico (relación lineal, exponencial etc...)
Respecto de las razones que ideamos para justificar este comportamiento:
La relación de GlucógenoGlucosa no es de 1: 1, se debe recordar que el Glucógeno es un
polímero.

Al momento de triturar en el mortero, tal vez no se logro el objetivo de exponer todo el
contenido citoplasmático de los hepatocitos, aunque intentáramos hacerlo bien; dado que la
reacción que permite el paso de glucógeno a glucosa ocurre en el citosol, si este no es
correctamente expuesto la combinación con los reactivos (colorantes, ácidos que detiene la
reacción, etc...) No se logra adecuadamente.

Ineficiencias del grupo a la hora de la manipulación de los reactivos.

La hipoglicemia es uno de los factores que promueven la glucogenólisis en los hepatocitos, la
presencia de la hormona pancreática glucagón o de otros factores estimulantes probablemente
habría arrojado resultados más notorios en el tiempo.

-Sabemos que el valor de glucosa sanguínea tiene un papel fisiológico preponderante, pues
representa el recurso energético principal para poner en marcha todas las maquinarias
metabólicas celulares, este experimento nos reafirma su importancia, donde es notable la
velocidad con que las células hepáticas responden a las variaciones de glicemia, poniendo en
marcha todo un complejo mecanismo de compensación dirigido a movilizar las reservas (ya
existentes) de glucosa ………

 - Demostramos la importancia vital que posee el hígado en el metabolismo de la glucosa.

 La concentración de glucosa obtenida del sobrenadante, va en aumento, debido
a que el hígado libera glucosa al medio (Solución de Krebs), por medio de la
glucogenolisis, para intentar compensar la deficiencia
de glucosa en este. La liberación de glucosa al medio, el los
primeros instantes, es muy rápida con una relación
prácticamente lineal, como se aprecia en el gráfico Nº 1. La
eliminación del extremo no reductor del glucógeno realizado
por la glucógeno fosforilaza, es más rápida si el glucógeno se
encuentra en un mayor grado de ramificación. Se puede
concluir que de acuerdo al gráfico donde se observe una
relación lineal o hiperbólica el glucógeno se encontraba
más ramificado.

Bibliografía//

GUÍA
DE

TRABAJOS PRÁCTICOS, Carrera

de Medicina 2007 Universidad
Católica de la Santísima
Concepción. Dr. Reginaldo del
Pozo, Ph.D.; BQ Javier Grandón,
BQ Mirna Muñoz, M.Sc.; QA
German Rotter.
 hola
......ALis...........en Conce says:
tai ahi?

......ALis...........en Conce just sent you a nudge.

Pilar...With or without you....I can't live---- says:

sipes.. k linda foto
......ALis...........en Conce says:
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/liver/histo_lobule.htm
l
......ALis...........en Conce says:

......ALis...........en Conce says:

ahi hay una pagina en ingles
......ALis...........en Conce says:
sobre el higado
......ALis...........en Conce says:
pero sigo uscando
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
sabes busca como tridimensional puede.. aperecer un amketa lista
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
sipes di la vi.. pero = son cortes...
......ALis...........en Conce says:
sipo
......ALis...........en Conce says:
hoy voi a trtar de averiguar
......ALis...........en Conce says:
kien hizo el lobulillo el año pasao
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
nose....
......ALis...........en Conce says:
http://www.siumed.edu/~dking2/erg/liver.htm
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day sends:
Cancel ed

ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:

esa esta wena
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:
o por lo menos
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:
como en relieve
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
si .. la estoy mirando hay artpos cortes.. guardalas.. yo = las voy a ver beem en mi casa...
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
para sacar ideas...
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
= me voy a llevar el geneser. por sale tridimensional
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:

Pilar...With or without you....I can't live---- says:

ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day sends:

Open(Alt+P)
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
parece k = a la del libro...

You have successfully received C:\Documents and Settings\Alumnos\Mis documentos\Mis

archivos recibidos\maqueta 2.jpg from ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day.

Pilar...With or without you....I can't live---- says:

esta bueno.. super..
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:

Pilar...With or without you....I can't live---- says:

yop despues d elas 14:00 me pongo a buscar es k toy haciendo con yael el info de
biokimicA
Pilar...With or without you....I can't live---- says:
YA..
ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good day says:
ok

You have failed to receive file "lobulillo sano vs enfermo.jpg" from ღღ*-*ALis*-* ღღ.....a good
day.