EXPRESSION OF HETEROLOGOUS

GENE CLUSTERS:
ACTIVATION BY
PROMOTER-GENERATING
MUTATIONS

Prof.
Prof. Renato Fani
APPROCCIO DI TIPO SPERIMENTALE

Esperimenti di
EVOLUZIONE GUIDATA Studio in vivo
di acquisizione
di nuove abilità
metaboliche

Popolazione microbica sottoposta

a pressione selettiva

Prof.
Prof. Renato Fani
 Selective pressure: request of functions X and Y

?
x x

y x

y x
y

y
x
y
y
x

Prof.
Prof. Renato Fani
 Selective pressure: request of functions X and Y

x
xy xy
x
y x
xy
x

y xy xy
y xy
xy
x y y
x
xy
Modification of pre-existing xy
genetic information
activation of cryptic or silent genes
selection of mutations in regulatory or structural genes
Surviving of XY cells
Prof.
Prof. Renato Fani
 Selective pressure: request of functions X and Y

x
xy xy
x
x
y
xy
x

y x xy
y
xy
xy
x
y
x y xy
x xy

Horizontal gene transfer

Surviving of XY cells
(XENOLOGY) Prof.
Prof. Renato Fani
 For
For horizontal
horizontal transfer
transfer toto be
be
successful
successful, , donated
donated genes
genes must
must
persist
persist inin the
the recipient
recipient organism
organism
This persistence
This persistence isis dependent
dependent on
on
the expression
the expression of
of transferred
transferred genes
genes

On the
On the other
other hand,
hand, the
the finding
finding that
that HGT
HGT isis pervasive
pervasive
among microial
among microial lineages
lineages indicates
indicates that
that these
these barriers
barriers
may somehow
may somehow be be overcome
overcome

In
In principle , the
principle, the gene
gene flow
flow
might
might be be limited
limited by
by the
the barriers
barriers
to
to heterologus
heterologus gene
gene expression
expression The introgression
The introgression of of foreign
foreign
genes into
genes into aa heterologous
heterologous recipient
recipient
does not
does not per
per se
se imply
imply
their expression
their expression inin the
the host
host cell.
cell.
Prof.
Prof. Renato Fani
 ?
Thus, how can a heterologous gene (cluster)
be expressed in a host cell whose RNA polymerase
is not able to (efficiently) recognize
the transcriptional signal of the introgressed gene(s)?

Can this
Can this issue
issue be
be analyzed
analyzed under
under laboratory
laboratory conditions
conditions ??

Prof.
Prof. Renato Fani
 ………by transferring
………by transferring genes
genes forfor aa
given metabolic
given metabolic route
route from
from aa donor
donor
organism into
organism into aa heterologous
heterologous recipient
recipient lacking
lacking that
that metabolic
metabolic
ability, and
ability, and whose
whose transcriptional
transcriptional apparatus
apparatus does
does not
not
recognize the
recognize the regulatory
regulatory signal
signal of
of the
the donor
donor DNA.
DNA.

This idea
This idea relies
relies on
on the
the so-called
so-called "directed
"directed evolution"
evolution" experiments
experiments
that demonstrated
that demonstrated the the occurrence
occurrence ofof regulatory
regulatory mutations
mutations in
in
bacterial populations
bacterial populations incubated
incubated under
under selective
selective conditions
conditions and
and
allowing the
allowing the appearance
appearance ofof cells
cells able
able
to thrive
to thrive in
in alternative
alternative environments.
environments.

Prof.
Prof. Renato Fani
 FENOTIPO
X

-
PLASMIDE X
Cromosoma

TRASFERIMENTO
GENICO
ORIZZONTALE X

-
X
PRESSIONE SELETTIVA PLASMIDE
Cromosoma
(Richiesta della Funzione X)

X
P
+
Plasmide
X
Cromosoma

Prof.
Prof. Renato Fani
 X gene

Selective pressure:
request of function X
Acquisition of a potentially -
functioning X gene by HGT
X phenotype
- +

Bacterial cell

Model for the expression of newly acquired metabolic genes by promoter-creating mutations in a host cell
lacking the function encoded by a gene X and which has an X- phenotype. This cell may acquire (by
xenology or sinology) a heterologous gene X whose regulatory signals are not recognized by the
transcriptional apparatus of the host cell; therefore the cell phenotype is still X-. The appearance of cell
with X+ phenotype is possible if under starvation conditions requiring the function X, mutations falling
upstream of the gene X create a promoter sequence, and render the gene X expressable.
Prof.
Prof. Renato Fani
Overall experimental
strategy

Prof.
Prof. Renato Fani
Escherichia coli G D C B H A F IE

Azospirillum brasilense
Orf Orf
Bd H 168 A F E 122

pRK290 pAF58
Tetr Tetr

EcoRI EcoRI

Orf Orf
Bd H 168 A F E 122

Prof.
Prof. Renato Fani
 His Phenotype

E. coli FB251 hisB-hisA+hisF+

X
hisB recA

hisB+hisA-hisF+
E. coli FB182 X

hisA

hisB+hisA+hisF-
X
E. coli FB184
hisF

Prof.
Prof. Renato Fani
 His Phenotype
BAF
E. coli FB251 hisB-hisA+hisF+
X
hisB recA
pAF58

BAF
hisB+hisA-hisF+
E. coli FB182 X

hisA
pAF58

BAF
hisB+hisA+hisF-
X
E. coli FB184
pAF58
hisF

A. brasilense his biosynthetic genes

Prof.
Prof. Renato Fani
 Working hypothesis

BAF
pAF58

Selective pressure:
request of histidine
Acquisition of A. brasilense his
gene cluster by HGT
His phenotype

P
BAF
pAF5803

E. coli His- mutant

E. coli His+ revertant
 His Phenotype

+
E. coli FB251 hisB-hisA+hisF+
P
X
hisB recA BAF
pAF5803

+
hisB+hisA-hisF+ P
E. coli FB182 X
BAF
hisA pAF5803

+
hisB+hisA+hisF- P
X BAF
E. coli FB184 pAF5803
hisF

A. brasilense his biosynthetic genes

Prof.
Prof. Renato Fani
RESULTS

Prof.
Prof. Renato Fani
 Transformation
Transformation of
of
hisB
hisB E.coli
E.coli with
with plasmid
plasmid pAF58
pAF58

BAF
hisB-hisA+hisF+
E. coli FB251 X
hisB recA
pAF58

Ability of
Ability of plasmid
plasmid pAF58
pAF58 to
to complement
complement the hisB mutation
the hisB mutation
(crescita in
(crescita in ASSENZA
ASSENZA di
di istidina)
istidina)

Prof.
Prof. Renato Fani
 Ability of
Ability of plasmid
plasmid pAF58
pAF58 to
to complement
complement the hisB mutation
the hisB mutation
(crescita in
(crescita in ASSENZA
ASSENZA di
di istidina)
istidina)

TUTTI i i trasformanti
TUTTI trasformanti crescono
crescono TUTTI i i trasformanti
TUTTI trasformanti NON
NON crescono
crescono
inin ASSENZA
ASSENZA didi istidina
istidina inin ASSENZA
ASSENZA didi istidina
istidina

IlIl PROMOTORE
PROMOTORE dell’operone
dell’operone hishis didi his didi
A. brasilense
brasilense èè riconosciuto
riconosciuto dalla
dalla IlIl PROMOTORE
PROMOTORE dell’operone
dell’operone his
A. A. brasilense
A. brasilense NON
NON èè riconosciuto
riconosciuto dalladalla
RNA polimerasi
RNA E. coli
polimerasi didi E. coli RNA polimerasi E. coli
polimerasi didi E. coli
RNA

MA, dopo
MA, dopo alcuni
alcuni
FINE
FINE giorni compaiono
compaiono dei
dei revertanti
revertanti His
His++
giorni
Prof.
Prof. Renato Fani
 MA, dopo
MA, dopo alcuni
alcuni
giorni, compaiono
giorni, compaiono dei
dei revertanti
revertanti His
His++

II revertanti
revertanti sono
sono capaci
capaci di
di
sintetizzare l’istidina
sintetizzare l’istidina
(COMPLEMENTAZIONE)
(COMPLEMENTAZIONE)

RICOMBINAZIONE
RICOMBINAZIONE MUTAZIONE
MUTAZIONE
intermolecolare
intermolecolare

Prof.
Prof. Renato Fani
 MUTAZIONE
MUTAZIONE

CROMOSOMICA
CROMOSOMICA PLASMIDICA
PLASMIDICA
(reversione del
(reversione del gene hisB mutato)
gene hisB mutato)

Aumento del
Aumento del numero
numero Creazione di
Creazione di un
un
di copie
di copie PROMOTORE
PROMOTORE

Prof.
Prof. Renato Fani
TRASFORMAZIONE
Incorporaziome di molecole di DNA
(ricombinanti o non)
da parte di
cellule ospiti “competenti”

Prof.
Prof. Renato Fani
Miscela di cellule competenti del ceppo
FB251 hisB e di
molecole di DNA plasmidico pAF58

Prof.
Prof. Renato Fani
Una frazione delle cellule competenti
incorpora molecole di DNA

Prof.
Prof. Renato Fani
 Quesito
Quesito

Come riconoscere, tra tutte

le cellule (qualche miliardo)
potenzialmente trasformabili, i
cloni positivi,
cioè quelli che hanno incorporato
il plasmide ricombinante pAF58?

Prof.
Prof. Renato Fani
Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidina

Prof.
Prof. Renato Fani
 La
La
moltiplicazione
moltiplicazione
di
di
queste
queste cellule
cellule
porterà
porterà alla
alla
comparsa
comparsa di di
colonie
colonie
resistenti
resistenti alla
alla
tetraciclina
tetraciclina

Prof.
Prof. Renato Fani
Quesito
Quesito

Come
Come verificare
verificare se
se ilil plasmide
plasmide
pAF58
pAF58 èè capace
capace di
di complemetare
complemetare
la mutazione his
la mutazione his del
del ceppo
ceppo
FB251?
FB251?

Prof.
Prof. Renato Fani
 Piastra di terreno selettivo contenente
tetraciclina ma NON ISTIDINA

Replica-plating

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINA MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 Se il promotore dei geni his portati dal
plasmide pAF58 è riconosciuto dalla RNA-
polimerasi di E. coli ...

CRESCITA di TUTTE le COLONIE su

Terreno contenente tetraciclina
terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 Se il promotore dei geni his portati dal
plasmide pAF58 NON è riconosciuto dalla
RNA-polimerasi di E. coli ...

ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 24 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
IL promotore dei geni his portati dal plasmide
pAF58 NON è riconosciuto dalla RNA-
polimerasi di E. coli

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 48 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

CRESCITA di ALCUNE MICRO-COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 72 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

Il NUMERO delle MICRO-COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA AUMENTA

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 96 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

Il NUMERO delle MICRO-COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA continua ad AUMENTARE

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 192 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

Il NUMERO delle MICRO-COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA NON AUMENTA PIU’

Prof.
Prof. Renato Fani
Quesito
Quesito

Che
Che cosa
cosa sono
sono le
le microcolonie
microcolonie??

Risposta
Risposta

Revertanti HisB
Revertanti HisB ++

Prof.
Prof. Renato Fani
 Revertanti HisB
Revertanti HisB ++

Revertanti
Revertanti
CROMOSOMICI
CROMOSOMICI

Mutanti
Mutanti plasmidici
plasmidici

Prof.
Prof. Renato Fani
 Come
Come discernere
discernere tra
tra
le
le due
due possibilità?
possibilità?

““Curing”?
Curing” del
del plasmide
plasmide

?
Prof.
Prof. Renato Fani
 CRESCITA di REVERTANTI HisB+ in
presenza di arancio di acridina

Semina della coltura

Terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINA

Terreno massimo NON

Terreno contenente
contenente tetraciclina
arancio di acridina
E ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 Verificare il Fenotipo delle colonie cresciute

Le cellule potranno essere Tetr o Tets

Scenario 1
Se la mutazione responsabile del fenotipo His+ dei
Terreno massimo NON revertanti è a carico del plasmide:
contenente tetraciclina •Tutte le cellule Tetr devono essere anche His+
•Tutte le cellule Tets devono essere anche His-

Scenario 2
Se la mutazione responsabile del fenotipo His+ dei
revertanti è a carico del cromosoma:
•Tutte le cellule saranno His+ indipendentemente dal
fenotipo Tet
Prof.
Prof. Renato Fani
 Terreno MM -Tet +His

Terreno MM -Tet -His

Terreno massimo NON

contenente tetraciclina

Terreno MM +Tet -His

Terreno MM +Tet +His

Prof.
Prof. Renato Fani
 Come
Come discernere
discernere tra
tra
le
le due
due possibilità?
possibilità?

““Curing”?
Curing” del
del plasmide
plasmide

Estrazione
Estrazione DNA
?
DNA plasmidico
revertanti
plasmidico dai
revertanti HisB
HisB+
+
dai

Prof.
Prof. Renato Fani
ESTRAZIONE del DNA PLASMIDICO

dai REVERTANTI HisB+

pAF5803
(milioni di copie)

Prof.
Prof. Renato Fani
Miscela di cellule competenti del ceppo
FB251 hisB e di
molecole di DNA plasmidico pAF5803

Prof.
Prof. Renato Fani
Una frazione delle cellule competenti
incorpora il plasmide pAF5803

Prof.
Prof. Renato Fani
Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidina

Prof.
Prof. Renato Fani
 La
La
moltiplicazione
moltiplicazione
di
di
queste
queste cellule
cellule
porterà
porterà alla
alla
comparsa
comparsa di di
colonie
colonie
resistenti
resistenti alla
alla
tetraciclina
tetraciclina

Prof.
Prof. Renato Fani
 Se il promotore dei geni his portati dal
plasmide pAF5803 NON è riconosciuto dalla
RNA-polimerasi di E. coli

Revertante cromosomico

ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE

Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 Se il promotore dei geni his portati dal
plasmide pAF5803 è riconosciuto dalla RNA-
polimerasi di E. coli

Mutante plasmidico

CRESCITA di TUTTE le COLONIE su

Terreno contenente tetraciclina
terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Prof.
Prof. Renato Fani
 RISULTATO dell’ESPERIMENTO
(dopo 24 ore di incubazione delle piastre a 37°C)

CRESCITA di TUTTE le COLONIE su

Terreno contenente tetraciclina
terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA

Mutante plasmidico
Prof.
Prof. Renato Fani
 Genetic and
molecular
characterization of
plasmid DNA from
twenty HisB +

revertants Prof.
Prof. Renato Fani
Extraction of
Extraction of mutant
mutant (?)
(?) plasmid
plasmid DNA
DNA
from 20 HisA + revertants
from 20 HisA revertants
+

Transformation
Transformation of
of
hisA
hisA,, hisF, hisB
hisF, hisB E.coli
E.coli cells
cells

Ability of
Ability of mutant
mutant plasmids
plasmids to
to
hisA,, hisB
complement hisA
complement hisB and/or hisF
and/or hisF

Prof.
Prof. Renato Fani
 Origin Complementation*
Selective conditions
FB251 hisB FB184 hisA FB182 hisF
Plasmid Strain His N cells Time
plated 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1

pAF58 FB184 - - - - - - - - -

pDS1-3 “ 0 5x106 2 + + + + + + + + +

pDS4-5 “ 0 5x107 3 + + + + + + + + +

pDS6-7 “ 0 5x107 4 + + + + + + + + +

pDS8 “ 0.1 5x106 2 + + + + + + + + +

pDS9-11 “ 0.1 5x107 2 + + + + + + + + +
pDS12 “ 0.1 5x107 3 + + + + + + + + +
pDS13 “ 0.1 5x107 5 + + + + + + + + +

pDS14-15 “ 1.0 5x106 2 + + + + + + + + +

pDS16 “ 1.0 5x106 3 + + + + + + - - +
pDS17-18 “ 1.0 5x106 3 + + + + + + + + +
pDS19-20 “ 1.0 5x107 4 + + + + + + + + +

* Growth on selective medium after 24 h incubation at 37°C

Prof.. Renato Fani
Prof Renato Fani
 These
These results
results suggest
suggest that
that

The appearance
The appearance of of HisB
HisB++ revertants
revertants was
was due
due toto aa mutation
mutation
occurring in
occurring in plasmid
plasmid pAF58
pAF58 and
and NOT
NOT toto aa retromutation
retromutation

This mutation
This mutation might
might have
have generated
generated aa
promoter-like sequence
promoter-like sequence rendering
rendering the A. brasilense
the A. brasilense his
his operon
operon
(efficiently) transcriptable
(efficiently) transcriptable by
by the E. coli
the E. coli RNA-polymerase
RNA-polymerase

At least
At least two
two different
different mutations
mutations should
should have
have occurred
occurred

These
These mutations
mutations should
should have
have fallen
fallen upstream
upstream of
of the
the first
first gene
gene of
of
A.
A. brasilense
brasilense his
his operon , hisB
operon, hisB
Prof.
Prof. Renato Fani
 Phenotype
EcoRI BamHI
HisB HisA HisF
pAF58
Bd H Orf
168 A F E Orf
122 - - -
Mutant
plasmid
Bd H Orf
168 A F E Orf
122
+ + +

Bd H Orf
168 A F E Orf
122
+ + +

Bd H Orf
168 A F E Orf
122 - - -
The mutation
The mutation isis localized
localized onon the
the
479 bp
479 bp fragment
fragment including
including the
the 5’
5’ end
end of hisBd
of hisBd
and its
and its upstream
upstream region
region
Prof.
Prof. Renato Fani
 EcoRI BamHI

pAF58 Bd H Orf
A F E Orf
168 122

Mutant
Orf Orf
plasmids Bd H 168 A F E 122

PCR
PCR

Nucleotide
Nucleotide sequence
sequence
Prof.
Prof. Renato Fani
 Complementation
Nucleotide sequence
FB251 hisB FB184 hisA FB182 hisF
0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1

E.coli -10 consensus hisB

TatAaT
pAF58 - - - - - - - - - cttcctgaTAAAACccggactcatg

pDS1-15 + + + + + + + + + -------------T-----------
pDS17-20

pDS16 + + + + + + - - + ----A--------------------

Prof.
Prof. Renato Fani
 10

FB184 (pDS16)

O.D.550
OD550 FB251(pDS44)

0.1

0.01

10

O.D.550
OD550
FB184 (pDS1)
FB251(pDS49)

0.1

0.01
10

FB184 (pAF58)
1
OD550
O.D.550

FB251(pAF58)

0.1

0 1 2 3 4 5 6 7
0.01

Time (h)
Time (h)
Prof.
Prof. Renato Fani
 Promoter probe vector
Vettori per il clonaggio e l’analisi di sequenze regolative

Codoni di stop-traduzione leggibili

in tutti e tre i moduli di lettura

Shine e Dalgarno (gaagg)

Cams
Ampr
pKK232-8
T1
T2

T1
T2

Prof.
Prof. Renato Fani
 Working hypothesis
Cam phenotype

E. coli S

E. coli
Cams S
(pKK232-8) pKK232-8

E. coli P
R
(PKK001) Camr
pKK0001

Prof.
Prof. Renato Fani
 SAGGIO CAT
CAT
14CCam + Acetil-CoA 14CCam-Acetilato + CoA

Cromatografia

Di-acetilato

Mono-acetilato

Non acetilato
E.coli E.coli E.coli
E.coli (pKK232-8) (pKK0002) (pKK0001)

Prof.
Prof. Renato Fani
 CLONING
CLONING of of the
the
REGULATORY
REGULATORY REGION
REGION upstream
upstream of
of
the cam
the cam promoterless
promoterless gene
gene of
of the
the
PROMOTER-PROBE
PROMOTER-PROBE vectorvector

CAT
CAT ASSAY
ASSAY

Strain Plasmid CAT activity*

E.coli hisB - 1.2

“ pKK232-8 1.4
“ PKK0001 99.7

“ pKK0002 1.5

*percentage of 14C-acetylated Cam;

Cam; 0.01 µg of total proteins
Prof.
Prof. Renato Fani