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Tecnologia de DNA recombinante Processo de clonagem por recombinao Vectores de clonagem Enzimas de restrio Preparao de clulas para clonagem Seleco de clones recombinantes Produto PCR e sequenciao Southern blotting Criao de uma biblioteca (banco) de genes Varrimento de uma biblioteca de DNA Vectores de expresso
Construo
Transformao
Seleco
Construo
Requisitos:
Enzimas de restrio Vector plasmdico T4 DNA ligase Fosfatase alcalina
Vectores de clonagem
Caractersticas gerais:
- tamanho compreendido entre 1 e 500 kb - sequncia que funciona como origem do local de replicao na bactria (independente do cromossoma oriB) - representados por 10-100 cpias por clula hospedeira (mltiplas cpias) - representados por 1-4 cpias (baixo n de cpias)
Vectores de clonagem
pBR322
Local de clonagem mltipla
Plasmdeos
LacZ
(EMBL4)
BACs
Possibilidade de clonagem de genes at 300 kb Transformao de bactrias
YACs
Possibilidade de clonagem de genes at 1 Mb Transformao de leveduras Local de clonagem Marcas de seleco Centrmero 2 Telmeros Dividem-se quando a clula da levedura sofre mitose
+ ATP
pBR322
Combinao de enzimas de restrio
EcoRI HindIII
Clonagem unidireccional
- Cultura em placas (meio LB slido enriquecido com antibiticos) a 37C at ao aparecimento de colnias.
1) Meio de cultura enriquecido em ampicilina (seleco dos clones contendo o plasmdeo recombinante e o plasmdeo original)
2) Meio de cultura enriquecido em tetraciclinas (seleco dos clones contendo o plasmdeo original)
Caracterizao do plasmdeo
Caracterizao dos clones
Mapas de restrio (enzimas de restrio e electroforese em gel de agarose) Southern blot Northern blot
Amplificao do DNA
Sequenciao do DNA
Ciclos PCR
Desnaturao da dupla cadeia de DNA (95C) Ligao dos primers ao DNA molde (55C) (annealing) Sntese de DNA mediada pela DNA polimerase (75 C) Tempo total (aprox. 3-5 min)
3.9kb
650pb
400pb p10 - 450pb p14.5 - 550pb
Gel de agarose
Sequenciao do DNA
Aplicaes:
Confirmar a natureza das construes Identificar alteraes no DNA Caracterizar o genoma dos organismos vivos
Importncia da bioinformtica
Sequenciao do DNA
Mtodo da terminao da cadeia (Mtodo de Sanger)
electroforese
Sequenciadores automticos
Importncia da bioinformtica
Bancos de dados: Genbank e EMBL Sequence Database Anlise de sequncias: experimentao in silico
Aplicaes:
Software - identificao de genes e respectiva estrutura - traduo de sequncias de nucleotdeos em sequncias de aa - previso de estruturas de cidos nucleicos e de protenas - previso sobre a localizao e funo de protenas - procura de homologias entre protenas (ancestral comum) (funes similares sequncia de aa parecida) Similaridade vs homologia
FOS_RAT KCRNRRRELTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPNDLGF 212 FOS_MOUSE KCRNRRRELTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGF 212 FOS_CHICK KCRNRRRELTDTLQAETDQLEEEKSALQAEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKMPEELRF 211 FOSB_MOUSE KCRNRRRELTDRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEG- 229 FOSB_HUMAN KCRNRRRELTDRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEG- 229
Identificao do DNA por radiografia aps hibridao com uma sonda marcada de DNA
Identificao do DNA por radiografia aps hibridao com uma sonda marcada de DNA
(Nylon; nitrocelulose)
Autoradiografia (32P)
Lavagem
Marcao de sondas
Autoradiografia
(curto tempo de meia vida (perigo radioactividade) (muita sensibilidade)
Clonagem de sequncias de DNA que codificam para protenas eucaritas (bibliotecas de cDNA)
Vectores de expresso
- Protenas
Tipo de sistemas
- Vectores de expresso procariticos (bactrias)
Requisitos/caractersticas clonagem de cDNA (bactria no faz splicing de intres) sequncia de ligao aos ribossomas (ShineDalgarno) junto ao codo de iniciao promotores regulveis (ex: reconhecido pela RNA polimerase do fago T7) estirpes mutantes (T7 RNA polimerase indutvel no cromossoma bacteriano)
Vectores de expresso
Gene da resistncia ampicilina (seleco) Promotor tac (potente e regulvel) Local de ligao ao ribossoma Codo ATG separado por 8 nucletidos do local de ligao do ribossoma Locais de clonagem Terminadores de transcrio
Traduo
Estabilidade da protena Limitao oxignio
Secreo do hospedeiro
Controlo da transcrio
Gene clonado expresso apenas num estdio especfico do ciclo de crescimento celular Durao de expresso limitada
Promotores regulveis
E. coli Lac (lactose) Trp (triptofano) pL (repressor CI)
Interagem com indutores ou repressores especficos Reconhecimento pela RNA polimerase da E. coli
Regulao negativa
Glucose
Lactose
IPTG
(isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)
Elevada taxa de proliferao bacteriana Atenuar os efeitos txicos da sobreexpresso da protena heterloga
Expresso
Crescimento bacteriano
Aspectos crticos:
Local de ligao do ribossoma distante do codo de iniciao (AUG) Estrutura 2ria do RNAm no mascare o local de ligao ribossmico
aa
Met, Ser, Ala Thr, Val, Gly Ile, Glu Tyr, Gln Pro Phe, Leu, Asp, Lys Arg
T1/2
> 20 h > 20 h > 30 min 10 min 7 min 3 min 2 min
O2
Proliferao celular
Consumo de Oxignio
Produo de proteases
Integrao cromossmica
Recombinao homloga
Protenas de fuso
Objectivos:
Proteger o produto de expresso das proteases das clulas hospedeiras Permitir a purificao eficaz das protenas recombinantes a partir da biomassa Informao qualitativa e quantitativa sobre a expresso de protenas
Estratgia:
Promover a ligao covalente entre o produto do gene alvo e uma outra protena (ex. protena da clula hospedeira)
Construo ao nvel do DNA, atravs da ligao das regies codificantes dos dois genes (alvo e hospedeiro), mantendo inalterada a sequncia do gene alvo
Aplicaes:
Purificao por cromatografia de imunoafinidade
Glutationa-S- transferase (Ligando: glutationa; eluente: agente redutor) Polihistidina (His)6 (ligando Ni2+ eluente: Imidazole)
Estratgia:
Insero de pequenas cadeias de amino cidos que so reconhecidos como locais de corte por proteases no bacterianas
Factor de coagulao