动物细胞培养

第一章 绪论和基本理论知识

第一节 绪论

一、细胞培养的基本根念
体外培养的三个层次：
①组织培养(Tissue Culture)：指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营
养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
②细胞培养(Cell Culture)：用的也是同样方法，培养物是单个细胞或细胞群。
在培养组织过程中，现代的培养技术尚不能在体外长期维持组织的结构和机能长期不变。生存环境的
改变，加上细胞的移动(运动)和其它一些影响，培养时间过长，特别是反复传代，很容易导致细胞发生变
动或出现单一化现象，即趋向于变成单一类型细胞，最终便也成了细胞培养。另外所谓细胞培养，也并不
意味细胞彼此是独立的。细胞在培养中的生命活动和在体内时一样，仍然是相互依存的，呈现着一定“组
织”特性。所以，组织培养和细胞培养并无严格区别。因此这两个可作为同义语使用。
③器官培养(Organ Culture)：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部
分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养(In Vitro)。
┌细胞培养
体外培养┤组织培养
└器官培养

二、对细胞培养的评价
组织培养不仅是一种技术，也是一种科学。从广义上说组织培养分为动物组织培养和植物组织培养两
大类。本课只涉及动物组织培养。组织培养在生物科学和现代医学研究中应用极为广泛，这与其有一系列
优点是分不开的。
优点：
①能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学
等多种学科的研究工作。
②便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，能直接观察活细胞变化。
②可供研究的细胞种类极其广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤
细胞，皆可用于培养。
④便于使用各种不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等方
法观察和研究细胞。
⑤培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组(Genome)，也是分子生物学和基因工程学的研究对象；细胞培
养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分。
⑥易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究。
⑦可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。
⑧已成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。
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不足： 主要是组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，即使当前模拟体内技术发展很快，但
与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，把
实验结果外推至体内，轻易做出与体内等同的结论。
组织培养仍在发展中，很多技术日臻完善，随分子生物学、基因工程的不断发展和对细胞分化认识的
日益深入，我们相信，最终必能创出与体内更加相似的条件，使组织培养的应用价值更大。

三、组织培养发展简史
对组织和细胞的研究经历了四个世纪，其中组织培养的发展也经历近百年时间。
据文献记载:
①最早是德国人 Roux(1885)曾用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并使之活了数月之久，这被认为是组
织培养的萌芽试验。
②1903 年 Jolly 用盖片悬滴培养法，培养蜂蜕白细胞生活了近一个月。
③1906 年 Beebe 和 Ewing 用同样方法以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了 72 小时，并曾见
到细胞生长现象。
人们从上述试验得出一个重要的结论，即组织或细胞离体以后，在人工培养条件下，仍然能够生存。
因此这些早期的培养法，今天看来虽很简陋，却为以后组织培养的建立和发展提供了依据。

(一)观代组织培养的建立
一般认为现代组织培养是从 Harrison 和 Carrel (1907，1912)两人开始的。
①Harrison 参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。此法的基本技术是在无菌条件下，
采用淋巴液做培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾观察到神经细胞突起的生长过程。由此建立了
体外培养组织和细胞的基本模式系统。但要维持细胞在体外长期生存和生长，还必须克服污染和解决营养
问题。
②Carrel 是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用
了更新培养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法(Suspension Culture)。Carrel 用这种方
法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。
这些创造性的工作充分揭示，离体的动物组织在培养条件下，具有近于无限的生长和繁殖能力；并充
分证明，组织培养的确是研究活组织和细胞的极好方法。
1924 年 Maximow 又把 Carrel 的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。
Carrel(1923)又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了组织的生存空间。自悬滴培养问世后的 30 年中，以 Harrison
和 Carrel 为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表
了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。

(二)组织培养的发展
在悬滴培养法的基础上，从 50 年代起，组织培养进入了一个更加迅速发展的阶段。相继有很多学者，
从改进培养操作技术方法、培养容器和培养液三个方面，作了很多革新。在卡氏瓶原理的启示下，出现了
用试管培养。以后人们又设计出多种类型的培养瓶。从 40 年代开始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培
养。培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基(或称限定培养基)；促细胞生长物质从胎汁改用动
物血清。与此同时，培养技术方法的革新进展也非常迅速。Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理和应
用液体培养基的方法，获得了单层(细胞)培养(Single Layer Culture)。单层培养法的出现，对组织培养的发
展起了很大的推动作用。此后单层培养便成了组织培养普遍应用的技术。用单层培养法得以建立了很多细
胞系(Cell Line)。1948 年 Sanford 创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗传性状相同的克隆细
胞株(Cell line 或 Cell Strain)。根据研究工作的特殊需要，1951 年 Pomerat 设计了灌流小室，使细胞生活在
不断更新的培养液中，便于做显微摄电影和细胞代谢等研究。

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(三)现代组织培养
从 50 年代末起，组织培养技术的应用
进入了一个繁盛的阶段。生物科学和技术科
学相互渗透、遗传学和生物化学相互结合的
结果，出现了分子遗传学、分子生物学、细
胞工程等新兴科学。这些新科学的形成和发
展都与组织培养有密切关系。当前组织培养
技术已广泛用于生物学和医学研究各个领
域。反之通过应用又促进了组织培养技术的
发展。如出现了用各种理化措施诱发出遗传
缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克
隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌
物、癌基因转染和细胞转化等各种新技术。
当前的组织培养技术不仅是用于研究生命
科学理论的重要技术方法，也日益成为生物
工程和基因工程的生产手段。如新的中空纤
维培养法一次可培养细胞 1.2×l011 个，能用
于生产多种生物制品。
近年随着科技工业的发展，供细胞培养
用的各种条件，如瓶皿、培养基和血清等都
已商品化和系列化，使细胞培养工作已成为
轻而易举的事情。采用低温冷冻技术可把已
建立的多种细胞系和细胞株长期冻存起来。
应用冻存技术，在一些发达的国家已建立了
统一冻存细购的细胸库或中心。如美国的
ATCC(American Tissue Culture Collection)；
HGMR(Human Genetic Mutant Repository)，
CAR(Cell Aging Repository)等。在英国和日本等也有类似的机构。我国在上海和昆明也建立了小规模储存
细胞的实验室。现在全世界健存细胞的数量已难以计算。这些设施为开展组织培养技术和应用培养细胞进
行研究工作提供了极大的方便。

(四)我国组织培养的发展
早在 30 年代组织培养技术已传入我国，张钧、鲍鉴清教授曾分别在上海和北平倡导过组织培养方法，
并进行过一些实验工作。但因当时条件所限，终未能建立起稳定的组织培养研究室。
我国组织培养工作基本上是从 50 年代开始的。1952 年鲍鉴清首先在天津建立了组织培养实验室并编
写了《组织培养技术》(1954)。在此前后，北京、上海、武汉、长春各地也相继建立了用于医学研究或制
备生物制品的组织培养室。我国组织培养应用于微生物研究是比较早的(唐仲章 1953，汤飞凡 1956，王潜
渊 1957)。50 年代末 HeLa 等细胞系被引入我国(闻仲权 1957)。应用组织培养的研究工作时有报道(李昌遵
1959，李何民 1959)。
60 年代组织培养研究有了更进一步的发展。应用组织培养技术进行各种研究日趋增长。对微生物和病
毒研究发展最快(郭辉玉 1960，冯慧敏 1963)。在其他领域也得到了应用，如肿瘤细胞培养(潘琼娟 1960，
鄂征 1962)、神经细胞培养(鲍玻 1962，邵文割 1962，郭婉华 1963)、细胞培养染色体显示（吴曰文 1960)、
白细胞培养染色体研究(项维、刘祖洞 1962、吴吴、凌丽华 1963、汪安奇、周宪庭、周焕庚 1964，王志澄
1964)。与此同时细胞培养新技术的引入和改良也不断增多：如羊膜细胞培养技术(曾毅 1963，陈乃嘉 1964)、

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培养细胞支原体的污染和排除(萧顺 1964)、改良灌流小室培养(陈瑞明，沈鼎武 1964)，建立细胞系的的工
作也开展起来(何申、陈泉光 1963)。
从 70 年代起，我国组织培养技术发展更快。它已不再是个别研究室所拥有的技术，已成了医学和生
物学研究中普遍应用的手段。主要是如下的情况导致：
① 近二十年来已建立的人和各种动物肿瘤及其它细胞系，已不可胜数。细胞培养库已初建成。
② 细胞培养用品，培养基、血清、试剂等也已商品化。一次性培养用品也逐渐使用，各种精巧的培养用
具不断进入实验室，极大地促进了培养技术的发展。
③ 在应用组织培养的研究中，电镜观察技术、放射性核素标记、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、
细胞融合杂交瘤技术、DNA 转染和细胞转化、分子杂交等各种新技术的使用已较普遍。实验研究已从
细胞深入到分子水平。对很多现代课题如细胞转化、癌变机理、单克隆抗体、基因表达和癌基因等，
进行着广泛的研究，

(五)对组织培养工作者的要求和工作方法
有人认为，做组织培养工作，只要掌握了培养技术，细胞生长了，就算大功告成，其它似乎无关紧要，
这是一种片面的观念。从事组织培养时，不能仅满足技术操作，尤其在设备完善和科技高度发展的今天，
掌握培养方法并非难事，更为主要的是：
① 除掌握操作技术之外，尚需明白各种操作的基本道理。
② 要有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；
③ 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识。
这些不仅对科研工作者，对技术辅助人员也是必要的、组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而
严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序
如洗刷、配液、消毒等；制定出统一的规范和要求，并在一定时间内保持相对稳定和要求人人遵守。各种
用液(培养液、胰蛋白酶、Hanks 液、NaHCO2、抗菌素液)，均应由专人负责配制，并保证作到按规程行事：
制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备
日期。一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开；已
消毒与末消毒品应严格分开存放。一切措施都是为了：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染
和细胞“污染”。所谓细胞污染、是指不同细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体不纯的现象，
近年来世界上不少实验室都出现过这种事故，应引起注意。

第二节 组织培养细胞生物学

细胞在体外培养后，如一切条件适宜，便可生存和进行生命活动，如移动等，但最主要的是生长和增
殖。生长和增殖并非同一概念，
①细胞生长指的是：细胞体积增大。
②细胞增殖是:细胞数量增多。
体外培养细胞来源于体内，其基本细胞生物学规律和体内相同。但随生活环境的改变，很多方面如形
态结构和增殖规律等，与体内时又有很大差别。这里所叙述的是“体外培养细胞生物学”，即有关细胞在
体外培养条件下的细胞生物学行为。它具有着本身的特点和规律，不能为一般细胞生物学完全替代，是组
织培养工作者应熟知的知识。

一、体内外细胞的差异和分化

已如前述，目前人体内所有细胞基本上皆可进行培养。培养细胞已成为人们借以研究人体内器官、组
织和细胞的正常和异常生命活动的重要对象。但却面临一个重要的问题，即体外培养细胞和体内细胞有否
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差异，是否可视为同一。不然，培养细胞将失去其应用价值。因此这是一个十分重要和应首先解决的理论
问题。比较体内、外细胞可见，它们的增殖方式是相同的，均赖于有丝分裂。体内、外细胞的差异关键在
于细胞的分化，从而细胞分化是检测细胞差异的核心问题。

(一)体内外细胞的差异
当前人工模拟体内环境的技术已经很高，细胞生活在人工培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，
在一定程度上，人们已能控制细胞的分化。
但当前我们毕竞尚未能彻底了解人体内一切细胞活动的内在联系，人工所模拟的条件与体内实际情况
仍不完全相同。这样，当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互问的影响、生活在
缺乏动态平衡的环境中，日久天长，发生变化是必然的。
培养细胞最多见的表现是：
① 失去原有组织结构和细胞形态
② 分化减弱或不显、出现类似“反祖”(Atavism)现象
③ 表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。
上述变化曾使组织培养者困惑多年，近年随分子生物学研究进展，很多问题已获得了初步答案。
细胞增殖和分化是细胞生命进化中所获得的基本属性。组成人体结构、功能和生长发育的基本单位的
细胞，是已发生了高度分化的。表现在人体细胞与细胞之间呈现有着高度的相互依存性、和个体细胞相对
失去独立性。从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，便协调地进行着。增殖使细胞数量增
多，分化使机体结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间每个细胞的生命活动，均听命于外源
信号(来自其它细胞)，通过相关基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养后，信号来
源切断，特定基因分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；从而使体内外细胞出现
了差异。实际上这种差异从细胞离体培养开始的刹那间就开始了。

(二)培养细胞的分化
个体从一个受精卵通过发育形成组织、器官，并进行各种功能的过程，也可看作为细胞分化表达的过
程。细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由众多
基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。细胞离体培养因环境的改变，失掉上述在体内时的
关系，细胞的分化可能发生如下的变化：

1．不适应 (Deadaptation)：
细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶特性的丧失；有人证明肝
细胞产生酪氨酸转移酶需要激素(胰岛素、可的松)的诱导和与相应细胞基质(如 Collagen)的相互作用，只要
这些条件存在，便可产生。培养细胞分化的改变主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改
变越大；细胞刚离体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于环境的改变而出现的变化。

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2．脱分化或去分化(Dedifferentiation)：
细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。仍以肝细胞为例，当肝细胞失掉产生
精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉贮存肝糖原能力，并很难再现。因此不适应和脱分化两个概念是
不同的。不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。
因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和
分化因子的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。但即便是脱分化也并不意味
着细胞分化能力完全丧失。从细胞遗传学角度考虑，体外培养细胞，不论正常或肿瘤细胞都源于二倍体细
胞，也即含有与体内细胞基本相同的基因组(Genome)，也即存在着发生分化的依据。一种分化特性的丧失，
不等于彻底消除了分化能力。
总的来看，体外培养细胞不仅有分化潜能，实际上随细胞来源种属和遗传性状的不同，很多细胞也仍
然呈现着一定程度的分化表达现象(表 l—1)。如毛细血管内皮细胞在体外培养时，可形成类似血管样结构，
但仅限于初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。说明与体内条件越近似时，细胞愈易发
生分化。细胞离体培养时间越长，分化能力越差；培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。
另外细胞置于体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表达形式也发生了与原体内时不同的变化。如
二倍体成纤维细胞，在体外可传 30 一 50 代，相当于 l 50 一 300 个细胞周期，最后衰老死亡，呈现着生命
发展分化过程。在体内胶原蛋白(Collagen)是成纤维细胞和骨细胞的主要产物。而在体外培养的细胞，不仅
成纤维细胞能产生胶原，在一定条件下，上皮细胞、神经细胞，甚至一些肿瘤细胞也能产生胶原。
特异蛋白质或酶的表达也属分化现象。因此，细胞产生某一特定蛋白质的表达过程，可视为分化表达
现象。杂交瘤细胞产生特异的抗体也是细胞分化行为。细胞分化的关键，在于是否存在有诱导细胞发生分
化的因子如在培养液中存在有相应的因子时，体外培养细胞同样能发生分化现象。如 Friend 细胞(小鼠红
白血病细胞)在一定条件下可以合成血红蛋白，标志着肿瘤细胞向正常细胞状态转变。细胞恶变的本质是细
胞增殖生长和分化调控的失控。诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。近年证明维生素 A 酸(Retinoic
Acid)能诱导恶性细胞逆转，环腺苷酸 cATP 也有类似作用；现已发现能诱导癌细胞发生分化的作用物已非
常多。
阐明细胞分化机制不仅是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题，也是人们支配生物生长、解决人类物
质需要的极重要的手段，培养细胞是研究分化最理想的实验对象。

二、培养细胞形态分类(图 1—3)

体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型
和悬浮型两大类：

(一)贴附型
、 这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附型生长；只赖于贴附才能生长的
细胞称贴附性细胞 (Anchorage—dependent Cells)。
当细胞贴附在支持物上之后，易失去它们在体内时原有的特征，细胞分化现象常变得不显著。在形态
上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，呈现类似前述“反祖现象”。如来源于内、外胚层的细胞
多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型(这种现象又与供体的年龄有密切的关系；原供体越幼稚则
“反祖”越明显)；显然与细胞分化有关。由于上述原因，体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此
在判定培养细胞形态时，很难再按体内细胞标准确定，仅能大致作如下分类：
1．成纤维型细胞：
本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名；细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，
胞质向外伸出 2—3 个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状等。除真正的成纤维细胞外，
凡由中胚层间充质起源的组织：如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本类形态。另外在培养中的
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细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞；
因此组织培养中的成纤维细胞一词是一种习惯上的称法，与
体内细胞不同。
2．上皮型细胞：
本型细胞具有扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧
密相连，形成单层膜。细胞增殖数量增多时，整块上皮膜随
之移动；处于上皮膜边缘的细胞多与膜相连，很少脱离细胞
群单独活动。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物、
消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织培养时，皆呈上皮型
形态。上皮型细胞生长时，尤其是外胚层起源的细胞，细胞
之间常出现所谓“拉网”(Netting) 现象(见图 8-3)，即在构
成上皮膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使
上皮细胞膜中形成网眼状空洞。拉网的形成可能与细胞分泌
透明质酸酶有关。
3．游走型细胞：
本型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞
质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快
而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相
区别。在一定条件下，由于细胞密度增大联接成片后，可呈类似多角形；或因培养基化学性质变动等，也
可能变成成纤维细胞形态。
4．多形型细胞：
除上述三型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等到难以确定它们规律的形态，可统归
入多形型细胞。

(二)悬浮型
有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。
细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。其优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，
容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。

(三)对培养细胞形态分类的探讨
对组织培养细胞形态的分类，主要根据细胞在培养中的表现以及描述上的方便而定。当细胞处于较好
的培养条件时，形态上有相对的稳定性，在一定程度上能反映细胞的起源 [正常和异常(恶性)也可能区别
开来]。但必须意识到，培养细胞的一般形态，并不是一项很可靠的指标，原因是它可受很多因素的影响而
发生改变。譬如拿培养条件来说，就很难控制到丝毫不发生变化的程度。
① 如温度、支原体污染、培养基 pH 改变等都可使细胞形态发生变化。如 HeLa 细胞本属上皮型，但
在过酸或过碱的情况下可变成梭形，pH 适宜时又可恢复。
② 从细胞接种到细胞密度增大的一代生长过程中，细胞形态表现也有所不同，如上皮型细胞在刚接
种后不久，因细胞数量较少，细胞可能呈星形或三角形。只有当细胞数量增多后，多角形态特点
和上皮膜状结构才逐渐变得明显起来。
③ 另外贴附型和悬浮型细胞性质也不是绝对一成不变的，在一定条件下，悬浮型细胞可呈贴附状生
长，贴附型细胞也可呈悬浮状生长。
④ 当细胞发生转化后，细胞形态变化更大；成纤维细胞转化后可变成上皮形态。
由于培养细胞形态的易变性，在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些性状时应持谨慎态度。不应
仅仅依赖光学显微镜观察所见，必要时须做超微结构和其它方法的分析；如电镜下观察到桥粒时，可确认

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为上皮型细胞，因桥粒是上皮细胞所持有的结构，但在光镜下不可见，只有在电子显微镜下才能观察到。
因此电子显微镜所提供的形态学依据显然更为可靠。

三、培养细胞形态结构

组织培养细胞形态结构与体内细胞基本相同，但在大体形态以及某些细微结构方面仍存在着一定的差
异。

(一)大体形态
根据细胞是否贴附于支持物上生长，形态有所不同。
呈悬浮生长时，不论细胞原来源于体内何种类型细胞，由于生长在液体环境中，胞体基本呈圆形。
当贴附于支持物表面后，开始仍为圆形，但为时很短，很快便经过形态演变过渡成扁平形态。当支持
物表面平坦时，则细胞先由圆形延展成圆饼形。此时的细胞可称之为:
A.放射延展细胞(Radial Spread Cell)。其细胞质可区分为：
①中心区或内质，细胞中央为细胞核，核周胞质稠密区即内质(Endoplasm)，内含有较多的细胞器(主
要为线状或颗粒状线粒体和内质网)；
②外质(Exoplasm)或板层区，是胞质外周部分，无色透明包绕内质，用特殊的染色法在外质中，可显
示出微丝和微管。放射延展细胞持续 0.5～2 小时便过渡为极性细胞(Polarized Cell)。
B. 极性细胞: 可呈纺锤形、三角形或不规则多角形等多种形态。极性细胞形态常随细胞运动发生改变。
它们外质的周边部可分为活跃与不活跃的两部分；不活跃部分比较稳定，活跃部常伸出伪足，使细胞发生
定向运动。有时细胞从悬浮状贴壁附于支持物上后，也可不经过放射延展阶段直接进入极性细胞(图 1-4)。
当细胞相互接壤成片后，极性常变得不明显，外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。
在一般光镜下直接观察体外培养健康活细胞时，细胞是均质而透明的，结构极不明显。只有用相差显
微镜才能看清细胞的轮廓和内部结构。培养中细胞一般有 l～2 个核仁。用固定染色法和特殊技术可显示出
细胞器等结构，但在生活时的细胞中却不易观察到。
在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增
大。在胞质中时而出现颗粒、脂滴和空泡等，是细胞代
谢不良的表现； 反差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体。
细胞形态结构与细胞在体外生存时间的长短、细胞种类
等有直接关系。初代培养的正常二倍体细胞，除大体形
态外，在构造和生物学性状上与原体内细胞近似性大，
细胞均质性和透明度都很强。随细胞在体外生活时间的
延长和反复传代，会发生一定的变化，如轮廓增强、核
仁增多、有时出现双核或多核巨细胞等。如细胞发生转
化，它们的形态发生的变化更大。肿瘤细胞与正常细胞
有明显的区别。

(二)超微结构
电镜下观察组织培养细胞膜亦分为三层结构，总厚度约 7.5nm，由双层类脂分子组成，亲水极互相对
应，疏水极向外，双层分子间嵌有蛋白质分子。细胞膜向外凸出形成泡状、叶状、丝状和指状突起，长度
比较一致，存在时间也长，这类突起称微绒毛。随细胞类型、正常或异常(肿瘤细胞)，以及处于周期阶段
不同，微绒毛的形状和数量均有差别。即使细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙。成纤维细
胞之间的间隔不恒定，上皮细胞相互之间一般有 1.5nm～15nm 的间隙。细胞相互接触部并可见到桥粒
(Desmosome)；桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志。
细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，即细胞外衣。它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于
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支持物生长有很大作用。用胰蛋白酶消化处理细胞，能改变细胞外衣的性质，使细胞易从支持物上脱落下
来，此外细胞外衣与物质交换、酸碱平衡及膜电位等均有一定的关系。
在细胞膜下面有一层厚 100nm～500nm 的胞质区，称膜下皮质层。该层具有中等电子密度，其中常见
有直径 5～7nm 的微丝。微丝在膜下皮质层中分布甚广，它们主要由多聚肌纤蛋白组成。它们在膜下皮质
层中有两种存在形式，
① 是呈不定形基质，
② 是组成微丝束，后者可观察到。
微管是另一种细丝，比微丝粗而长，由管蛋白(Tublin)组成，分散在细胞中各处。微丝和微管构成细胞
质中骨架系统(Cytoskeleton System：CSS)；CSS 除与细胞形态和细胞运动有关外，对细胞膜的功能如吞饮、
免疫反应等都有关。细胞松弛素 B(Cytochalasin B)、秋水仙素(Chochicine)和刀豆球蛋白等对细胞的特殊效
应也与 CSS 有关。转化细胞中的 CSS 的排列状态与正常细胞不同，正常细胞中的微丝微管走行有一定方
向性，细胞转化后走行紊乱(组装差)，被视为一项检测的标志。
细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质。
线粒体形态结构与体内细胞相似，但常随细胞生长状态不同有很大变化；在机能状态良好的细胞中，
呈杆状或卵圆形，数量较多，当细胞机能低下或代谢不良时，能变成颗粒形或集聚成更大的团粒，在光镜
下明显可见。
细胞核超微结构与体内细胞无大差别，核膜仍为双层结构，也能看到核孔。永生性细胞系和肿瘤细胞
的细胞核一般比较大，染色质比较丰富，核仁大而多。

四、组织培养细胞的生长和增殖过程

体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和
营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的
继续生存，这一过程叫传代 (Passage 或 Subculture)。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的
影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，
使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。

(一)组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体
的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情
况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传 30～50 代，相当于 150～300 个细胞
增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供体为成体或衰老个体，则生存时
间更短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞；
生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞
发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞
的生存期才可能发生改变。对此以后将详叙。
但进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供
体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历
以下三个阶段(图 1-5)：

1．原代培养(Prmary Culture)期：
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到
第一次传代阶段。此期细胞呈活跃的移动，可见细
胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在
形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的
9
(Heterogeneous)，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细
胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率(C1oning Efficiency)很低，即细胞独立生存性差。克
隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群(克隆)的百分数。初代培养细胞多呈
二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

2．传代期：
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条
件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系(Diploid Cell
line)。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十
代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉
二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代 10~50 次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入
第三期。

3．衰退期：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，
少数情况下，在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发
转 化 (Spontaneous Transformation) 。 转 化 的 标 志 之 一 是 细 胞 可 能 获 得 永 生 性 (Immortality) 或 恶 性 性
(Malignancy)。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite
Cell Line)，也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系(Established
Cell Line)，现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型
大多变成异倍体(Heteroploid)。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞
永生性和恶性性非同一性状。

(二)组织培养细胞一代生存期
所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的
频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同
增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要
快)。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情
况都会缩短传代时间。
所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞
接种到分离再培养时的一段时间，这已成为
培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增
一代非同一含义。如某一细胞系为第 153 代
细胞，即指该细胞系已传代 153 次。它与细
胞世代(Generation)或倍增(doubling)不同；在
细胞一代中，细胞能倍增 3—6 次。细胞传
一代后，一般要经过以下三个阶段(图 1-6):

1. 潜伏期(Latent Phage)：
细胞接种培养后，先经过一个在培养液
中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回
缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附
于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种
细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养
基成分和底物的理化性质等密切相关。初代

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培养细胞贴附慢，可长达 10～24 小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30 分钟即可贴附。细胞
贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，
底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，一些特殊物质如纤维连接素(Fibronectin)，又称
LETS(Large External Transformation Substance)，细胞表面蛋白(Cell Surface Protein, CSP)等也参与贴附过程。
这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面(如 CSP)，有的则来自培养基中的血清(LETS)。
近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。
细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和
增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细
胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约 24～96 小时或更长，连续细胞系和肿瘤细
胞潜伏期短，仅 6～24 小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细
胞已进入指数增生期。

2．指数增生期(Logarithmic gowth phage)：

这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛
与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(Mitotic Index：MI)表示，即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂
相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的
分裂指数介于 0.1％～0.5％，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3％～5％(肿瘤细
胞偏高)。pH 和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时
期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞
数量适宜情况下，指数增生期持续 3～5 天后，随细胞数量不
断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细
胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能
抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制(Contact Inhibition)。而
恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与
癌细胞标志之一(图 l-7)。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动
和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积(Piled up)。
细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞
仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密
度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细
胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density
Inhibition)，导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑
制是两个不同的概念，不应混淆。

3. 停滞期(Stagnate Phase)：
细胞数量达饱和密度后，细胞就停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，故也称平顶期(P1ateau)。
停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需
做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过
晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢
复，至少还要再传 1～2 两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。

五、培养细胞增殖动力学(Culture Cell Kinetics)

组织培养细胞是研究细胞动力学和细胞有丝分裂过程非常好的对象。当前对培养细胞的增殖过程和周
期规律已有很深入的了解。
根据细胞周期学传统概念，细胞周期＝间期(G1 期+S 期+G2 期)+M 期，可简称之为 GSM 周期。这一
11
概念虽基本符合体内外细胞增殖生长的规律，但却末完全反映细胞增殖生长状态，这一概念存在着有待修
饰的必要。我们按新的理解进行分析。
按动物体细胞，包括体外培养细胞，有两种基本状态：即增殖态和功能态(图 l—8)。

(一)增殖态(Proliferation State)
增殖态即细胞进行增殖的状态或过程；
细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分
裂(Mitosis)。细胞增殖的基本条件或前提为
细胞质和细胞核的复制；两者是正常细胞增
殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成
后，细胞才能发生分裂；而细胞有丝分裂所
完成的主要是细胞质和细胞核的分配。

1．G1 期：
发生于上一个增殖周期的分裂期后，
DNA 合成期前，故也称为细胞分裂后期，
或 DNA 合成前期。G1 期是细胞质复制的主
要阶段，细胞进入 G1 期标志细胞已进入增
殖态。
上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入 G1 期，取决于外源生长因子(Growth Facter)和其它增殖
相关因子的调控。细胞进入 G1 期后，也仍然受其它因子以及营养物质的影响。在 G1 期中，有能接受外界
因子影响的特定阶段，称调节点(Regulation Point：RP)。近年研究证明 G1 期存着不止一个 RP。细胞在 G
期时因营养物质缺乏和在调节因子的作用下，可导致发生阻滞，使 G1 期延长。因此 G1 期的持续时间变化
很大，短则 4～6 小时，长可到几天。增殖旺盛细胞的 G1 期持续时间短，衰退细胞持续时间长；培养细胞
属旺盛增殖细胞群体，一般具有较短的 G1 期。G1 期主要活动为细胞内的蛋白质、RNA、多核蛋白体合成
增多等；G1 期胞体逐渐增大，是镜下唯一可感知的变化。

2．S 期：
即 DNA 合成期，主要机能活动为进行 DNA 合成。各种细胞 DNA 合成持续时间差别不大，比较恒定，
平均 6—8 小时，除用抑制 DNA 合成药物如 5—氟尿嘧啶等外，细胞一旦进入 S 期，DNA 合成过程一经开
始，大多能持续进行，独立性较大，对环境不利因素有一定耐受能力。但 DNA 在进行合成时，多核苷酸
双链发生分离，在此阶段，易受致突变或致癌因素作用。

3．G2 期：
发生在 DNA 合成后和本次细胞分裂期之前，故也称 DNA 合成后期或细胞分裂前期。细胞进入 G2 期
后，DNA 含量已加倍，具有 4 倍量的 DNA。在 G2 期主要的变化是与细胞分裂相关的 RNA 的合成和染色
质的螺旋化。本期持续时间较短，平均 2～5 小时。G2 期对外界环境敏感，易受温度、pH 及各种其它因素
的影响而受阻不能进入 M 期，但不利作用消除后却能很快恢复。

4．M 期：
即细胞有丝分裂期，组织培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。M 期结束形成两个子细胞，是细
胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到(见照片 8-6)。组织培

12
养细胞是研究细胞有丝分裂过程
理想的对象，活细胞的分裂相形态
和分裂过程，在相差显微镜下可清
晰观察到。细胞分裂过程分前中后
末四期，活细胞分裂过程表现如
下：
①前期：G2 期结束后的细胞
是如何过渡到前期的，尚难确定出
明显的标志。用缩时逐格显微摄电
影技术显示，细胞核发生转动可能
是前期的开始。当染色体在核中出
现并愈来愈清楚时，证明细胞已进
入分裂前期。稍后，核膜和核仁突然解体消失，染色体遂混于细胞质中并呈现活跃的运动(类似布朗运动)。
与此同时，整个细胞也显现活跃的运动；从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起，它们此起彼伏犹如
液面沸腾，蔚为壮观。此时细胞质逐渐回缩，细胞体趋于变圆，遂与底物附着面减少，易脱落入培养液中。
染色体由分散状态渐向细胞中央部移动，然后突然“冻结”于赤道平面，到此前期结束，中期开始；前期
持续时间 20～30 分钟。
②中期：细胞进入分裂中期后，胞质进一步回缩，胞体呈圆球形，与支持物附着面缩小达极限。如于
此时摇动培养瓶壁，在培养液的冲击下，细胞极易从瓶壁脱落，依此可作为收集中期分裂相的简易方法。
由于中期细胞呈圆形，折光性强，在镜下极易识别。染色体集中于赤道平面后，失去明显的运动；中期染
色体集聚在赤道平面上称中期板(Metaphase P1ate)。中期板有一定的方向性，即中期板常与支持物平面相
垂直，两中心体分别位于两端(极)。细胞分裂中期持续 20～30 分钟。本期细胞对外界因素敏感，易受外界
因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。
⑧后期：一旦中期板染色体开始一分为二，即标志后期开始。接着染色体分成两组，分别向两极移动。
此时，整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球形；在赤道部并出现纹窄，胞体呈哑铃形；后期时两组染色体相
互分离，是细胞分裂过程中最快的，仅持续 5～7 分钟，在显微镜下可直接观察到。
④末期：此时两组染色体己达于两极，胞体中部进一步变细。继之一切变化与前期相反；染色体变成
染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时间后才彻
底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态；末期持续时间
20～30 分钟。
细胞分裂全程持续时间一般为 30～60 分钟，但因细胞种类不同和温度的变动，分裂时间可有一定差
别。另外在长期传代或培养环境中某些因素影响下，经常见有异常分裂现象，如三极分裂或多极分裂等。
正常细胞的一次增殖过程，以分裂结束形成两个相同
的子细胞后而告完成。这既赖于细胞质、遗传物质复制和
细胞分裂三个过程的完成，也依赖于它们之间的相互协调
性。细胞质和细胞核分裂的不协调，如只有胞核分裂而胞
质不分裂，反复经过几个细胞增殖周期后，可导致形成多
核巨细胞。另有一种异常的分裂叫核内有丝分裂
(Endomitosis) ， 又 称 内 复制 (Endoreduplication) ，即仅 有
DNA 的复制，而无核分裂现象，经下一次细胞增殖周期
或经过几个细胞增殖周期后才出现分裂，可导致产生多倍
体(Polyploid)，并常伴有双染色体(Diplochromosomes)现象
(照片 1-1)。上述几种异常分裂，在体外培养细胞尤以无限
细胞系和肿瘤细胞系等是比较常见的。

13
(二)功能态(Functional State)
功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。细
胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的分化态(Differtentiation
State)。功能态存在于细胞分裂之后，G1 期前，也即在两次增殖态之间。若从细胞增殖态周期角度看，功
能态是两次增殖周期之间的间期 (Interphase) 或 G0 期。同一 G0 期，由于细胞的不同，其生物学的意义是
不一样的。以功能活动为主的细胞的 G0 期是功能期；以增殖活动为主的细胞的 G0 期则是名副其实的间期。
传统 GSM 增殖周期概念中，把 G0 期归属于 G1 期，视为 G1 期的阻滞。
细胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有相互依存的关系。根据这两种状态属性的不同，
可把细胞分作如下三类：

1．活跃增殖细胞：
这类细胞是以增殖为主的细胞，它们增殖频繁，具有较短的 G0 期，无分化现象。从而它们的 G0 期最
为符合间期概念，故可称之为 G0i(G0 of Ineterphase： G0i)。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞
均属之。本型细胞在体外易于培养，成活率高。

2．功能 I 型细胞：
这类细胞是以完成功能活动为主的细胞，其 G0 期是完成功能活动的主要阶段。故本型细胞的 G0 期可
称之为 G0 (G0 of Function：G0f)。体内各种腺细胞、结缔组织细胞、淋巴细胞等属之。在一定条件下，本型
细胞尚可重返增殖态；如肝细胞，受损后能重新再进入增殖态，损伤修复后又恢复成功能态。

3．功能 II 型细胞：
体内神经细胞、骨路肌细胞等，是终末分化细胞。它们长期处于 G0 期进行功能活动，少见或不进行
增殖。本型细胞在体外难以培养和存活(成体)。

(三)体内外细胞增殖和分化调控的差别
细胞群的增殖率主要取决于细胞增殖周期的相继密度和细胞群体中参与增殖细胞数(增殖的细胞／群
体)，而不在于一个 M 期本身持续时间的长短。
体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反复进行增殖活动。但当营养缺乏、
尤其是缺乏生长因子时(如降低血清含量)，细胞多停滞于 G0i 期。此时的细胞由于蛋白质和 RNA 的降解、
核糖体为单体而非多聚体，酶的活性和越膜活动等较低，因此细胞体积较小。培养中的成纤维细胞当被置
于不良状态时，如降低培养基中血清含量，一小时后即进入 G0i 期，如再补加血清，又可再重返 G1 期。从
阻滞的 G0f 期进入 S 期所需时间较长，如 3T3 细胞（胚胎成纤维细胞）需 12 小时。在无 G0i 期阻滞时，一
次细胞分裂完了，只需 6 小时便可进入到 S 期。说明体外培养细胞的生存中，正常情况下，G0i 期是很短
的。但也随细胞种类不同而异，二倍体细胞较长，永生细胞和肿瘤细胞系较短。
体内细胞进入增殖抑或发生分化，均取决于自身以外的调控信号。正常细胞离体培养后，信号来源切
断，在培养液中如没有促细胞增殖因子或不充分时，细胞便停止增殖。向培养液中补加血清，在于供给细
胞所需生长因子，对于正常细胞尤为重要。如细胞发生恶性转化，则出现血清需求降低的现象。研究证明，
是与恶性转化细胞获得能以自泌 (Autocrine) 方式产生生长因子所致，即细胞具有“自给自足”供生长因
子能力。因此细胞降低血清需求可视为细胞恶变的一项指标。

六、组织培养细胞遗传学特征

利用组织培养细胞很适于做细胞遗传学研究。细胞遗传学特征是检测培养细胞一项极重要的指标。体
内细胞的遗传学特征是比较稳定的，但细胞离体培养后，在培养过程中，却很易发生细胞遗传学变动。因
14
此掌握培养细胞的细胞遗传学动向，是了解细胞性状的一个极重要方面。随着近年细胞融合、免疫组化、
原位杂交、基因工程和 DNA 重组技术的发展和应用，弥补了细胞遗传学和分子遗传学问的不足，使它们
已形成了更加完整的体系。但细胞遗传学仍然是了解培养细胞遗传性状最基本和必要的技术，因此利用培
养细胞进行研究的工作者，必应具有一定细胞遗传学知识。

(一)核型变化
染色体、染色质和 DAN 是细胞中同一遗传物质的不同的存在形式。间期细胞核中的染色质在细胞进
入分裂时变成染色体；在分裂中期时染色体呈标准形态是研究染色体形态结构最好的阶段。人体体细胞具
有二倍体核型，在组织培养中呈二倍体核型的细胞群体称二倍体细胞(Diploid Cells)，染色体数目为 46(2n)。
能维持培养细胞保持二倍体状态的培养方法称二倍体细胞培养。初代正常培养细胞多呈二倍体，通过
传代成细胞系后，在培养条件良好的情况下，二倍体细胞可能长期保持二倍体状态。但体外细胞培养环境
的稳定性是相对的，细胞经过长期传代后，会发生偏离二倍体现象，即染色体数变成多于或少于 46。但只
要具有二倍体核型细胞数在这一群体中仍居优势，即占 75％以上时，这样的细胞系或细胞株仍可视为二倍
体。
当细胞发生转化、恶变或原来即为肿瘤细胞的情况下，大多失去二倍体核型，成为多倍体(Polyploid)、
异倍体(Heteroploid)或其它形式的变化。其中以异倍体居多，培养细胞经常发生着异倍化，可视为是细胞
随环境的变化呈现自然选择和淘汰的过程。结果导致在细胞中可存在几个不同核型的细胞系；当某一核型
的细胞，在该细胞群中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群即称为干系(Stem Line)，也叫众数或主流
数。主流细胞可能是有生长优势的细胞群。不同细胞系(或株)，或同一细胞系处于不同代，它们的主流数
皆可有别。因此实验者对长期使用的细胞或新引进的细胞，应做定期核型检查，以掌握细胞的遗传动向。
在各类培养细跑中，有时可见到异形染色体，如双着丝点、环形染色体、长臂或短臂缺失等。当某一
特 殊 形 态 的 染 色 体 不 断 反 复 出 现 并 占 有 很 大 比 例 时 ， 这 种 染 色 体 可 称 之 为 标 记 染 色 体 (Marker
Chromosome)，可作为描述细胞群细胞遗传学特征和改变的一项标志。

(二)永生化和恶变
细胞永生化也称不死性，是细胞获得持续生长增殖能力的特性。而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有
异体接种致瘤性。
在体外培养的正常细胞有两个主要的特征，一是具有二倍体核型，二是增殖生长期是有限的。
而永生化的细胞则具有无限增殖生长性，长期传代不死，并多伴有核型改变。
早年曾把永生性和恶变视为同一，近年研究证明两者是细胞两种不同的性状。永生化的细胞不一定具
有恶性，但却易进一步演变成恶性细胞，因此人们认为永生化可能为癌变过程中的一个阶段。关于永生化
和恶变的检测技术方法将在细胞转化和癌基因章节详述。

(三)细胞性别
女性的两个 x 染色体中的一个在间期时呈明显的异固缩(Heteropycnoeis)状态，
呈三角形或半月状小体，
紧附在核膜内面，称巴氏小体(Barr’
s body)；男性 Y 染色体在间期则形成颗粒状 Y 小体，位于胞核的近中
央部位。女性细胞的巴氏体和男性的 Y 小体在培养细胞群中都可检测到。说明培养细胞仍保持着性别特征。
用特殊染色法可显现出巴氏体和 Y 小体。初代培养细胞易于显现，细胞系或已发生转化细胞有可能发生改
变。

七、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系

细胞在体外培养系统中，在一定条件下，单个细胞也能生存和增殖生长，表现有很大的独立性。但这
并不说明组织培养中的细胞都是独立的，单个细胞不是细胞永久存在的形式，它不能长期生存。一个有活
力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。组织培养细胞和体内组织
15
相似，细胞与细胞之间仍具有在形态上和机能上的相互依存关系。在结构上，上皮细胞仍见有桥粒；有证
明，当向群体中一个细胞内注入荧光素后数分钟，此细胞周围的其它细胞中便可发生荧光，说明细胞间能
进行扩散。已观察到在体外培养细胞之间存在有管状结构的连接物。
在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存力强，细胞量多时比少时易于培养，说
明细胞之间能相互沟通信息。例如正常细胞培养中，一旦两相邻的细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导
致运动停止。以上这些，都是细胞相互沟通生物信息的结果，使细胞呈现着相互依存性或群体依赖性
(Population Dependence：PD)。正常细胞群的 PD 比转化细胞大，转化细胞和恶性化细胞 PD 小，即 PD 与
细胞恶性成反比关系；恶性细胞独立生存能力增大。单细胞培养和软琼脂培养是检测细胞 PD 的常用方法。
体内细胞的分化等功能与细胞外基质(Extracellular Matrix：ECM)有密切关系，离体培养细胞对 ECM
仍有依存性。应用适应性的 ECM(如上皮细胞对胶原)能诱导细胞特性的表达；ECM 对细胞贴附、分化、
生长和增殖等都有重要作用。

第三节 培养细胞生存环境、条件和代谢

细胞在体外培养中所需的生存条件和物质代谢过程与体内细胞基本相同，但随生存环境的改变呈现着
一定的差异。

一、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。人体内环境同样需要无菌和无毒。但在有害物
侵入体内或代谢产物积累时，由于体内存在着强大的免疫系统和解毒器官(肝脏等)，对它们可进行抵抗和
清除，使细胞不受危害。当细胞被置于体外培养后，便失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污
染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无任何污染、代谢物及
时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

二、温度(图 1-11)

维持细胞增殖生长，必须有适宜的温度。人和哺乳动物培养细胞标准温度为 36.5℃士 0.5℃，偏离这

一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。只有鸟类细胞要求温度为 38.5℃，一般细胞在 36.5
℃中培养亦可。总的来说，培养细胞对低温的耐受力比对高温强。温度上升不超过 39℃时，细胞代谢强度
与温度成正比。培养细胞在 39～40℃ l 小时，即能受到一定损伤但仍有可能恢复；在 41～42℃l 小时，细
胞会受到严重损伤，但不致全被杀死，个别细胞仍
有可能恢复；当温度达 43℃以上 1 小时，细胞都将
被杀死。相反，温度不低于 0℃时，对细胞代谢虽有
影响，但并无伤害作用；把细胞置于 25～35℃时，
细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在 4℃数小时
后，再置回 37℃培养细胞仍能继续生长。细胞代谢
随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时，细胞可
因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加
一定量的保护剂(二甲基亚矾或甘油)，再冻存于液氮
中，温度可达-196℃，能长期贮存，解冻后细胞复
苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影
响，成为保存细胞最主要的手段。

16
三、气体环境和氢离子浓度

气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生能
量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有一些细胞在乏氧情况下借糖酵解也可获取能量，但多数细
胞缺氧不能生存。氧气分压 1995～9975Pa，适于封闭式单层细胞培养；开放培养时(碟皿或培养瓶松盖培
养)，一般要把细胞置于 95％空气加 5％二氧化碳混合气体环境中。培养环境中氧气分压超过大气中氧含量
时对细胞能产生毒害作用。
CO 2 既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它的主要作用在于能维持培养基的 pH 值。大多数细胞
的适宜 pH 为 7.2～7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。但各种细胞对 pH 的要求也不完全相同，原
代培养细胞一般对 pH 的变动耐受差，永生性细胞系和恶性细胞耐力强。但总的来说，细胞耐酸性比耐碱
性大一些，在偏酸性环境中更利于生长。譬如，原代羊水细胞培养检测染色体时，有人证明在 pH6.3 时最
适。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放 CO 2，致培养基变酸，pH 发生变
动。CO 2 影响培养基的作用在于：
—
CO 2+H2O↔ H2CO3↔ H++HCO3 ①

H2CO3 离解系数较低，趋于重结合导致培养基变酸；因此在气体环境中 CO2 增加时趋于压制或降低

PH。CO2 分压升高可用 NaHCO3 调节，其作用机制为：

—
当 HCO 2 浓度增加时能推动①式向左移动，使 pH 达到 7.4 平衡为止。如用强碱 NaOH(1N)调节，其
结果相同；
NaOH + H2CO3↔ NaHCO3 + H2O ↔ Na+ + H2CO3 + H2O ③
为维持培养液的恒定 pH，最常用为加磷酸缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的 NaHCO3 可供给 CO2，但 CO2
易于逸出，故只适用于封闭式培养。常用的 Hanks 平衡盐溶液中含有低浓度的 NaHCO3，当打开含有 Hanks
液培养瓶时，则 CO2 能迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液 pH 变碱。细胞在碱性环境中时间过
长可使细胞碱中毒；因此在开放式培养时，需放在含有 5％CO2 的气体环境中培养。为克服用 NaHCO3 调
整的麻烦，也可用经乙基呢嗓乙硫磺酸(N’-2-Hydroxyethyl Piperazine-N’-Ethanesulfonic Acid：缩写 HEPES)，
它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要是能防止 pH 迅速变动，其最大优点是在开瓶通气培养或活细胞
观察时能维持较恒定的 pH。

四、体外培养细胞生存所需基本物质

凡能进入细胞中被细胞所利用、参与细胞代谢活动和能维持细胞生存的物质均属营养物质。体外培养
细胞所需营养物质与体内基本相同，除碳水化物、氨基酸和脂类三大营养物质外，也需要一定量的无机盐、
维生素和微量元素等，但需求的量以及代谢方式上与体内细胞不尽相同。

(一) 糖
培养细胞不论有氧氧化还是无氧糖酵解其强度都很大。六碳糖是主要的能源，通过糖酵解形成乳酸和
通过柠檬酸循环形成 CO2。在胚胎细胞和一些转化培养基中常见乳酸堆积现象，说明体外细胞不完全像体
内那样依靠柠檬酸循环糖解。近有证明谷氨酰胺也是碳的重要来源。糖也是合成某些氨基酸的原料；经过
乙酰辅酶 A(CoA)可合成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸。各种糖的吸收取决于它们进入细胞中的能
力，其中葡萄糖最强，半乳糖最低。

17
(二) 氨基酸
所有细胞多需要以下 12 种基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯
丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。这些氨基酸都是细胞用以合成蛋白质的原料。胱氨
酸和酪氨酸，不同细胞系所需量不同；另外所有细胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺具有特殊作用，能促进各
种氨基酸进入细胞膜。它所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，同样也是合成 3，2 和一磷酸腺苷时的所
需物，也是能源和碳的来源。
培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸，毗多醇、核黄素、硫胺素及 B12 等。这些
维生素在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。维生素 C 也是不可少的，它对具有合成波原能力的
细胞尤为重要，但维生素 C 易氧化，不很稳定，在长期培养中如何维持它的持久效应，尚待进一步研究。
脂溶性维生素对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。

(三) 促生长因子
培养液中除上述营养成分外，同
样也需要激素类物质，尤其需要促细
胞生长因子。已证明很多激素具有促
细胞增殖生长作用。胰岛素能促细胞
利用葡萄糖和氨基酸，用量 1～10 单
位／毫升，对很多细胞的增殖生长均
有促进作用。氢化可的松也有促进表
皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长
的效应，能提高神经胶质细胞和成纤
维细胞的克隆形成率，用量 10-8 ～
10-7M。综合使用雌激素和雄激素，或
综合使用黄体酮和氢化可的松(或催
乳素)，对支持乳腺上皮细胞培养效果
很好。
血清是提供生长因子和其细胞所
需物质的来源，现已从血清、各种组
织和其它生物成分中，用生物工程方
法制取出多种促细胞生长物并已商品
化(表 1—2)：
近年研究证明，血小板生长因子
(PDGF)是一种多肽，具有强烈刺激细
胞分裂活性，可能为血清中主要的促
生长物质。从凝血中分离出的血清中，
含有更多的 PDGF。另一促细胞生长
物质为生长调节素(SM)，是一种低分
子量的多肽，具有促进胸腺嘧啶核苷
酸掺入到 DNA 中的作用，对培养肿瘤
细胞很有利，具有与胰岛素竞争受体
的能力，产生类似胰岛素效应，还有
传递生长激素促骨细胞生长作用和刺激软骨细胞摄取硫酸盐。

18
 生长调节素有三型：
A 型呈中性，pH7.1—7.5，能刺激鸡软骨细胞吸收硫酸盐；
B 型呈酸性，pH5.9—6.4，能刺激胸腺确陡掺入神经胶质细胞中；
C 型呈碱性，pH8.6—9.4，有与胰岛素竞争的能力。

(四)其它物质
现又查明，细胞生长中，除需钾、
钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也
需微量元素，如铁、锌、硒等。有资料
证明，还需铜、锰、铜、钒等元素，但
均尚未明确所需用量。因此在培养液中
尚未作为固定成分应用，而且在末加这
些元素的情况下，细胞也能增殖生长，
这可能是由于在非限定物血清中含有少
量这些元素，从而得到补充的缘故。
体外细胞在生长中，除少数悬浮型
生长的细胞外，还需要促细胞贴附物质。
它们有助于促细胞贴附在各种底物或支
持物上增殖生长。近年除纤维连接素外，
已从各种组织和生物成分中分离出多种
促细胞贴附物质(表 l—3)。

五、渗透压

大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性，人血浆渗透压约 290mOsm/kg，亦可视为培养细胞的理想渗
透压，不同细胞可能有所不同；鼠细胞渗透压在 320mOsm/kg 左右，对大多数细胞来说，渗透压在
260mOsm/kg—320mOsm/k8 范围都适宜。

六、培养基

细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除需无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基。它是供
给细胞营养和保证细胞生长增殖的物质，细胞生长在培养基中，故培养基也是细胞的生存环境。培养基的
种类很多，按其物质状态，分半固体培养基(如软琼脂培养基)和液体培养基两类。液体培养基是最主要的，
按其来源，则分天然培养基和合成培养基。

(一)合成培养基(Synthetic Mediam)
合成培养基是根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。由于成分清楚，通过调节各种成
分的种类和数量，再借观察细胞生物性状反应性变化，能测知细胞与外界环境的关系，可借以了解细胞的
生存条件，并可诱导细胞进行定向分化等。合成培养基的应用，推动了组织培养的发展。

(二)天然培养基(Natural Medium)
现在人们对细胞所需成分虽已基本掌握，但尚未完全搞清，因此在使用合成培养基时，仍需加入一些
天然成分如人或动物的血清、血浆和胎汁等，否则细胞仍不能很好生长增殖，当前主要使用血清，其中以
19
牛血清为主。血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。把
细胞培养在合成培养基中，不加血清虽能生存，但不能很好生长增殖。当加入 5％的血清时，对大多数细
胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长。一般需加 10％一 20％的血清，细胞才能顺利增殖生长。由于血清
供体存在有各方面的差异，血清中的效应常不相同。另外添加血清虽利于细胞的增殖生长，但不明的成分
也随之增多，对分析实验结果增加了困难，因此人们仍在探索不用血清的无血清培养法，现已取得很大进
展。

(三)无血清培养基
在已知细胞所需促生长物质和促贴物质基础上，国内外有许多人在研究无血清培养基，当前已设计出
多种无血清培养基。这些培养中主要增添了促细胞生长因子，当前发现的各种促细胞生长因子已达几十种
之名。另外还有三碘甲状腺素、转铁蛋白以及大鼠领下腺粗提取物等，都有促细胞生长增殖作用。利用上
述促细胞生长物质的组合与合成的附加物，再与基本培养基相混合，便构成无血清培养基，对细胞有良好
的促生长效应，无血清培养基仍在改进与完善之中。

七、附着底物

除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附在底物上生
长的性质称锚着依赖性。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同的细胞，对底物要求各
异，底物不适，细胞生长不良。根据所培养细胞的种类和培养的目的，常用底物有以下几种。

(一)玻璃
这是最常用的底物，有透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，质地以中性玻璃为上。玻璃底
物适于各种细胞附着生长，玻璃用强硷如 NaOH 处理后，性质能受一定影响，需用酸中和后才可用。缺点
是易破碎。

(二)一次性塑料
塑料种类很多，常用有聚苯乙烯，欧美等国已广泛使用，我国也开始生产。聚苯乙烯材料具有疏水性，
制成培养瓶皿后，需加工处理，使表面带有电荷，遂产生疏水性。由聚苯乙烯制成的培养瓶皿，光洁平坦，
用于培养正常细胞、无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞生长均可。市售包装好的消毒商品，使用方便，一
般限一次使用，消耗量大，不甚经济，不同厂家产品，尚有质量上的差异。此外还有聚四氟乙烯制品，有
充电荷和非充电荷两种，前者具有亲水性，适一般单层细胞培养，后者具有琉水性，适合巨噬细胞和转化
细胞培养。聚四氟乙烯透气性好，还可制成薄膜，剪成小块后能置入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，便
于取出、染色和做电镜切片。塑料瓶皿用后，必要时尚可重用；用水冲洗干净，如有残余细胞附着牢固，
可用胰蛋白酶消化去除，凉干包装后，射线消毒，但仅限一两次，使用次数过多，易出划痕和破坏疏水性。
一次性塑料为理想的培养器皿。随经济条件改善，有日趋普遍应用和取代其它培养器皿之趋势。

(三)微裁体
这是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞。

(四)饲细胞(Feeder Cells)
饲细胞也称滋养细胞，可用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增
殖能力但尚存活和有代谢活动。令其作为底物，将其它细胞接种于其上；饲细胞的代谢产物利于其它细胞
生长，从而被称为饲细胞。饲细胞可用于培养特殊难培养细胞。

20
八、抑制细胞生长因素

在细胞培养过程中，常因制备培养液消毒不彻底或操作不慎等，使一些有毒物质或微生物混入细胞生
存环境中，能抑制细胞生存和生长。r 球蛋白成分可能含有与培养物发生交叉反应的抗体。血清灭活处理
能除去其中补体和降低免疫球蛋白的毒性，并不损伤多肽生长因子，但可能消灭另一些更有用的成分，因
此有人认为灭活血清不一定比未灭活血清更好。

九、细胞代谢和调控

细胞的两个基本生活过程物质合成和机能活动都需要能量。能量来源和体内一样，也是借助于糖和脂
肪的氧化。在大部分的氧化过程中，并无氧直接参加，主要赖于脱氢形式，直到最后氢才与氧结合形成
H2O，产生能量并贮存于高能磷酸键中。高能磷酸键分解后再释放出大量的能供细胞各种活动之需。

(一)糖代谢
生物体内主要有两种释能系统，即无氧酵解和三羧酸循环。前者由葡萄糖转变为乳酸时，并无氧参加，
但也能释放出一些能量；后者由葡萄糖转化为 CO2 和 H20 时，需消耗大量的 O2，但比前者产生的能量多。
。培养细胞糖代谢中，无氧酵解和三羧酸循环两种形式都可存在。前已述及，O2 和 CO 2 是维持细胞生
存所必需的气体。培养液中含有一定量的 CO2，再加上培养瓶空间中的 O2，足够细胞的需要。另外各种细
胞对氧的需要亦不相同，胚胎和成体的某些正常细胞，可赖以无氧酵解而生存，而癌细胞易在培养基中堆
积乳酸和酮体。另外培养细胞有明显的巴斯德效应，即当把培养环境中的 O2 置换成 N2 时，细胞能在无氧
条件下生长。此时葡萄糖转化成乳酸的量大增，在这种情况下，几乎所有葡萄糖都能变成乳酸。而在有氧
条件下，依细胞种类和条件的不同，葡萄糖转变成乳酸的量变动于 5％一 10％范围。有人证明高压氧对胚
胎组织或单层培养细胞都是有害的，而培养成体组织则需较多的氧。另外也有资料提示，葡萄糖氧化的量
与生长中细胞的核酸磷成正比。这也可能说明，细胞内的非主要物质在有氧或无氧条件下皆可合成，至于
像核酸这类成分的合成，在无氧条件下恐难以进行。
CO2 是葡萄糖代谢的最终产物，但它仍可被利用与丙酮酸一起形成草酸重新进入三羧酸循环并起到增
效作用。

(二)蛋白质代谢
有人用鼠心肌细胞实验证明，心肌培养细胞能由苯丙氨酸合成少量酪氨酸，别的细胞则不能。苏氨酸
是很多细胞所必需的，容易由其它氨基酸或葡萄糖合成。很多哺乳动物细胞都需要大量的谷氨酰胺。培养
液中必须含有一定量的必需氨基酸才可维持细胞生存，大多数细胞在有附加氨基酸的条件下长得更好，尤
其在单细胞克隆或细胞量少的情况下，需要氨基酸种类比大片细胞群多。Lookar 和 Eagle(1959)发现，在单
细胞培养时，在培养液中还应含有其它 7 种氨基酸(特别是丝氨酸)，对细胞生长有利。另外培养细胞主要
能利用的是左旋氨基酸，某些右旋非必需氨基酸对细胞可能有抑制作用，而左旋氨基酸过量时对细胞生长
无影响。
有的培养细胞不能利用培养液中某些蛋白质，可能与它们缺少分解这些蛋白质的酶有关；有分解相应
蛋 白 质 的 酶 ， 则 能 利 用 培 养 液 中 的 蛋 白 质 。 细 胞 受 支 原 体 (Mycoplasma) ， 旧 称 类 胸 膜 炎 微 生 物
(Pleuro-Pneumonia-like Organisms：PPLO) 污染时，会出现需要精氨酸异常高的现象，借此亦可测知细胞
可能已受支原体污染。

(三)脂类代谢
培养细胞能从简单的物质如醋酸盐等合成类脂。现尚不明确细胞能否从培养液中直接摄取类脂并加以
贮存；在培养细胞中出现的脂肪，大概都是新合成的。当有些细胞生长状态不良时，在细胞质中常堆积脂
21
肪滴，显微镜下很易观察到。可能为代谢障碍之故。胆固醇是细胞必需物，它能由细胞自己合成。

(四)核酸代谢
核酸是细胞中至关重要的成分，须在有酶的参加下才能在细胞中合成。重新合成嘌呤核苷酸时（图
1-12)，首先是由核糖与磷酸合成 5-磷酸核糖 (R-5-P)，在磷酸核糖焦磷酸酶的催化下，与 ATP 发生作用生
成 1-焦磷酸-5-磷酸核糖 (PRPP)，以后 PRPP
再经过一系列反应而生成一磷酸次黄嘌呤核
苷酸 (IMP)。
IMP 是两个嘌呤核苷酸 AMP 和 GMP 的
前身物；在 IMP 的生成过程中，涉及到在 5-
氨基-4 氨基甲酰咪唑-5’-磷酸核苷 (AICAR)
生成后，要从甲酰四氢叶酸中获得一个甲酰
基，甲酰四氢叶酸的生成可被叶酸拟似物(拮
抗剂)，如氨基喋呤 (Aminopterin：APT)和氨
甲喋呤 (Methotrexate：MTX) 所干扰，从而
能抑制 IMP 的生成。如果上述过程是 IMP 生
成唯一通路的话，则核酸的合成就会被完全抑
制，而导致细胞死亡。但实际上 IMP 也可以
直接从次黄嘌呤(HypoxantNne)借次黄喋吟鸟
嘌 呤 磷 酸核 糖转 移 酶 (Hypothanthine-guanine
Phosphoribosyl Transferase：HGPRT) 而生成。
因此，只要在细胞生存环境中的次黄嘌呤能被利用，即使在 APT 存在的情况下，IMP 仍能被合成，则细
胞仍然可继续生存下去。HGPRT 是漂吟核苦酸合成中的一个应急通路。另外 AMP 亦可借腺嘌呤磷酸核糖
转移酶 (Adenie Phosphoribosyl Transferase：APRT)直接从腺嘌呤生成；在 IMP 受阻情况下，它们也可起缓
解作用。但 HGPRT 和 APR 了两者的特异性，即对作用底物的要求都不强，它们也可把嘌呤拟似物巯基鸟
嘌呤 (Thioguanine)基和杂氮鸟嘌呤（Azaguanine）结合入核酸中，遂能引起对核酸合成的干扰作用；HGPR
了的基因在 x 染色体的长臂上。
在合成嘧啶核苷酸时，首先为谷氨酰胺和二氧化碳在 ATP 作用下，生成氨基甲酰磷酸。氨基甲酰磷酸
与天门冬氨酸经过一系列反应，生成一磷酸尿嘧啶核苷(UMP)。UMP 可氨基化生成一磷酸胞嘧啶核苷
(CMP)，也可还原生成一磷酸尿嘧啶脱氧核糖核苷(dUMP)。dUMP 是一磷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dTMP)
的直接前身物。在这一步反应中，胸腺嘧啶核苷酸合成酶亦需要四氢叶酸，因此也能受氨基喋呤的抑制，
其结果也能导致 DNA 合成受阻。同样 dTMP 亦可借胸腺嘧啶核苷激酶 (Thymidine Kinase：TK) 作用下直
接从胸腺嘧啶核苷生成。在胸腺嘧啶核苷存在的情况下，即使胸腺嘧啶核苷酸合成酶已受氨基喋呤抑制时，
细胞仍能合成 DNA。同样 TK 亦无高度特异性，也能把胸腺嘧啶核苷的拟似物碘脱氧尿嘧啶 (IUDR 或
IUrD) 和溴脱氧尿嘧啶 (BUDR 或 BUrD) 以同样方式结合入 DNA 中。因此 TK 是研究细胞培养的另一个
重要的酶，它可以把用氖标记的胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR) 掺入到 DNA 中，能借以测知 DNA 合成情况；TK
基因位于 17 号染色体长臂上。
上述能受拟似物干扰的核酸合成通路，以及 HGPRT 等缓解系统，是研究细胞融合和杂种细胞筛选的
理论基础。

第四节 体外培养细胞成功率的分析

如何提高细胞在体外培养的成功率，是细胞培养实验工作的首要问题，其中关键在于初代培养。所谓
培养成功，可从两步考虑，第一不论用细胞消化分散法或组织块培养法进行培养时，首先，培养物(包括组
织块或细胞)必须能贴附在底物上，继而细胞才能发生运动、生长增殖、细胞数量增多，它标志着成功率达
22
90％以上或者说已基本成功。第二步是扩大再培养，使细胞数量增多和继续生存。关于第一步中的细节在
初代培养章节将进行详细叙述。这里我们所讨论的是，从全局考虑如何使第一步能获成功的问题；联系前
述培养细胞生物学知识，培养成功与诸多因素有关，但以下三个方面是最为主要的：

一、组织和细胞供体年龄

原则上所有个体都可作为组织细胞的供体，但同样培养物，来自幼年个体比老年者易于培养；来自同
一个体的组织，分化低的组织细胞比分化高的容易培养。又一个培养物中的细胞成分性状是不均一的，即
存在着异质性，表现在分化程度、生物性状、增殖肥能力相对体外培养环境的适应能力不同等。如皮肤组
织培养时，成纤维细胞大多先生长，并能压过表皮细胞的生长；干细胞比非干细胞易生长增殖等。

二、培养条件

不同细胞对培养基需求不同；当前还没有一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。永生性细胞系
和肿瘤细胞系等适应性强，可在各种培养基中生存，如人羊膜 FL 细胞和来自宫颈癌的 HeLa 细胞系适应性
极强，仅用 0.5％水解乳白蛋白加 10％～15％的血清即可生长。而培养正常人上皮细胞尚需很多特殊生长
因子，单细胞克隆需要用条件培养基和 Ham F12 培养基。因此培养特定细胞时，应能了解到该细胞的生物
学性状和特殊需求成分才易获成功；有人用缬氨酸 (Valine) 和毒性抗体培养出肾上皮细胞。

三、贴附底物

不同细胞对附着底物要求不同，表皮细胞适应在胶原层生长。有人用饲细胞层成功培养出乳腺和大肠
上皮细胞。培养贴附型细胞时，第一步需要使细胞能够贴壁，实验证明贴附是细胞增殖生长的条件，细胞
首先能够贴附于底物上才能生长增殖。尤其对初代培养更为重要；一旦成为细胞系后，大多细胞能顺利贴
壁。

四、培养方法

不同消化方法对细胞贴壁和生长增殖有影响，胶原纤维多的组织适用胶原酶消化，上皮细胞适用胰蛋
白酶消化；选择适宜消化法和培养法是培养成功不可忽视的条件。在进行初代培养某一组织时，只有在综
合上述诸条件的基础上，制定出最佳方案进行培养才易获成功。不能用以不变应万变的培养方法工作，当
培养几次失败后，就应及时总结和分析出问题关键并加以改进，才易获得成功。

第五节 建立细胞系或细胞株

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定
的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴
定的细胞 (Certified Cells)。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细
胞系(株)已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。

23
一、体外培养细胞的种类和命名

体外培养细胞的名称。随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株
(Cell Strain)，以后又出现细胞系 (Cell line) 一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。
我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考 Schaeffer，W. I. (1979) 和
国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

(一)初代培养
初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行
传代培养 (Subculture) 的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

(二)细胞系
初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限
细胞系 (Finite Cell Line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称细胞系或无限细胞系 (Infinite Cell
line)。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转
化的细胞系。无限细胞系有的具有永生性 (或不死性)，但仍保留接触抑制和无异体接种致瘤性；有的不仅
有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些
名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，我们对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一
词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传
的 NIH3T3、Rat-1、10T 1/2 等均居这类细胞系。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系 (Subline)。

(三)克隆细胞株
从一个经过生物学鉴定的细胞系，用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，
称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株 (Substrain)。

(四)二倍体细胞
细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同(2n 细胞占 75％或 80％以上)的细
胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞
在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短
各异。人胚肺成纤维细胞可传 50 代±10 代，人胚肾只有 8～10 代，人胚神经胶质细胞 15～30 代；如从老
龄个体取材培养，则细胞生存期更短。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或 2～5 代即大量冻
存作为原种 (Stook Cells)，用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用和延缓细胞的衰老。

(五)遗传缺陷细胞
从有先天遗传缺陷者取材(主要为成纤维细胞)培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传
缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。

(六)肿瘤细胞系或株
是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上
皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。
对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意
义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名
称供参考：

24
 HeLa：为供体患者的姓名(来源于宫颈癌)
CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)
宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974 年 3 月建立
NIH3T3：美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立；每 3 天传代一次，每次接种 3×
5
10 细胞／毫升。

二、建立细胞系(或株)的要求

关于什么样的体外培养细胞群，可被确认为是已被鉴定的细胞(Certified Cells)，国际上也尚无统一的
规定，一般依具体情况而定。在只用作初代培养细胞，只要供体性别、年龄等均一，取材部位及组织种类
等条件稳定，做鉴定的项目无需很多，有几项能说明细胞的相关性状的即可。如能长期保存并可供其它研
究室使用，特别是做反复传代的细胞，习惯上有以下一些要求，并在刊物上报道时应加以说明。

(一)组织来源
应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿
瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。

(二)细胞生物学检测
应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍
增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细跑，应力求证明
细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持恶性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对
正常组织浸润力等实验。

(三)培养条件和方法
各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的
适宜 pH 等。

三、已建立细胞系或核的鉴定、管理和使用

近些年，当一个细胞系或细胞株建成后，我国常通过组织专家开鉴定会的形式子以鉴定，从学术角度
考虑，此举实非必要。按国际惯例，只要研究认真负责地旭有关资料在杂志或刊物上报道，详细介绍上述
各项目即可。
以前因未建立统一的细胞库时，对已建立的细胞系(株)多由作者单位自行保管，有浪费人力、交流使
用不便、细胞易污染和丢失等弊病。我国已初建成小规模贮存细胞机构，待获进一步发展，对我国细胞培
养必将有更大促进作用。
国际上美、英和日本等国已建有细胞库；美国已有美国标准细胞库或细胞银行(ATCC)和人遗传突变细
胞库(HGMR)、细胞衰老细胞库(CAR)等，其中 ATCC 不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC 下属有一组
协作实验室和一个由众多专家组成的咨询委员会。ATCC 也是美国国立癌症研究所(NCI)和美国卫生研究所
(NIH)的资源库，尤与 NCI 有密切的关系。ATCC 也是世界卫生组织 WHO 的国际培养细胞文献中心。ATCC
现液氮冻存有 3200 个已经过鉴定的细胞系(1992)，其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞
系；和来自不同物种的近 75 个杂交瘤细胞抹。ATCC 接纳来自世界各国已经鉴定的细胞子以贮存，同时也
向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞(做盈利性研究时收费)。ATCC 接纳入库细胞时，必须
符合其入库标准，ATCC 入库细胞要求检测项目如下：
培养简历：组织来源日期、物种、组织起源态、细胞已传代数等
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 冻 存 液：培养基和防冻液名称
性别、年龄、供体正常或异常健康状
细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性
培 养 液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)
细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等
核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无
无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等
血清来源和含量
物种检测：检测同功酶，主要为 G6PD 和 LDH，以证明细胞有否交叉污染
免疫检测：一两种血清学检测
细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名
以上为 ATCC 入库基本要求：杂交瘤入库标准尚有所不同，详细情况请参阅 ATCC 的“Catalogue of Cell
Lines and Hybridomas”。

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