第四章 基本培养技术

第一节 组织培养的基本操作和培养技术

组织培养技术发展至今，从培养对象来说，人体内的组织和细胞几乎无一不能培养。但由于细胞的
分化所导致组织和细胞的相互差异，各种组织细胞皆有着不同的生物学个性，反映在对体外培养条件上各
有着不同的要求。因此在培养技术上，培养不同组织细胞需用不同的培养方法。也即培养任何一种组织细
胞都需使用相应的特殊技术，故培养技术方法数量很多。
当前虽然尚无一种能培养各种细胞的万能方法，然而细胞毕竟存在着共性和共同的需求条件，培养
方法虽多，就其基本方法而言却大同小异。各种不同的培养技术方法也都是在此基础上产生和衍化的。差
别主要在一些技术细节和个别细胞所需各自培养液稍异而已。
我们重点在于介绍基本培养方法、要领和原理等；只要熟悉了这些基本内容，以它们为基础，其它皆
不难掌握。其次也尽可能地多介绍一些有代表性的个别组织细胞的具体培养方法，以满足更广大实验人员
的需要。

一、培养操作基本要领和要求

(一)无菌操作
防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要
努力做到最大限度的无菌。

(二)培养前准备
为了做好培养前准备工作，宜制定出分门别类的操作卡片，包括操作程序(Protacol 或 Procedurc)卡片；
如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求
及数量等，这对初学者尤为重要。这样做的好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放
置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全在往返拿取时增加污染机会。
1．操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用 30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒 20 一 30 分钟即
可；操作室空间大，需消毒 30～50 分钟。净化工作台亦可设紫外线灯，主要用于消毒台面上用品，但对
台面流动的空气无意义。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射
线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射
线，会降低消毒效果。
2．洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定
要清洗到肘部。可用软塑料瓶内盛 75％酒精，瓶口插一弯管，右手捏出三五毫升入左手内，进行擦洗消毒
极为简便；必要时亦可用 0.2％的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作
帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。
3．火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如
安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因
吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而
红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用 96％的不含

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杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。如用煤气灯，要有空气输入口以保证燃烧充分。

(三)培养操作
进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已
消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。为便于拿送用品，工作
台面上的用品要有合理的布局；原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中
央(图 5-1)。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，
培养液在末用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。培养用瓶开瓶以后，皆应
保持 45 度斜位或平放，开
口向上长时间直立可增加
落菌机会。吸取营养液、
BSS、细胞悬液及其它各
种用液时，均应分别使用
吸管，不能混用，以防扩
大污染或导致细胞交叉污
染。工作中不能面向操作
野讲话或咳嗽，以免唾沫
把细菌或支原体带入工作
台面发生污染。

二、基本培养操作技术

(一)材料
从理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可进行培养。实际上幼体组织尤其是胚胎组织比年老
个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。在无
特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把
组织切成 1 立方厘米左右的小块，置于培养液中，4℃贮存；存放时间不宜超过 24 小时，放置时间过长或
组织块太大，细胞仍易坏死。从体内取材时，应严格保持无菌，防止受到任何污染，也要避免受到紫外线
照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用
含 500 ~ 1000 单位／毫升的青、链霉素 BSS 液，漂洗 5 ~ 10 分钟后再做培养处理。
外科手术取材时，预先把消毒好的平皿送入手术室备用。手术时取一定量组织，置入皿中，立即送培
养室进行培养。
注意：要详细记录被取组织个体各种情况和组织种类等。
1．取鸡胚组织(见图 3-1)： 鸡胚组织是组织培养最早被利用的对象，早年组织培养工作者如 Carrel
等曾用鸡胚做过大量研究工作。使用鸡胚时，一般应自行孵育，方法与前述取鸡胎汁法相同。
2．取鼠胚组织(图 5-2)：自从应用合成培养基以来，小鼠组织已成为常用培养材料，其优点是生长效
果好，取材方便，又是与人相近的哺乳动物。小鼠皮毛中易隐藏微生物，且不易消毒，用以下方法取材效
果甚好。用引颈法杀死动物：先用一手捏住鼠颈，另手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直至拉死为止(如
取脑和脊髓等组织宜用其它方法杀死)。然后把整个小鼠浸入盛有 75％酒精的烧杯中，置 2 ~ 3 秒钟后，取
出控掉酒精置入碟皿中。动物虽浸入酒精中，因动物口和肛门紧闭酒精不会进入体内，却能使体表灭菌，
能防止解剖动物时皮毛中赃物飞扬。继之在动物躯干中部用尖剪刀环行切开皮肤，用止血钳分别挟住两侧
皮肤拉向头尾两端，把动物躯体翻包起来，暴露出胸腹部，剖腹取出鼠胚或其它组织，置无菌碟皿中备用。
注意：小鼠在酒精中浸泡时间不能过长，以免酒精从口或其它孔道侵入体内影响组织活性。另在操作
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中注意避免让酒精沾染组织。
3．取皮肤： 人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切
取 l ~ 2cm2 皮肤，即满足培养要求。当需要特定个体材料时，可自行取材。取皮肤时可在上臂和大腿内侧
等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用 75％酒精擦拭消毒 2 ~ 3 次(勿用碘酒)。取材方法可按如下两种方
法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内 2 毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下
方，切下直径 2 ~ 3 毫米小片，深度以创面微见血迹为度；或用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起
的皮肤表面，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。这样取材难免带一些真皮组织，必要时亦
可用外科刮皮刀刮取，操作需在手术室进行，可能稍出
血；如取皮厚度适宜，术后包扎好伤口，恢复很快，并
不致留显著短痕。刮皮刀取皮优点是表皮细胞多，培养
易成功。
4．取体液：血液白细胞是常用的培养材料，一般多
用静脉取血法。显示染色体多用微量血短期淋巴细胞培
养法，可用常规法从静脉抽血，亦可从耳垂或指尖取血。
从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口
恢复很快不易感染。从手指取 2 ~ 3 滴血即够一次培养，
血用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素等抗
凝剂；加入抗凝剂的量以量最小又不失抗凝效果为好。
抗凝剂量过小无抗凝作用，量大时易导致溶血。肝素常
用浓度为 20u／ml，抽血前夫用 500u 肝素／m1(生理盐
水配制)湿润针管后推出的方法亦可。吸出血后拔掉针头，
立即把血注入无菌容器中备用。取骨髓组织、羊水、胸
水和腹水可委托临床有关科室，按不同手术规程取材。

(二)组织的分离
从体内取出的各种组织均由众多细胞和纤维成分组
成，而且结合十分紧密。一般体积大于 1mm3 的组织块置
于培养瓶中后，处于周边的少量细胞即可能生存和生长
增殖，但大部分中心的细胞可因营养穿透有限而代谢不
良，且受纤维成分束缚而难以移出。为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出
来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。分散组织的方法有机械法和化学
法两种；根据组织种类和培养要求，宜采用相应的手段。
1．离心分离法：
如培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用低速 500 ~ 1000 转／
分速度，离心 5 ~ 10 分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压
挤细胞使之受损或死亡。微量全血法淋巴细胞培养时，可不必进行淋巴细胞分离，可采用全血培养法。在
需用大量白细胞进行培养情况下，才应采用特殊分离技术如使用分层液等方法。
国产淋巴细胞分层液 (Lyphocyte Separation Medium) 效果很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类
细胞相互分开的。红细胞比重 1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为 1.070；分层液适用于分离血中淋
巴细胞。
(1)取抗凝血若干毫升；
(2)按 1:1 加入无菌分层液(滤过除菌)后，800 ~ 1000 转离心；
(3)无菌分离出白细胞(白细胞位于红细胞上层，呈微白色)；
(4)BSS 漂洗 1 ~ 2 次，可用于培养或其它实验。

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 注意：如用动物血(如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为 l.080 左右，需用相应比重的
分层液。
2．机械分散法(图 5-3)：
(1)切割分离法：在进行组织块培养时，可采用剪切法，一般多剪切成 1 mm3 大小的块。具体操作如下：
无菌切取 1 cm3 组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪(剪柄较长为
好)伸入容器中，反复剪切组织至 1mm3 大小为止(成糊状)。然后用吸管吸取 Hanks 液把附着在剪刀上的组
织小块冲下，并再补加 3 ~ 5 毫升 Hanks 液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、余下
组织块即可用于培养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。另外，亦可用手术刀反复切
割法，把组织块放在凹窝玻璃中，两手各持尖手术刀一把，交错反复切割至 1mm3 为止(图 5-3)。手术刀切
割法对组织损伤较小，但在空气中暴露时间较长，污染机会大些。以上两方法都适用于组织块培养法。
(2)机械分散法：某些软组织如脑、胚胎以及一些肿瘤组织等，可采用机械法进行分散。常用者有两种，
一是把组织放入注射器针管中压挤法，二是把组织置于不锈钢纱网中用钝物压取法。不论用那一种方法，
都应把组织块先剪成小块后再处理。其中以压取法较多用，其程序如下：

注意：机械纱网压挤滤过法简便易行，节省时间，但对组织可能有一定损伤。纱网网眼愈小，所需压
力越大，组织受损越重，故本法仅适用于处理软组织，对较硬组织和纤维性组织效果不好。
3．消化分离法：
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后
使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容
易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。
(1) 胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶是广泛应用的消化物。注意胰蛋白酶一词和胰酶不同。胰酶是广义词，
属胰酶的除胰蛋白酶外，还有胰淀粉酶和胰脂肪酶。
胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代
细胞也非常好。用于消化纤维性组织或较硬的癌组织则较差。Ca2+和 Mg2+ 对胰蛋白酶的活性有一定抑制
作用，故需用不含这些离子的 BSS 配制。血清有抑制胰蛋白酶活性的作用，因此在做细胞传代时，用胰蛋
白酶消化细胞后，可不必再用 Hanks 液冲洗，直接加入含有血清的培养液进行培养即可。残留的微量胰蛋

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白酶即被血清抑活，对细胞没有什么影响。
胰蛋白酶的消化作用，与 pH、温度、组织块的大小、组织的硬度以及胰蛋白酶的浓度都有关系。胰
蛋白酶应用浓度在 0.01 ~ 0.5％范围：常用 0.25％浓度，37℃温度，消化 5 立方毫米大小的胚胎类软组织，
20 ~ 30 分钟即可。组织块大或成体较硬组织，可延长至数小时。当置于 4℃时，仍有缓慢消化作用，消化
时间可延长 12 ~ 20 小时。浓度过大或消化时问太长，细胞可被消化掉；但消化不充分也达不到分散细胞
的目的。pH8 ~ 9 较好。因此在新条件下使用胰蛋白酶时、开始可做些试探，以确定出最佳参数。使用胰
蛋白酶消化细胞法如下：
[用品]：新鲜组织、Hanks 液、培养液、0.25％的胰蛋白酶、三角烧瓶、吸管。
[程序]：
1. 剪切：把组织剪切成 3～5 立方毫米的小块；
2. 加液：把组织置入三角烧瓶中(瓶内有铁蕊的搅棒或玻璃小球)，注入比组织量多 30 ~ 50 倍的 0.25％
的胰蛋白酶(预加温至 37℃)；
3. 消化：置电磁搅拌器台上，消化 30 ~ 60 分钟，或置于 37℃水浴中，或放于 37℃温箱中；在两种情
况下，每隔 5 ~ 10 分钟摇动一次。如需长时间消化时，中间可更换一次消化液，然后静置三角烧瓶，
过 10 分钟，待组织下沉后，吸除 2／3 上清液，余 1／3，再补加新胰蛋白酶液，继续消化；
4. 消化完毕，倒入离心管中，800 转／分离心 6 ~ 8 分钟后吸除上清液；
5. 用 Hanks 液漂洗 2 ~ 3 分钟，离心去上清，共两次；
6. 800 转／分离心 5 分钟后去上清，加入一定量的营养液，通过 100 微米／网眼的尼龙网或不锈钢纱网
滤过，以除掉末充分消化的较大块组织；如消化彻底可不过滤。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载物
片上观察，如细胞分散良好、形态完整、即可用于培养。滤过时用 3 ~ 4 层无菌纱布亦可。
注意：在 37℃温度下用胰蛋白酶长时间(1
小时以上)消化纤维性组织时，组织块表层细
胞可随时从纤维网架中脱落下来。因此每隔
20 ~ 30 分钟，需用不锈钢网(20 ~ 50 微米)滤
过一次，离心，收集这些细胞，以免它们被消
化过度受破坏。如系冷消化，在从 4℃中取出
后，亦应先滤过一次，离心，除上清，收集已
游离下来的细胞；再向消化容器中补足新胰蛋
白酶液，并再重置入 37℃温箱中，继续温消
化剩余组织 20 ~ 30 分钟，这样可能效果更好。
上述方法主要适用于消化大量组织的初代培
养法(见初代培养法图)；如消化传代培养细胞，
多与 EDTA 混合应用(后述)。
(2)胶原酶 (Collagenase) 消化法：胶原酶
是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的
消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以
及癌组织等。上皮细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的消化作用，可使上皮细胞与
胶原成分脱离而不受伤害，效果甚好。此酶在钙和镁离子存在情况下仍有活性，故可用 BSS 和含有血清的
培养液配制。常用剂量：最终浓度 200U／m1 或 0.1 ~ 0.3mg／m1。此酶消化作用缓和，且无须机械振荡，
胶原酶法消化过程如下：
[用品]: 25cm 培养瓶、离心管、 胶原酶(2,000U／m1)干液
[程序]:
(1) 把漂洗干净的组织剪切成 1 ~ 5mm3 的块，向每一培养瓶中置入若干块；
(2) 向每瓶中加入 4.5m1 培养液，再注入 5ml 粗胶原酶，使最终浓度为 200U／m1，pH6.5；
(3) 置 36.5℃中 4 ~ 48 小时；如消化缓慢可延长到 3 ~ 5 天，期间无需摇动；可换液 1 次(仍含有胶原

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 酶)；
(4) 检查消化效应可用轻轻摇动培养瓶的方法：如见组织块已变软，散于瓶底，振荡后即散成细胞团
和单个细胞，此时可轻轻倒出培养液，瓶内可能有很多巨噬细胞已附于瓶底，借此能把巨噬细胞
从其它细胞中分开，可用于单独培养或不用弃之；
(5) 低速离心培养液 5 分钟后，去上清，重悬于 BSS 中，再低速离心 5 分钟，去上清；
(6) 加入新培养液制备成细胞悬液，可接种进行培养；
胰蛋白酶和胶原酶消化时间
与浓度上的差异，依消化温度而
异，另外两种酶也可协同应用，浓
度为：胰蛋白酶 0.1mg + 胶原酶
0.25mg／ml。两酶相比的差别见
表 5-1 和 5-2。
经过胶原酶消化后的上皮组
织，由于上皮细胞对酶有耐受性，
可能有一些上皮细胞团尚未被完
全消化开。成小团的上皮细胞比分
散的单个上皮细胞更易生长，因此
不必要再做进一步消化处理。胶原
酶与胰蛋白酶并用时，尚可外加透
明质酸酶。透明质酸酶对细胞表面
糖基有作用。胶原酶与胰蛋白酶两
者结合使用，对分散大鼠和兔肝等
组织非常有效。
除上述两种最常用的消化酶
外，其它有消化作用的酶还很多，
如链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶
等，可根据各种酶作用的特点和组
织成分的不同分别选用。
(3) EDTA 消化法：EDTA 是一种非酶性消化物，常用不合 Ca2+和 Mg2+的 BSS 配成 0.02％的工作液。
关于 EDTA 的作用机制一般认为是：一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要 Ca2+和 Mg2+才能维持组
织的完整性。EDTA 能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进细胞相互分离。
EDTA 作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织(传代细胞可单用)，如与胰蛋白酶按不同比
例相混合并用，消化作用更好。EDTA 最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶混合使用 (1：1 或 2：1)。用
ETDA 和胰蛋白酶混合消化法传代的过程如下：
(1) 吸出培养瓶内营养液，注入 EDTA(0.02％)和胰蛋白酶(0.25％)混合液(1：1)，注入量以能覆盖细胞
为度，置 37℃温箱或室温中作用 3 ~ 5 分钟。在消化过程中，要在镜下随时监视细胞状态，当见到细胞胞
质回缩，胞体趋于变圆；细胞相互间缝隙变大时，便立即终止消化。细胞上述变化在已连接成片的细胞最
为明显；可见细胞由于胞质回缩，而相互分离，遂失去原来紧密接触关系，出现明显可见的缝隙。如消化
过度则细胞能完全从瓶壁脱落，这时需要做离心分离以防细胞丢失，增加了麻烦；
(2) 吸出消化液，注入适量 Hanks 液洗一二次（可不洗 ）；注意注入时要缓慢，不要让液体直接冲刷
细胞多的部位，朝向瓶底或瓶角部为好，以避免把细胞从瓶壁上冲下来，然后手持培养瓶轻轻晃动，让
Hanks 液体在细胞面上来回流动，以洗掉残余的消化液，不要用力过猛，否则能把附着不牢的细胞冲掉，
减少细胞数量；
(3) 吸出 Hanks 液，加入适量培养液后，用吸管吸、吹营养液，反复轻轻吹打瓶壁上细胞，使之脱落
入培养液中形成细胞悬液。

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 注意：使用 EDTA 处理细胞后，因血清对其无中和作用，可用 Hanks 液冲洗净，因残留在培养液中的
EDTA 对细胞能产生不良作用。

(三) 细胞计数法(图 5-4)

细胞悬液制备后，需要计算悬液中所含细胞数量；一般以细胞数/毫升表示。因只有健康的细胞才有活
力，接种后能够生长增殖，所以在接种前应先检查一下细胞的活力，具体方法如下：
[用品]: 细胞悬液 5.0m1、培养液、0.4％的台酚蓝(Trypan Blue，又称锥虫蓝) 、吸管、75％酒精
[程序]：
（1）计数板：用 96％酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片
一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台
面少许，以便滴加细胞悬液；
（2）染色：取吸管 1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞
重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液
9 滴，再滴入台酚蓝染液 l 滴，混匀，置 2 ~ 3 分钟；
（3）加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴 1 ~
2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；
（4）镜检：镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着
色，凡着色细胞均为不健康者。计算四角大方格内的细胞数，如图
5-4 所示；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内
(即仅计算压两个边的细胞)，然后按下公式计算：

（5）接种培养：通过计数测知悬液中细胞数后，可根据实验所需细胞数
量向培养容器中接种。细胞接种数量随实验目的、血清含量和细胞
生物性状而定；一般接种量在 1 ~ 10 × 105 细胞／毫升范围，实验
周期短，希望细胞增殖较快时，接种量可大些。用含血清量大的培
养液培养胚胎来源细胞、无限细胞系和恶性细胞系时，细胞接种数
量不宜太大。
注意：
① 向计算板中滴细胞悬液时要干净利落，勿令液面盖过盖片，加量要
适当，过多易使盖片漂移，过少易出现气泡；不理想时应重做；
② 镜下计数时，偶见有由两个以上组成的细胞团，应按单个细胞数计
算，如细胞团数占 10％以上，说明消化不充分；或细胞数少于 200
个／100mm3 或多于 500 个／mm3 时，均说明稀释不当，需重新制备
细胞悬液，再重计数；
③ 经常使用同一细胞在相同条件下工作时，对各种情况已做到心中有数情况下，可略去某些环节，
如染色检查等；计算板计算细胞数法有一定误差，用作测定细胞生长曲线时，每一样品应重复计
算 4 次，取均值，较为可靠，若有电子细胞计数仪器当然更好；
④ 体外培养细胞在悬液中呈圆形，平均直径 8 ~ 10μm，当被接种到底物上生长时，经过延展后，则
呈扁形，在底物上所占的面积按直径算可达 20 ~ 25 微米，则 1cm2 的底物上可容纳 4 ~ 5 万个这样
的细胞，这是理论上的数值，但在实际应用中，当细胞达到 80％汇合状态时便应做传代处理，因
此细胞数量比上述理论数量少。

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(四) 细胞冻存
细胞一般冻存在液氮中，温度达-196℃，贮存时间几乎是无限的。用时解冻细胞仍能生长增殖，为培
养工作提供了极大的方便。当前已有适用于冻存大量细胞用的自动化冻存装置，但非所有实验室拥有此种
设备，一般实验室仍常用 35 立升液氮罐贮存法。
1．原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生
一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变、蛋白质变性等等，最终导致细胞
死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚矾 (DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，
能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。冻存在-135℃以下低温中，能减少冰晶的
形成。而融化细胞时速度则要快，使之迅速通过最易受损的-5 ~ 0℃以后，细胞活力不受损害，仍能生长增
殖。当前最常用的保护剂仍为甘油和 DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用
范围在 5％ ~ 15％之间，常用 10％。
2．要点: 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法。冻存物距液氮面越近温度越低。标准
的冷冻速度为-1℃ ~ -12℃／分钟，当温度下降达-25℃时，下降速度可增至-5 ~ -10℃／分钟；到-100℃时
则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氯中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则
促冰晶形成。初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物
并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和
冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。各种细胞对冻存速度的要求也不一样；
上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞-2 ~ -3℃／分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太
快。总之在一开始时，下降速度不能超过-10℃／分钟。另外用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，
初代培养细胞用 DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在 20
％ ~ 30％甘油中很好。原则上细胞在液氯中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，
然后再继续冻存。

[程序]
(1) 细胞：选对数生长期细胞；收集细胞 24 小时前换液一次；
(2) 计数：按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达 5×106／ml (如一瓶细胞数量不足则用
两瓶或更多的细胞)，离心去上清，吸入离心管中;
(3) 冻存液：先用培养液 9 分 + DMSO 1 分(或甘油)配成 10％的 DMSO 冻存液；按上法一滴滴加入离
心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬;
(4) 分装：分装入无菌冻存管中，每管加 1.5 毫升细胞悬液；
(5) 封口：拧紧冻存管盖，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察；为安全起见，把安瓴缝

8
 入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，
注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；
(6) 冻存：当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法：从把冻存物悬在液氮罐口
开始算起，按-1℃／分钟速度，在 30 ~ 40 分钟内，下降到液氮面，再停 30 分钟后，直投入液氮中。
注意：① 操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮伤人；
②细胞注入安额中后一定封严，最好使用塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。
4．复苏方法：

[程序]
(1) 从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因末封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅速气化而发生
爆炸(力量有限)，因此应带防护眼镜和手套；
(2) 迅速放入盛有 36 ~ 37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内溶解；
(3) 剪开纱布口袋，取出冻存管，用 70％酒精擦试消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，
装入离心管中，再补加 10ml 培养液，吹打使细胞悬浮；
(4) 低速离心 (500 ~ 1000 转／分) 5 分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心；
(5) 加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。
注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做 1：10 倍或 1：20 倍的稀释 (细胞数／毫升)；一般每
瓶细胞接种浓度为 5×105／m1，因此冻存密度应达到 107／ml，在稀释 20 倍时，仍能保持 5×105／ml 数
量。

(五) 细胞运送
当前培养细胞既可在国内相互寄赠，也可进行国际间的交流，为此要有运输细胞的方法。装运方法有
两种，一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，
适于空运，比较麻烦；另为充液法，比较简便，装运过程如下：
(1) 选生长状态良好的细胞，待达 80％或 90％汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶
的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；
(2) 妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；
(3) 到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置 37℃培养，次日传代。

第二节 常规组织培养法

一、天然培养基组织培养法

天然培养基培养法即应用取自动物体内天然成分培养细胞的方法。它曾是早年组织培养的主要技术。
其中有代表性的方法如悬滴培养法，由于它要求的条件有限，操作简便，对条件较差又想做些组织培养的
尝试者，可作为了解细胞培养发展、原理的练习或示教之用。另外胎汁和血浆等成分有诱导细胞发生分化
作用，对研究分化机制也有一定参考价值。但自 40 年代使用人工合成培养基以来，对现代化的培养室已
无大的应用价值，此不多赘。有兴趣者可参阅鄂征编《组织培养技术》(人民卫生出版社 1988)。
9
二、人工合成培养基组织培养法

合成培养基单细胞培养已成为近代主要的培养方法。

(一) 初代培养法
初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物
性状尚来发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，
在一定程度上能反映体内状态。初代培养所有机能上的改变，主要是表型(Phenotype)上的改变，不一定为
体细胞突变。从理论上讲，人们有可能创造出一种条件，使初代培养细胞恢复体内时的机能，因此初代培
养细胞是研究基因表达的理想系统，采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好；初代培养也是
建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。因此它是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。但也要注意到，初
代培养的组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使培养的是较纯的单一类型的细胞，如上皮或成纤
维细胞，也仍存在着异质性，在分析细胞生物学特性时仍有一定困难。另外由于供体差异及其它一些原因，
细胞生长效果有时也不一致。初代细胞培养主要应用两种手段，
1. 消化培养法(图 5-5)
[用品]

[步骤]
(1) 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台
面，紫外线消毒 20 分钟；注意：组织块、胰蛋白
酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培
养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，
以免受射线影响；开始工作前先洗手、75％酒精
擦拭手至肘部(工作时宜挽上袖口)；
(2) 布局：点燃酒精灯(或煤气灯)，安装吸管帽
(应通过火焰)；
(3) 处理组织：把组织块置入烧杯中，用 Hanks
液漂洗 2 ~ 3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，
可先置于含有青链霉素的混合液中 30 ~ 60 分钟；
(4) 剪切：用眼科剪把组织块切成 2 ~ 3 毫米大小的块 (用手术刀切割亦可)，以便于消化；加入比组织块
总量多 30 ~ 50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；
(5) 消化：或用恒温水浴，或置入 37℃温箱消化均可，消化中每隔 20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温
搅拌器消化更好(消化前瓶中需置一无菌搅棒)；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定
(6) 分离：在消化过程中风消化液发混时，可用吸管吸出少量消化液，在镜下观察，如组织已分散成细
胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过不锈钢筛，滤掉未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化)；
低速(500～1000 转／分)离心消化液 5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用其它酶或 EDTA
10
等消化，需用 Hanks 液洗脱一两次后，再加入培养液)；
(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数
细胞来说，pH 要求在 7.2～7.4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用 NaHCO3 调整；
(8)培养：置入 36.5℃温箱培养；如用 CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易
生霉菌，每次换液时需更换新塞。
评价：合成培养基胰蛋白酶消化培养法，能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中
摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快地长成单层。本法尤适用于培养大量组织，细胞产量高；但用于经
常性小量培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时且易。

第二节 常规组织培养法

一、天然培养基组织培养法
天然培养基培养法即应用取自动物体内天然成分培养细胞的方法。它曾是早年组织培养的主要技术。
其中有代表性的方法如悬滴培养法，由于它要求的条件有限，操作简便，对条件较差又想做些组织培养的
尝试者，可作为了解细胞培养发展、原理的练习或示教之用。另外胎汁和血浆等成分有诱导细胞发生分化
作用，对研究分化机制也有一定参考价值。但自 40 年代使用人工合成培养基以来，对现代化的培养室已
无大的应用价值，此不多赘。

二、人工合成培养基组织培养法
天然培养基如血浆凝块培养法虽比较简单，易使细胞生长，但它有三个严重的缺点：①细胞生长在血
浆纤维蛋白支架中生长层次很多，不便观察和分析细胞性状；②提供的营养成分有限，不便于进行大规模
培养；⑧营养成分不清，难以控制和分析。
40 年代后出现了消化分散细胞法，能把组织分散成单细胞，另外人工合成培养基取代了血浆和胎汁，
可大量使用。合成培养基的成分清楚，便于分析和进行人工调控。细胞生活在这样的培养环境中，可贴附
在底物上生长，能形成单层和进行大量繁殖，且便于观察和分析；合成培养基单细胞培养已成为近代主要
的培养方法。

(一)初代培养法
初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物
性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，
在一定程度上能反映体内状态。初代培养所有机能上的改变，主要是表型(Phenotype)上的改变，不一定
为体细胞突变。从理论上讲，人们有可能创造出一种条件，使初代培养细胞恢复体内时的机能，因此初代
培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好；初代培养也
是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。因此它是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。但也要注意到，
初代培养的组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使培养的是较纯的单一类型的细胞，如上皮或成
纤维细胞，也仍存在着异质性，在分析细胞生物学特性时仍有一定困难。另外由于供体差异及其它一些原
因，细胞生长效果有时也不一致。初代细胞培养主要应用两种手段：

1．消化培养法(图 5-5)：
【用品】
3
取自人或动物体的新鲜组织 1～5cm
Hanks 液 100 ml
11
 胰蛋白酶(O.025％) 50～100 ml
培养液(含血清 10％～20％) 50 ml
吸管(直头)和胶帽 各 10 个
平皿(直径 6 厘米) 4套
培养瓶 若干
烧杯(50 m1) 2个
电磁搅拌器 1个
三角烧瓶(100 m1) 1个
不锈钢筛(20μm、100μm、200μm) 各1个
眼科剪 2把
眼科镊 2个
计数板 1块
【步骤】
(1)准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒 20 分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、
培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线
影响；开始工作前先洗手、75% 酒精擦拭手至肘部；
(2)布局：点燃酒精灯(或煤气灯)，安装吸管帽(应通过火焰)；
(3)处理组织：把组织块置入烧杯中，用 Hanks 液漂洗 2～3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可
先置于含有青链霉素的混合液中 30～60 分钟；
(4)剪切：用眼科剪把组织块切成 2～3 毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；加入比组织
块总量多 30～50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；
(5)消化：或用恒温水浴，或置)k 37~C 温箱消化均可，消化中每隔 20 分钟应摇动一次，如用电磁恒
温搅拌器消化更好(消化前瓶中需置一无菌搅棒)；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定，详细方法
请参阅本章消化分散法一节；
(6)分离：在消化过程中见消化液发混浊时，．可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成
细胞团或单个细胞，立即终止消化， ·随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继
续进行消化)；低速(500～1000 转／分)离心消化液 5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用
其它酶或 EDTA 等消化，需用 Hanks 液洗脱一两次后，再加入培养液)；
(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大
多数细胞来说，pH 要求在 7．2～7．4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用 NaHCO3
调整；
(8)培养：置入 36．5~C 温箱培养；
如用 CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞
或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉
菌，每次换液时需更换新塞。
评价：合成培养基胰蛋白酶消化
培养法，能把组织块分散成细胞团或
单个细胞，便于细胞从培养液中摄取
营养和排出代谢产物，细胞能较快地
长成单层。本法尤适用于培养大量组
织，细胞产量高；但用于经常性小量
培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时
且易污染。

12
2．组织块培养法(图 5-6):
【用品】
3
取自人或动物体的新鲜组织 1～5cm
Hanks 液 100 ml
NaHC03 2 ml
胰蛋白酶(O.025 %) 50～100 ml
培养液(含血清 10％～20％) 50 ml
吸管(弯头和直头)和胶帽 各 10 个
培养瓶 若干
烧杯(20 m1)或青霉素小瓶 各 1 个
眼科剪 2把
眼科镊 2把
【程序】
3
(1)剪切：把组织小块(1cm )置入小烧杯或青霉素小瓶中，用 Hanks 液漂洗 2～3 次以去掉表面血污，吸
3
净 Hanks 液，用眼科剪反复剪切成 lmm 块为止；
(2)摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块
相互距离为 0.5cm 为宜，每一 25ml 培养瓶底可摆布 20～30 块；
(3)轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置 36.5℃温箱 2 小时左
右(勿超过 4 小时)，使小块微干涸；
(4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46 度斜持培养瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入培养液少
许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组织小块附着尚不牢，注
意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。
评价：翻转培养瓶的目的是为使组织块微干涸，以利贴附和免从瓶壁流失，但时间．不宜过长，超过三
四小时以上可能对组织有不利影响。组织块培养法操作简便，顺利情况下，组织小块贴壁培养后 24 小时，
细胞即可从小块边缘向四周游出，通过生长增殖，最终亦可连接成片；原组织小块可完全散成细胞而消失。
如组织块过大，残留小块换液时弃掉或再置另瓶中继续培养。组织块通过反复剪切可能受一定损伤，并非
每块组织都有生长能力，但只要有一部分能生长往往即可形成单层。

3．初代培养意义的讨论：
组织初代培养是后续培养的关键阶段。初代培养成功与组织污染与否、供体年龄、培养操作技术和方法、
适宜培养基的选择等多种因素有关(详见第一章第四节所述)。
初代培养是各种培养必经阶段；总的看，对某一组织进行初代培养时，在未掌握规律和找到适宜培养
条件之前，一是比较困难的。一旦成功和能进行传代培养成为细胞系后，细胞则较易生存。但传代后的细
胞也并非总是一帆风顺，有时生长一段时间，未达终极期便衰退死亡，说明培养环境仍不理想。初代培养
细胞刚离开机体，生物学性状与原体内细胞比较接近，适用于做药物检测等实验。

(二)传代培养法(图 5-7)
当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离
培养。这一操作称传代或再培养。如拖延传代，细胞会因增殖过度，培养基营养枯竭和代谢产物积累而发
生中毒。80% 汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。细胞传代方法如下：
【材料】
80% 或接近汇合成片细胞 若干瓶
Hanks 液 100.0 ml
0.25％胰蛋白酶液 + O.02％EDTA(1:1) 20.O ml
培养液 50.0 ml
13
 吸管 5支
培养瓶 数个

图 5-6 消化法传代培养步骤
【程序】
(1)吸除培养瓶内旧培养液；
(2)向瓶内加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少许，以能覆满瓶底为限；
(3)置温箱中 2～5 分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，
细胞间隙增大后，立即终止消化；
(4)吸除消化液，向瓶内注入 Hanks 液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉；注意加 Hanks 液
冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失；如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，
可不用 Hanks 液冲洗，直接加入培养液；
(5)用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免
伤害细胞；
(6)计数板计数后(如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培
养。
注意：传代是细胞培养中经常性操作，有三点注意事项：①把握好传代时机，已如前述，在 80%～90%
汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。②二是消化时间要适度，过短细胞不易从
瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。③三是消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消
化时间短，掌握不好，细胞易流失。另外各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所
用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细
胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。消化传代良好时，细胞受损害少，
细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。

第三节 特殊培养法

一、二倍体细胞培养法(Diploid Cell Culture)

所谓二倍体细胞培养，是培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法。关于二倍体细胞的概念在
培养细胞生物学性状章节已述及；因其与体内细胞相似性大，在实验中有很大应用价值。

(一)要点
二倍体细胞来源体内二倍体细胞，也即正常细胞的初代培养。初代培养细胞成功后能始终保持二倍体
细胞性状，便成为二倍体细胞培养。二倍体细胞虽不难培养，但欲求长期呈旺盛地增殖生长、并保持二倍
体细胞性状，亦非易事。为此必须采取一些有效的措施，一是低温冻存，二是妥善的培养方法。用反复传
14
代的方法以求获得大量细胞和维持细胞长期生存的办法是不妥的。因在反复传代中，难免由于培养条件的
变化和其它不利影响，使细胞生物学性状发生变化。随时间延长不仅能导致细胞停止生长，并可失掉二
倍体性状或发生转化．
采取以下措施可能利于二倍体细胞培养：①严格控制 pH 值，最好在 5％ CO2 温箱中培养；②换液时间
不要间隔太长，且不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉 1/2 或 2/3 为妥；③传代期不能过长，
不能让细胞长得过于密集，一旦细胞接近或刚刚连接成片，即进行传代；④要选用高质量的培养基和血清，
并尽量维持不变，每次传代都按一分为二的原则(细胞数量、营养液量、培养瓶的空间和面积都一样)进行
培养；⑤传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存。
来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂 50 次左右即进入衰退期。不同种类和来源的二倍体细胞生
存期都不一样，但生存期皆有限。虽然二倍体细胞具有限的生存期，却完全能满足反复使用的要求。以成
2
纤维细胞为例，即便从初代接种 1 个细胞算起，按产生的细胞数=n×2 (n：接种细胞数)计算，它所提供的
细胞也近天文数字。而在实际应用上，初代接种的细胞都几十万以上，因此一个二倍体细胞系最终提供的
细胞数量近于无限的。

(二)方法
二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：
(1)吸除旧培养液注入另瓶中；
(2)用温 BSS 冲洗 1 次；
(3)用 O.25％温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用 1～5 分钟；
(4)待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失，可不必再用 BSS
冲洗，直接向瓶中加入培养液(新旧培养液按 2:1 新旧混合)；
(5)轻轻反复吹打制成单个细胞悬液(消化不足或吹打不充分，易形成细胞团，不利于生长，应注意避
免)；
(6)按一分为二比例接种培养。
讨论：如何能保留有大量可利用的二倍体细
胞?首先在初代二倍体细胞培养时，要接种多量细
胞；生长成功后立即冻存做为种细胞(Stock)。用
于实验时，解冻 1 分 Stock，传 1～3 代，按右式
处理，二倍体细胞是可长期应用的。

二、加支持物培养法
加支持物培养法是预先向培养容器中加入
各种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方
法．待细胞贴附于支持物生长增殖后，可进行
各种实验和观察。观察时可把支持物从瓶中抽
出，能做各种技术处理，是研究工作中常用的方法之一。各种对细胞无毒性的如玻璃、塑料、鸡卵壳
膜、胶原、硅橡胶、袋泡茶包装纸等，均可做支持物用。

1．支持物制备
特制有机玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等：其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用。前者便于做各种固定、
染色处理和观察；后者最适做电镜技术，允许做包埋和切片。加支持物培养法程序与一般培养法相同，只
是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。
特氟隆薄膜为定型无菌包装产品，用时无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培
养接种细胞前，先置入培养容器中即可。通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形
15
态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡 24 小时→96％酒精 30～60 分钟→蒸馏水浸泡
30～60 分钟→用干净软布擦拭干净(擦时应戴白手套工作)→装入培养器皿中→高压或干热灭菌备用。

2．培养法：
初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间
取出支持物，做各种观察或实验。支持物培养法中最重要的是支持物一定要处理干净，不残留任何对细胞
有害成分，以免不利细胞贴附和生长增殖。

三、单细胞分离(克隆)培养
单细胞分离培养又称细胞克隆(Cell cloning)，即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新
繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。初代培养细胞或其它未经细胞克隆化的细胞系都具有异质性，细胞
经过克隆以后，后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，即形成所谓纯系，称细胞株(Cell Strain)。细胞
株的细胞遗传性状差异减少，生物性质均一，利于实验研究。

1．原理：
从理论上说各种培养细胞都可用以进行克隆培养。但实际上，初代培养细胞和有限细胞系(二倍体细
胞)比较困难。无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易。其原因是，当体内任何细胞被置于体
外培养后，对培养环境都有一个适应过程，期间细胞对营养液具有同化作用，即从培养液中摄取营养的同
时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物，也有促细胞生长物质。有人称之为
化学信使，具有促克隆细胞生长作用，实则为生长因子类物质。单细胞同化营养液能力不如群体细胞强；
初代培养细胞、有限细胞系(--倍体细胞)不如无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞强。转化细胞和肿瘤细胞
强的原因，可能与它们有自泌(Autocrine)和内泌(Endocrine)，即自己合成生长因子能力有关。凡对培养
环境有较大适应性和具有较强独立生存能力的细胞，均易做细胞克隆。克隆细胞时，要把细胞先制备成单
细胞悬液，再接种培养在底物上，让细胞单独生长。适应性较大和活力好的细胞能增殖形成细胞小群
(Colony)克隆。细胞群单个细胞形成克隆的百分数称克隆形成率或克隆率(Cloning Efficiency)，也称接
种率(Seeding Efficiency)。两词都可用于表示细胞生活力和独立生长能力，但克隆形成率含义比接种率
更为确切。

2．提高克隆形成率的措施
细胞经过稀释后，在低密度状态下培养时，克隆形成率明显下降，即克隆形成率与细胞的密度成正比。
对无限细胞系来说尚无严重影响，它们的克隆形成率一般很少降到 10% 以下。但初代培养细胞和有限细胞
系的克隆形成率则很低，仅有 0.5%～5%，甚至为零。因此必须提高细胞克隆形成率才易克隆成功，为此常
采取以下一些措施：
【培养基】：为提高细胞克隆形成率，选择适当的培养基是非常重要的环节，现知以下一些培养基用
作克隆时效果可能较好(表 5-3)。

16
 表 5-3 常用细胞克隆培养基

以上培养基都是个别研究者选用的，难免有一定的局限性。事实上分散于各实验室的同一种细胞，经
过长期培养后，难免发生一些适应性变化。因此同一种培养基也不一定能适用于不同条件下的同类细胞。
在克隆细胞中，最简易和行之有效的方法是使用适应性培养基或条件培养基(Conditional Medium)，
它是一种不含有细胞而已经被细胞生活过或同化过的培养基。其制备方法是：
(1)培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞)至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养 24～48 小
时后，吸出所有培养液；
(2)离心：3000～4000/分离心 10 分钟后，吸取上清液；
(3)滤过：再经直径 O.22μm 滤孔的滤膜过滤。低温冻存贮备用；用时取 1 分适应培养基 + 2 分培养
基混合使用。
注意：分离适应性培养基时一定要利用处于指数增生期时的细胞。因此时的细胞生长最旺盛，机能活
跃，向周围环境释放促生长的物质最多，培养液中营养成分又未被耗尽，是分离制备的最好时刻。刚分离
后的适应性培养基中可能含有少量细胞，一定要通过离心和滤过排除干净，以免形成假克隆。
【血清】以胎牛血清为上，小牛血清和马血清次之；用时应先做克隆形成率试验，选最佳者用之；血
清需做灭活处理。
【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作
克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞受射线照射或丝裂霉素 C 作用后，便失去分裂能力．但仍然生存并有
同化营养液的能力。当被用作克隆的细胞散落在饲细胞上层与之接触后，饲细胞能促克隆细胞的生长，利
于克隆的形成；克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。制备过程如下：
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(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90% 汇合时制成细胞悬液，再按 10 细胞/毫升重新接种
培养；
5
(2)在细胞半汇合时，准备 0.25μg/ml 的丝裂霉素 C(Mitomycine C)，按 2ug/10 细胞的量加入到培养
瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量 30～50 戈瑞(Gy)；
(3)细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换培养液、再培养 24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬
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液，按 5×10 /ml(10 细胞/cm )接种入新培养基中；
(4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。
讨论：(3)项可略去，即细胞受照射后，再培养 24～48 小时，便可作饲细胞之用。饲细胞制备后三周
内即死亡．应及时应用(做饲细胞时避免用同源细胞)。因饲细胞制备繁锁，在应用多孔培养板克隆细胞后，

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已少有人再用饲细胞进行克隆细胞；但作为底物，用以培养其它难培养的细胞尚有其应用价值。
【激素】1～10 u(国际单位)/ml 营养液的胰岛素能促进很多细胞克隆的形成。地塞米松也有能提高人
正常胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞、黑色素瘤细胞等的克隆形成率。
【CO2】CO2 对绝大多数细胞克隆形成率都有提高作用，常用 5%浓度。对有的细胞，如人的成纤维细胞
和胶质细胞克隆时，2% 的 CO2 效果可能更好。HEPES(20mM)与 2% CO2 并用能保护细胞免受 pH 值波动的影响。
如无 CO2 温箱，需用 NaHCO3 调节 pH 维持在 7.2～7.4。
【底物特殊处理】有人证明，用多聚右旋赖氨酸处理培养瓶、培养皿底物后，能提高用低血清培养人
成纤维细胞的克隆形成率，其方法如下：
(1)制备浓度为 lmg/ml 的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底；
(2)倒出多聚赖氨酸液，用 5ml PBS 冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用亦可。
有报道，用培养液配制的浓度为 5ug/ml 的纤粘连素处理底物后亦有类似效应。
【适应性底物】不同细胞喜欢贴附在不同性质的底物上，使用适应性底物利于细胞形成克隆。无限细
胞系易贴附于塑料底物上。初代培养细胞易贴附于胶原层或血浆纤维蛋白层底物上。血浆纤维蛋白层制备
法如下：先制备出含有 0.12 单位凝血酶的培养液 100 毫升；配方为：
(1)纤维蛋白原液：
纤维蛋白原液； 250 mg
NaCl 800 mg
枸橼酸钠 25 mg
玻璃三蒸馏水 1000 ml
滤过法灭菌
(2)向培养皿中先加 l ml 纤维蛋白原液，然后再续加 4ml 含有凝血酶原的培养液，迅速用吸管头充分
混合，数分钟后便凝集形成一层清晰的胶状膜；
(3)再把细胞接种于此膜之上；也可先把细胞加入到含有凝血酶原的培养液中，在加入纤维蛋白原液
后，再让细胞附在胶膜上生长。
另一个简单的底物层是琼脂层，常用浓度为 2%；琼脂层制备后，可把细胞接种在琼脂层上。琼脂中含
有酸性硫酸粘多糖，对大多数细胞生长有一定抑制作用，但对一些病毒转化的细胞和恶性细胞却无大影响。
琼脂的这种选择性作用，一是很多细胞难以贴附，二是其中含有抑制的多聚阴离子，不利正常细胞生长。
琼脂经降低毒性处理，特别是减少多聚阴离子后的产物即为琼脂糖(Agarose)。琼脂糖可用作克隆不能在
琼脂中生长(因毒性)的贴附依赖性细胞。实验证明，恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂(1.2%)的生长与在
裸鼠体上的致瘤性有很大一致性。因此测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性性的重要
指标，有关软琼脂测试法请参考肿瘤细胞生物学检测一节。不同的底物适应于不同细胞的要求(表 5-4)。
表 5-4 不同底物的用途

3．多孔塑料培养板单细胞克隆法(图 5-8)：
Saford 的毛细管克隆细胞法是最早的单细胞分离培养技术。其基本过程是：在显微镜窥视下，直接用
毛细玻璃管从细胞悬液中吸取单个细胞，再进一步分离培养形成克隆。本法虽比较精确，但过程较繁琐，
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成功率低，已少采用。除毛细管法外也还有很多其它方法，但自从多孔塑料培养板问世并用于克隆细胞后，
其它法已很少应用。多孔塑料培养板克隆细胞法已成为当前克隆细胞的主要技术，可极大提高细胞克隆的
成功率并且简而易行。
多孔塑料培养板克隆细胞的主要过程是：先制备出 1～2 细胞／毫升低密度的细胞悬悬液(图 5-9)，然
后向多孔塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液 0.5～l ml，则每孔平均含 1 个细胞。镜下检测每孔所含细
胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。
其法如下：
【材料】
健康状态良好的对数增生期细胞
克隆培养基(适应性培养基或 F12 等；含 10%血清) 100.0 ml
胰蛋白酶(O.25 %) 10.0 ml
Hanks 液 100.0 ml
刻度吸管 2支
粗试管 5个
吸管 5个
计数器 1个
多孔塑料培养板(96 孔) 1块
微量加液器(O.1 ml～1 ml) 1个

图 5-9 细胞悬液制备
图 5-8 单细胞克隆
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【程序】
(1)消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液；
(2)低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液：然后稀释
细胞，使之成为 1～2 细胞／毫升悬液；最适宜细胞密度为 1～2 细胞／ml 培养液；
(3)接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加 O.5 毫升；
接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置 CO2 温箱培养；
(4)标记：培养 6～12 小时后，待细胞下沉并贴附于培养板孔底后；从温中取出，置倒置光显微镜台
上，观察和标记下含单个细胞的孔，置 CO2 温箱培养；CO2 箱内含有水槽，以保持箱内湿度。在培养中一般
无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，
以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养 3～4 周。待孔内细胞增 500～600 个时，可
进行分离培养；
(5)分离扩大培养：培养 86～96 小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，
用 Hanks 洗 1～2 次，继加胰蛋白酶少许，加入量以能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置
于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入 O.1ml 含 10 % 血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当
细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置 CO2 温箱中继续培
养、增量，使之形成新的细胞群体后，即转用常规培养法培养。
注意：①观察并挑选孔内确实仅含有一个细胞后，才可进行标记。观察时要特别注意孔底边缘部位，
如细胞落于该处，可能由于直角部折光而观察不清。凡不能确认含一个细胞的孔者，不进行标记，以免发
生假克隆。②标记时要挑选含有缝康细胞的孔(细胞体积适宜，轮廓清晰完整)。⑧亦可接种到其它底物如
碟皿中进行细胞克隆，但细胞易流动和克隆形成后不易分离。如仅为测定细胞克隆形成率，而不做单细胞
分离，仍可用培养皿中培养法。

四、球体细胞培养
各种细胞培养法都有一定的局限性，最多用的单层细胞培养也有不足之处，一是传代时要做消化处理，
对细胞有一定的损伤；体内各种组织细胞获得营养的条件是不一样的，而体外培养的单层细胞与培养液接
触机会却是相同的。也是影响分化因素之一。进行球体培养时，能使培养细胞长成球体形，球体中心部细
胞吸收营养和排出代谢产物要通过外围细胞，周边部细胞却是直接的，两者生存条件不同，与肿瘤组织和
体内上皮组织情况相似，对研究细胞分化很有应用价值。

1．原理：
大多数培养细胞都具有贴附在底物上生长成单县细胞的性质，如细胞长成片之后细胞片与底物脱离，
更换到使细胞不易贴附的底物上继续生长时。则细胞片能卷聚成球体形，成为球体培养。

2．培养方法(图 5-10)
【用品】
细胞：能贴壁生长的细胞都可用于球体培养
试剂和用品：
2% 的琼脂培养基 30.0 ml
O.25% 胰蛋白酶液 10.0 ml
吸管 5支
Hanks 液 100.0 m1
培养液：
． A 液：合成培养液(199 或 1640 等) 20.O ml，小牛血清 10 ml，10% NaHCO3 O.5 ml。以上四液充分
混合后，水浴加温到 60℃。
B 液：4% 的 Bacto 琼脂 20ml，煮沸后冷却到 60℃ 与 A 液相混成琼脂培养液。

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【程序】
(1)琼脂铺底的培养瓶：30ml
无菌培养瓶，每瓶中加 5ml 2%
琼脂培养基，冷却，形成平坦底
层后备用；
(2)取生长状态良好已联接成
片的细胞，用弯头吸管伸入瓶
内，把细胞层纵横割划成若干小
区后，倒出培养液；
(3) 加 入 O.25% 的 胰 蛋 白 酶
液，在倒置显微镜下边消化边观
察，当细胞小区边缘卷起后便立
即终止消化，倒出消化液，用
Hanks 轻 轻 漂 洗 一 次 ( 不 洗 亦
可)，加入新培养液 3～5ml，用
吸管把已松动的细胞片吸打下来；分装入 1～3 个含 2％ 琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，
数日后便可生长成细胞球体； 图 5-10 球体培养
(4)换液：培养 1～2 日后，如
需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补
充新培养液。
注意：消化细胞方法是影响细胞能否集聚成团，形成球的一个重要因素，如用 0.25% 的胰蛋白酶加
O.2% 的 EDTA 消化细胞，虽能把细胞消化成分散的细胞悬液，但接种在任何底物上都不易形成球体，可能
与 EDTA 作用有关。又当细胞尚未连接成片时，消化后也容易形成分散的细胞悬液，同样难以形成球体；
从而细胞片是形成球体生长的一个重要条件。
球体细胞也可和单层细胞混合培养，便于研究两种不同细胞的相互影响。方法是：先做单层培养，待
细胞长成单层细胞后，把 2%琼脂培养液注入瓶内，令其在单层细胞上面形成琼脂层。注意在加琼脂时，要
使琼脂冷却到快要凝固前再注入瓶内，以避免过热损伤细胞。当琼脂凝固后，再把已准备好的另一种细胞
球体培养液接种在上面，便形成琼脂层下为单层细胞，上层为球体细胞的混合培养。下层细胞生活在琼脂
培养液中，既能从琼脂培养液中也能从上层培养液中获取营养；因琼脂的限制却不易与上层球体细胞相混
或干扰，但相互却能发生影响，可借以研究细胞相互关系。

五、微载体细胞培养法
近年细胞生物学发展十分迅速，尤其在与实际结合方面获得了可观的成就，形成了一门新的学科生
物工程学。当前人们已经能够利用培养细胞生产多种单克隆抗体、激素、特殊蛋白质(如生长因子)以及疫
苗等。随之也促进了大规模或超产量细胞培养法的发展。用一般培养法获细胞的产量是有限的，用新的超
产培养技术，可获大量细胞。属这种培养技术的，有微载体培养法、微囊培养法和中空纤维培养法等，这
些培养技术日益增多并受到普遍重视。但这些培养技术主要用于生产性研究机构，一般研究室少用，今仅
就微载体细胞培养法简介如下：

1．原理：
微载体细胞培养开始于 60 年代末期，最早使用离子交换凝胶(DEAE-Sephadex A-50)作为载体，轻微
搅动即可悬浮在培养基中，因而可增加细胞附着的面积，达到大量培养细胞的目的。后来，根据细胞附着
生长的特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞附着和生长。这一方法亦可用
于常规量的培养，也可用于大规模的培养，具有操作简便和不易污染的优点。利用此法已成功地从猴肾细
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胞中生产疱疹病毒疫苗和从培养细胞中生产出人口型干扰素。

2．微载体及其性质：
离子交换剂作为载体存在许多缺点，如在一定程度上对细胞有毒性，对培养基的 pH 也有一定的影响
等，因而对载体进行了改良。目前使用的载体主要有三种类型。它们都是带有不同基团的葡萄糖交联而成
的大分子，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(Cytodex 1，2，3)。
由于微载体所带的基团不同，就决定了它们之间的差异。Ⅰ型整个载体带有正电荷；Ⅱ型仅表面带有
正电荷；Ⅲ型不带有电荷，其外表面被胶原层包裹；胶原是豚鼠皮肤的提取物，同样适于细胞的附着和生
长；它们的物理性质可参看表 5-5：
表 5-5 微载体的物理性质

注；1．均在 O.9%NaCl 溶液中测定。2．d50 表示浓度为 50％；d5~95 表示浓度为 5%～95%

微载体比离子交换剂有明显的优点，首先是其大小和表面性质更适宜细胞生长，而且具有一定的透明
度，便于显微镜观察。它对细胞无毒性，适于各类附着型细胞的生长，尤其对附着性差和存活率低的细胞
更适用；一般Ⅱ、Ⅲ型优于Ⅰ型。

3．微载体细胞培养方法：
用微载体细胞培养的主要问题是选择合适类型的微载体和适宜的搅动速度。三种类型微载体都适宜各类
细胞生长，目的在于如何获得最大量的细胞。另外应注意的是微载体对蛋白有一定的吸附能力，它们吸附
率分别是总蛋白的 4.3%、2.7%、1.1%。所以使用血清的量最好不低于 10%。
【微载体选择】先利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的附着率和计算细胞
数，以得到最大量细胞为佳。通常是绘出生长曲线以比较它们容纳细胞量的大小、微载体的用量和搅动的
速度等。以能完全悬浮在培养基内效果最好。
【水化和消毒】微载体水化过程要用玻璃容器，如有可能使用“硅化”的玻璃容器更好。这是因微载
体颗粒小且轻，细胞吸附到表面后难以洗脱下来。水化时，首先称一定量的微载体放入容器中，按每克微
2+ 2+
载体加 50～100ml 的比例，加入无 Ca 和 Mg 的磷酸缓冲液(PBS)，室温下放置应不少于 3 小时，并不时
轻微搅动，然后再用新鲜 PBS 洗一次(30～50ml／g 干粉)。如用Ⅲ型微载体，在水化作用时，表面不易湿
润而易出现沉淀。因此加入 PBS 后，加数滴吐温 80(2～3 滴／100m1)。
消毒方法可采用高压蒸气消毒(15 磅，15 分钟)。亦可在水化后用 70%酒精浸泡消毒，再用无菌的 PBS
漂洗一二次。微载体在培养基内呈悬浮状态时，才能有效地增加细胞附着面积，可用电磁搅动装置使其悬
浮。一般在 250ml 培养基中，微载体浓度为 3mg/ml 时，搅动速度每分钟 50～70 转效果最好。
【传代培养】在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体
和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新微载上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，
和常规培养相同；先用 EDTA+胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。一般来说，比从玻璃表面分离细
胞困难些，所以要预先用不含血清的培养液或缓冲液冲洗培养物，同时调节}肖化液的 pH(pH7.8～8.O)和
作用温度、时间。
细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静置 5 分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部份

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仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为 100 微米的尼龙网或不
锈钢网过滤后．再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞(图 5-11)。
在许多情况下，如进行显微镜观察、切片染色、冷冻储存
等，可以使细胞脱离微载体，也可用带有细胞的微载体进行。
用微载体培养哺乳动物细胞时，能在短时间内得到大量的活细
胞，如果条件合适，在一周时间内，可获得比原来接种量多数
十倍甚至近百倍的产量，并可节省培养基

六、悬浮培养法
悬浮培养是使贴附性细胞呈悬浮状态生长。如所培养的细
胞本身属悬浮生长类型，则无须做任何处理；在传代时先做离
心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养贴附型细
胞时，因其有贴附性，必须进行干扰使细胞不能贴附，才能形
成悬浮状态生长的细胞。常用方法有二，一是用大培养瓶增加
图 5-11 微载体
含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细
胞不能贴壁而成悬浮培养，为此必须拥有能容纳电磁搅拌器的大型温箱。另一方法是用试管培养细胞，把
试管置入带有悬转鼓的特制温箱中进行培养，悬转鼓不停徐缓转动，干扰细胞贴壁遂成悬浮培养。悬浮培
养允许培养较多量细胞，适于做细胞代谢和生化方面的研究。

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