CROMATOGRAFIA APLICADA ETNOFARMACOLOGIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FRMACOS Erika F. Ferrari1, Natlia M. Ribeiro2, Roberta S.

. Carreiro da Costa1, Rodrigo A. Lazo Osrio1, Milton Beltrame Jr. 2, Wellington Ribeiro1
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Laboratrio de Fisiologia e Farmacodinmica, Laboratrio de Sntese Orgnica Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraba, av. Shishima Hifumi, 2911, Urbanova, So Jos dos Campos/SP, ferrarierika@yahoo.com.br, gton@univap.br

Resumo O uso de produtos naturais com propriedades teraputicas to antigo quanto a civilizao humana. Aproximadamente 25% das drogas prescritas no mundo todo tem sua origem a partir de plantas onde os refinamentos e a introduo de novas tcnicas analticas facilitou extremamente a pesquisa de novos produtos naturais. Atualmente, existem diversas tcnicas para a separao e determinao desses compostos, sendo as principais a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida de alta eficincia, o ultravioleta, a espectroscopia de ressonncia magntica e a espectrometria de massas so ferramentas poderosas para a separao e a determinao da estrutura desses compostos. Essas possibilidades analticas permitem maior rapidez na busca de novas substncias ativas, na obteno de informaes preliminares sobre constituintes em amostras complexas, como os extratos vegetais, e o reconhecimento de molculas j conhecidas. Neste trabalho mostramos o alcance dessas principais tcnicas na pesquisa de novos frmacos, identificao e caracterizao. Palavras-chave: farmacognosia, etnofarmacologia, cromatografia, plantas rea do Conhecimento: Cincias da Sade (Farmcia) Introduo O uso de produtos naturais com propriedades teraputicas to antigo quanto civilizao humana e, por muito tempo, os produtos minerais, vegetais e animais eram as principais fontes de novos frmacos (DE PASQUALE, 1984). No passado, os farmacologistas utilizavam o paladar e reaes cutneas para detectar materiais ativos, mas esses mtodos no so confiveis nem seguros (THOMAS, 2000). Mais da metade dos frmacos mais vendidos na ltima dcada possuem sua origem de produtos naturais (KINGHORN, 2002). Estes frmacos incluem o inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), enalapril e captopril; os agentes antiinflamatrios no-esteroidais como o diclofenaco e naproxeno, antibiticos amoxicilina e cido clavulnico, e o imunossupressor ciclosporina. Aproximadamente 25% das drogas prescritas no mundo todo tem sua origem a partir de plantas e das 252 drogas consideradas como bsicas e essenciais pela World Health Organization (PHILLIPSON, 2007; WHO, 1992) 11% so exclusivamente da origem vegetal. Histrico Durante o desenvolvimento da farmacognosia uma das tcnicas de maior destaque foi a cromatografia em papel, onde se levava aproximadamente 48 horas para obteno de resultados, sendo o nico mtodo de anlise fsica para a identificao, enquanto que a determinao da estrutura de produtos naturais era realizada atravs da espectroscopia ultravioleta (UV) (BRAGA, 1995). A determinao da estrutura qumica da molcula era obtida atravs da qumica degradativa e pela identificao de grupos especficos da molcula, a investigao inteira consumia a maior parte do tempo (PHILLIPSON, 2007). Atualmente existe um enorme nmero de tcnicas, incluindo as convencionais como a cromatografia em camada delgada (CCD), a cromatografia gasosa (CG), a cromatografia lquida clssica (CLC), e as mais avanadas como cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), a espectroscopia de ressonncia magntica (RMN) e a espectrometria de massas (EM) entre outras, que so ferramentas poderosas para a separao e a determinao da estrutura qumica de molculas orgnicas. Os refinamentos e a introduo de novas tcnicas analticas auxiliaram extremamente a pesquisa dos produtos naturais. O grande avano tecnolgico dos sistemas de cromatografia contribuiu para a identificao e separao de compostos biologicamente ativos (PHILLIPSON, 1995, 2007). Ao se considerar a perspectiva de obteno de novos frmacos, dois aspectos distinguem os produtos de origem natural dos sintticos: a diversidade molecular e a funo biolgica, sendo a diversidade molecular dos produtos naturais

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muito superior quela derivada dos processos de sntese, que, apesar dos avanos considerveis, ainda limitada (GUERRA; NODARI, 2002). Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao da atividade biolgica (DEY; HARBONE, 1991). Mais recentemente tambm vem sendo utilizado o monitoramento das fraes por CLAE acoplada a espectrofotmetro de ultravioleta (UV) e MS (CLAE/UV/EM) ou de RMN (CLAE/RMN). Essa combinao possibilita direcionar as operaes de fracionamento para o isolamento daqueles compostos considerados de maior interesse em funo dos dados espectrais obtidos (HOSTETTMANN; WOLFENDER; RODRIGUEZ, 1997). MTODOS CROMATOGRFICOS Os mtodos cromatogrficos so os procedimentos de separao e isolamento mais amplamente utilizados atualmente (cromatografia preparativa); servem tambm para fins de identificao e anlise de misturas e de substncias isoladas (cromatografia analtica) (AQUINO NETO; NUNES, 2003). A CCD uma tcnica amplamente utilizada para fins de anlise, tanto de extratos vegetais brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separao. Consiste na separao dos componentes atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana (LOPES, 2006). A CCD especialmente til para se avaliar o perfil cromatogrfico de um determinado extrato bruto obtido a partir de uma determinada espcie vegetal ou de extratos medicinais para substncias farmacologicamente ativas antes da anlise detalhada por tcnicas instrumentais tais como CLAE-UV e porque muitas amostras podem ser analisadas simultaneamente (RIJKE, 2006). Outra tcnica ainda muito utilizada para a separao ou isolamento de constituintes de extratos vegetais a CLC em coluna, que consiste na utilizao de uma coluna preenchida por uma fase estacionria slida e uma fase mvel lquida (FALKENBERG; SANTOS; SIMES, 2002). tecnicamente mais simples que a CLAE e facilmente aplicada, devendo ser constantemente monitorada, principalmente em CCD (VICHENWSKI, 2006). Martin e James em 1952 inventaram um mtodo de CG moderno que tem se tornado uma das tcnicas mais importantes e extensamente utilizada na qumica analtica moderna (JAMES, MARTIN, 1952). Os mtodos baseados em CG fornecem alta resoluo e baixos limites de deteo, serve para separar componentes a partir de mistura de compostos volteis. Nas aplicaes

analticas possvel o acoplamento com um sistema de espectrometria de massas (CG/EM), que extremamente til na separao e identificao de estruturas (RIJKE, 2006). As separaes so conseguidas por CG por uma srie das parties entre uma fase mvel gasosa e uma fase lquida estacionria retida em um tubo de pequeno dimetro (a coluna) depois uma mistura injetada para deteco. Um detector monitora ento a composio do fluxo de gs enquanto emerge da coluna que carrega componentes separados, e os sinais resultantes fornecem a entrada para a aquisio de dados (BARTLE; MYERS, 2002). A idia de combinao da tcnica de CG com as informaes e a seletividade estrutural disponibilizadas pelo EM fizeram desta combinao uma tcnica mais eficaz para a anlise de misturas complexas (BARTLE; MYERS, 2002). J os primeiros experimentos empregando a utilizao de um campo eltrico para a gerao de um fluxo eletro-osmtico em cromatografia lquida foi realizado em 1939 por Strain e em 1944 por Lecoq. A eletrocromatografia Capilar consiste no uso de um campo eltrico para gerar um fluxo eletro-osmtico para aplicao em cromatografia lquida (ALTRIA; SMITH; TURNBULL, 1997). Em 1952 Moulde e Synge aplicaram um campo eltrico para conseguir separaes em cromatografia em camada delgada, mas a primeira aplicao de um campo eltrico cromatografia em coluna foi realizada em 1974 por Pretorious e colaboradores (MOULDE; SYNGE, 1952; PRETORIOUS, 1974). As aplicaes atuais da eletrocromatografia capilar (ECC) tambm incluem a ECC com fluorescncia induzida por laser (ECC-FIL) e ionizao eletrospray (ES-EM) (LORD et al., 1995.). Mais eficiente que a CLC, a CLAE possibilita a utilizao de diferentes colunas, presso e fluxo, porm apresenta um custo maior (FALKENBERG; SANTOS; SIMES, 2002). Umas sries de colunas para CLC, com parmetros especficos de operao, encontram-se disponveis comercialmente, permitindo configurar apropriadamente o sistema de operao, segundo as caractersticas fsicas e qumicas dos compostos a serem analisados, obtendo alta seletividade. O sistema mais freqentemente utilizado para a identificao e isolamento de metablitos a fase reversa, o qual separa por partio e adsoro (MARASCHIN; VERPOORTE, 2001). Embora essas quatro tcnicas sejam consideradas eficientes (CCD, CLC, CG e ECC) so usadas menos freqentemente do que a CLAE. Mais recentemente, a deteo UV transformou-se na ferramenta preferida em

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anlises baseadas em CLAE, mesmo hoje, em detectores mltiplos de comprimentos de onda ou diodo a deteo UV uma ferramenta inteiramente satisfatria em estudos de grupos metablicos (RIJKE, 2006). MTODOS DE DETERMINAO ESTRUTURAL Atualmente uma variedade de detectores tem sido empregada com a finalidade de determinar as estruturas das molculas analisadas. Em cromatografia utiliza-se mais comumente a deteco UV e EM (ALTRIA; SMITH; TURNBULL, 1997). Entre os mtodos fsicos de anlise empregados atualmente na determinao estrutural das substncias, a EM, a espectroscopia UV, no visvel e no infravermelho (IV) e a RMN de prton e carbono 13 constituem os mais amplamente empregados. Afim desenvolver estratgias inovadoras para determinar os perfis dos metablitos de extratos brutos das plantas, desenvolveram tcnicas hifenadas onde, particularmente, as tcnicas de CLAE/EM e de CLAE/RMN so de extraordinria vantagem para estudar a identificao de produtos naturais (WOLFENDER; NDJOKO; HOSTETTMANN, 2003). Na determinao por UV as medidas da absoro envolvem a determinao da quebra de energia que sofre um feixe de radiao quando atravessa o meio absorvente. O comprimento de onda para o qual se observa um mximo de absoro depende da quantidade de energia associada determinada transio eletrnica (WILLARD; MERRITT JR; DEAN, 1974). Na determinao estrutural, os espectros de absoro de uma substncia no UV indicam a presena de certos grupos funcionais e a posio dos substituintes da molcula (FALKENBERG; SANTOS; SIMES, 2002). J para a deteco por IV o espectro infravermelho de uma substncia corresponde ao conjunto de bandas de absoro apresentadas pela amostra submetidas radiao infravermelha, sendo possvel a identificao da presena de insaturaes, sistemas aromticos e grupos funcionais especficos atravs da presena de bandas caractersticas (CIRELLI; DELUCA, 1995). A determinao por EM relaciona o espectro de massas resultante de uma amostra ao peso molecular e estrutura do analto, e permite a identificao atravs da comparao com uma biblioteca, ou com a interpretao a-priori (BARTLE; MYERS, 2002). O espectro de massas de uma substncia pode fornecer informaes relacionadas com sua estrutura, como a massa molecular e padres de fragmentao, permitindo estabelecer a frmula molecular da substncia e a caracterizao da presena e localizao de

grupos funcionais e cadeias laterais. Tambm permite o acoplamento com outras tcnicas de cromatografia, como a lquida e a gasosa, permitindo a identificao e quantificao de componentes de baixo peso molecular, mesmo em misturas complexas (BARTLE; MYERS, 2002). Na espectroscopia RMN a amostra submetida a um campo magntico externo, de forma que determinados ncleos podem entrar em ressonncia com a radifreqncia aplicada, absorvendo energia eletromagntica em freqncias caractersticas para cada ncleo. A interpretao desses dados permite caracterizar o numero e o tipo de tomos de H e C, em funo da localizao, proximidade espacial ou mesmo a conectividade de alguns tomos na molcula (MONACHE, 2001). Consideraes Finais Essas novas tcnicas analticas permitem maior rapidez, exatido e especificidade na busca de novas substncias ativas, possibilitando desta forma a obteno de informaes preliminares sobre constituintes em amostras complexas, como os extratos vegetais e a elucidao estrutural de novas molculas. Tornam possvel a utilizao de diferentes tcnicas para direcionar a seleo de extratos, fraes e substncias a serem isoladas e mesmo a combinao de bioensaios com tcnicas cromatogrficas como a CLAE. Referncias ALTRIA, K.D.; SMITH, N.W.; TURNBULL, C.H. A Review of the Current Status of Capillary Electrochromatography Technology and Applications. Chromatogr., v. 46, n. 11-12, p 664674, 1997. AQUINO NETO, F.R. NUNES, D.S.S. Cromatografia: princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003. BARTLE, K.D.; MYERS, P. History of gas chromatography. Trends in Analytical Chemistry, v. 21, n 9-10, p. 547-557, 2002. BRAGA, G.L. Cromatografia em papel. In: COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. Campinas: Ed. Unicamp, 6 ed. 1995. CIRELLI, A.F.; DELUCA, M.E. Aprendiendo Qumica Orgnica: estructura y reactividad. Buenos Aires: Eudeba, 1995. DE PASQUALE, A. Pharmacognosy: the oldest modern science. J. Ethnopharmacol., v. 11, p. 116, 1984.

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