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TRABAJO PRACTICO N 2 UTILIZACIN DE Drosophila melanogaster EN EXPERIMENTACIN GENTICA Objetivos - Demostrar los principios mendelianos de transmisin de caracteres hereditarios - Aprender a manipular cultivos vivos y observar el ciclo vital de Drosophila - Establecer un orden en la toma de datos y registro de resultados. - Utilizar herramientas estadsticas para el anlisis de los datos y posterior conclusin aplicando prueba de hiptesis. Actividades - Reconocimiento del material de trabajo - Manejo del cultivo - Reconocimiento del ciclo de vida - Cruzamientos y anlisis de descendencias - Descarte de los cultivos - Anlisis de los datos y aplicacin de pruebas estadsticas - Redaccin de informe y presentacin oral. Drosophila melanogaster pertenece al Phylum Artrpodos, Clase Insectos, Orden Dpteros. Llamada comnmente mosca de la fruta o del vinagre, ha sido utilizada como material de investigacin en Gentica desde principios de este siglo. Las ventajas que presenta para la experimentacin y el trabajo en laboratorio son las siguientes: - Facilidad y bajo costo de cultivo - Tiempo de generacin corto y termorregulable - Gran prolificidad - Pequeo tamao para la manipulacin y el almacenamiento. Se adapta especialmente para los estudios genticos debido a las siguientes razones: - El tipo de reproduccin facilita realizar cruzamientos controlados. - Es posible inducir mutaciones utilizando una metodologa sencilla. - Bajo nmero cromosmico (n=4). - Sus cromosomas han sido extensamente mapeados y se conoce gran nmero de mutaciones fcilmente distinguibles. - Presencia de politenia en las glndulas salivales de la larva. Ciclo vital La duracin es de 10 das a 25 C y pasa por los siguientes estadios: Da 0 oviposicin Da 1 eclosin de huevos; primer estadio larval Da 2 primera muda; segundo estadio larval Da 3 segunda muda; tercer estadio larval Da 5 comienza pupaje Da 10 emerge adulto Los adultos se vuelven frtiles entre 8 y 10 horas despus de emerger de la envuelta pupal. La hembra se fecunda una vez en su vida, que dura unos 30 a 40 das y produce descendencia producto de este primer acoplamiento a un promedio de 50-75 huevos por da. Las condiciones ambientales pueden modificar la duracin del ciclo; a temperaturas mayores de 25 C el ciclo se acorta; a temperaturas menores se alarga: 15 das a 20 C, 18 das a 18 C, etc. Por debajo de los 10 C el ciclo se alarga lo suficiente como para resultar imprctico en la experimentacin. A temperaturas mayores de 30 C ocurre esterilizacin de los machos, perdida de vitalidad y muerte.

Identificacin de los sexos: Observar las siguientes caractersticas:

macho menor tamao corporal 5 ltimos segmentos abdominales con bandas oscuras que se ensanchan progresivamente. el abdomen termina redondeado placa anal y genital pigmentada, castao a gris oscuro peine sexual en el tarso del primer par de patas El peine sexual es observable en los estados de pupas.

hembra mayor tamao corporal 7 ltimos segmentos abdominales con bandas oscuras de igual grosor el abdomen termina en punta placa anal y vaginal claras ausencia de peine sexual avanzados del pupaje, lo que permite el sexaje

Medios de cultivo Los cultivos se realizan en frascos de vidrio esterilizados, cilndricos y de fondo chato. El medio utilizado es el siguiente (Para unos 60 frascos de 40 ml): A: 9 gr. de agar en polvo y 62.5 cc. de melaza (Kero): disolver en 437.5 cc de agua. B: 62.5 cc de harina de maz y 25 cc de levadura en polvo: disolver en 125 cc de agua. C: 2.5 cc de cido propinico. Hacer hervir A agitando continuamente. Agregar B cuidando que no se formen grumos y hacer hervir agitando hasta que la mezcla est ligeramente viscosa; dejar enfriar 5 min. Agregar C y revolver. Se llenan inmediatamente los frascos con 2 cm de espesor de medio, cuidando de no chorrear las paredes. Dejar enfriar y colocar tapones de algodn limpio. Se pueden almacenar hasta unos 20 das en la heladera. Preparacin de los cultivos 1. Los frascos para usar se sacan de la heladera para que tomen temperatura ambiente. Las larvas de Drosophila necesitan levadura viva para crecer; para asegurar su provisin se espolvorean los medios con levadura seca. Se coloca una pequea cantidad de algodn sobre el medio para facilitar el desplazamiento de las moscas. Se corta una tira de papel de filtro esterilizado de 10 cm x 1 cm, se dobla por la mitad a lo largo y se introduce en el frasco, doblado en U. Este papel absorbe el exceso de humedad desprendida por el cultivo. 2. Se pueden transferir las moscas directamente de un cultivo establecido, uniendo los frascos por las bocas luego de retirar los tapones. El frasco vaco debe quedar hacia arriba y hacia la fuente de luz pues Drosophila presenta geotropismo negativo y fototropismo positivo. Esta posicin facilita el repique. Si se transfieren moscas anestesiadas, mantener el frasco en posicin horizontal hasta que se disipe el efecto de la anestesia, para evitar que queden adheridas al medio. Tres a cinco parejas son suficientes para establecer un cultivo; un nmero mayor favorece el rpido establecimiento, pero producir excesiva superpoblacin en etapas posteriores del ciclo. Lo ideal es mantener la temperatura constante a 25 C y los cultivos alejados del sol. Si se desarrollan mohos o caros parsitos en los cultivos, estos deben descartarse de inmediato. Lo mismo si ocurre contaminacin de un cultivo con un mutante diferente de Drosophila. 3. Todo cultivo de ms de un mes de edad debe descartarse, lavar y esterilizar. Sumergir los frascos a descartar en agua caliente con detergente y luego destaparlos. Retirar el medio con una esptula y cepillar los frascos. Enjuagar y secar. Esterilizar los frascos secos en autoclave a 1,5 atm durante 30 min y guardarlos envueltos. Manipulacin de los cultivos Equipo bsico: Cuaderno de notas, lupa estereoscpica, frasco eterizador, morgue (frasco con agua y detergente), caja de petri, pincel fino de pelo, papel de filtro, fibra para escribir sobre vidrio, ter sulfrico. Las moscas a examinar se pasan al frasco eterizador y se anestesian con ter sulfrico durante un minuto. No sobreeterizar las moscas ni anestesiar directamente los cultivos. Examinar y separar las moscas bajo la lupa, con ayuda del pincel. Si fuera necesario re-

anestesiarlas, poner papel de filtro en el fondo de una caja de petri, echar una gota de ter e invertir la caja sobre las moscas durante un minuto. Las que vayan a utilizarse en experimentos, se colocan en un frasco de cultivo como se explic antes. Las que se desean descartar, se vuelcan en la morgue. La planificacin de un cruzamiento se detalla previamente en el cuaderno, indicando los genotipos y el objetivo de la cruza. Al establecer el cultivo, escribir con fibra sobre el frasco el cruzamiento, fecha y nmero de comisin. Para recolectar vrgenes, se deben retirar todos los adultos del cultivo y separar las moscas que aparecieran antes de transcurridas 8 horas, ponindolas en un frasco de cultivo nuevo. Esto obliga a repasar los cultivos por lo menos dos veces al da. No utilizar las moscas nacidas durante la noche ni las moscas dudosas. Las moscas recin nacidas pueden reconocerse por: las alas arrugadas o incompletamente extendidas, el cuerpo alargado y relativamente incoloro y la mancha fecal verdosa en la cara ventral del abdomen. Experimentos de cruza Todo experimento de cruza debe ser previamente planificado, anotando el genotipo y fenotipo de los individuos a cruzar, lo que se espera obtener en F1, en F2 y en la cruza de prueba de la F1. Estos datos constituirn luego los "resultados esperados". Una vez establecidos los cultivos, deben vigilarse diariamente hasta la aparicin de las primeras pupas; en ese momento se retiran los adultos que han dado origen al cultivo. Al trmino de un experimento, cuando se ha completado el cuadro de datos, se procede a elaborar los resultados: los TOTALES obtenidos para cada FENOTIPO corresponden a los "resultados observados"; junto con las frecuencias correspondientes a los "resultados esperados", se confecciona un cuadro para aplicar un test de hiptesis (normalmente se utiliza Chi-Cuadrado). Se utilizarn las siguientes mutaciones: "ebony" (e) produce el fenotipo cuerpo negro, "brown" (bw) ojos color marrn, "white" (w) ojo color blanco, yellow (y) cuerpo color amarillo. Las dos primeras corresponden a loci situados en los cromosoma 3 y 2; las dos ltimas corresponden al cromosoma 1 (X). Todas son recesivas respecto del tipo salvaje, de ojos rojos y cuerpo marrn. Normalmente se planifican cruzas recprocas, esto significa preparar dos frascos por cada cruzamiento, del siguiente modo: 1) hembras mutantes x machos normales y 2) hembras normales x machos mutantes. Esto permite controlar la influencia que el sexo puede tener sobre la herencia del carcter en estudio. No es necesario cuando se cruza F1 x F1 para obtener F2, en el caso en que exista un solo fenotipo en F1. Obtencin de F1: preparar un frasco para hacer una de las siguientes cruzas: a) Hembras vrgenes tipo salvaje x Machos mutantes b) Hembras vrgenes mutantes x Machos salvaje Rotular los frascos y vigilar hasta la aparicin de las primeras pupas; en ese momento eliminar todos los adultos de cada frasco. Cuando comienzan a aparecer los adultos de la F1 se cuentan y clasifican y se procede con los siguientes cruzamientos. Cruza de prueba: preparar un frasco para hacer el siguiente cruzamiento: Hembras F1 vrgenes x Machos mutante. Los individuos mutantes deben tomarse de las lneas puras. Cuando aparecen las primeras pupas, eliminar los adultos de cada frasco. Obtencin de F2: En un frasco se colocaran varios individuos F1 del primer cruzamiento. Las hembras no necesitan ser vrgenes. Eliminar los adultos al aparecer las primeras pupas. En todos los casos se cuentan y clasifican las moscas nacidas durante 5 das. Informe: Considerando los conceptos de: Prueba de hiptesis (aceptacin o rechazo), niveles de significacin y punto crtico, presentar el siguiente informe con las conclusiones obtenidas.

INFORME A REALIZAR - Cul es el nombre de la mutacin que est utilizando y cmo se simboliza? - Cmo diferencia individuos mutantes de salvajes? - Diagrame los cruzamientos a realizar mostrando genotipo y fenotipo de los padres y de la descendencia, con los gametos respectivos. - Fecha en que realiz el cruzamiento: - Fecha en que los padres (P) fueron eliminados del cultivo: - Fecha de emergencia de las primeras moscas F1 - Observ algn mutante en F1? Si fuera as, cmo podra explicarlo? Fenotipos F1 Fecha Nro. Salvajes machos hembras Nro. Mutantes machos hembras Total

Total Se utiliza chi-cuadrado para determinar si los resultados obtenidos difieren significativamente de las proporciones esperadas: Resultados F1 Observados (o) Macho salvaje Hembra salvaje Macho mutante Hembra mutante X 2= - Conclusiones: F1 x F1 - Fecha de inicio del cruzamiento: - Fecha en que las moscas F1 fueron eliminadas del cultivo: Fenotipos F2 Fecha Nro. Salvajes machos hembras Nro. Mutantes machos hembras Total Esperados (e) (o - e)2 (o - e)2/e

Total Resultados F2 Observados (o) Macho salvaje Hembra salvaje Macho mutante Hembra mutante X 2= - Conclusiones: Esperados (e) (o - e)2 (o - e)2/e

Cruza de prueba - Fecha de inicio del cruzamiento: - Fecha en que las moscas F1 y mutantes fueron eliminadas del cultivo: Fenotipos CDP Fecha Nro. Salvajes machos hembras Nro. Mutantes machos hembras Total

Total - Utilice chi-cuadrado para determinar si los resultados obtenidos en la cruza de prueba difieren significativamente de las proporciones esperadas. Resultados Cruza de Prueba Observados (o) Macho salvaje Hembra salvaje Macho mutante Hembra mutante Conclusiones: (o - e)2 (o - e)2/e

Esperados (e)

X 2=