Universidad Nacional Autnoma de Mexico.

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan.

Porfirio Ruiz Gil

Virologa medica. Grupo: 1902. Maestra: Mara Guadalupe Aviles Robles

ELISA (Ensayo por Inmuno-absorcin Ligado a Enzimas).

Conceptos.

Anticuerpo_ Inmunoglobulina capaz de reconocer y unirse a un Ag o Ac.

IgG, IgM. IgD e IgE.

Antgeno_ Molcula extraa al organismo.

Protenas, CHOs, Lpidos, cidos nucleicos y combinaciones.

ELISA.
Descrita por Engvall y Perlman en 1971. Deteccin de antgeno mediante anticuerpo que esta enlazado a una enzima a la cual se le pone un sustrato que genera un color o luz. Generalmente ELISA se lleva acabo con Ags hidrosolubles (proteinas), para lipidos u otros Ags se lleva acabo un procedimiento mas complejo.

Enzima: L a enzima escogida debe unirse facilmente a Ac.

Ejemplos:

Peroxidasa. Fosfatasa alcalina. -galactosidasa. Ureasa, penicilasa.

Sustrato: Cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin, soluble en agua no toxico.

Ejemplos:

P-nitrofenil fosfato. 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 acido sulfonico). MUG (4-methyl-umbelliferyl beta D-glucoronido).

Fosfatasa Alcalina.
Cromgeno (Sustrato) P-nitrofenil fosfato (pNPP) 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfatonitro Azulde tetrazolium (BCIP/NBT) Naftol AS-TR fosfato/fast red RC Color Amarillo Purpura Purpura Rojo

Ventajas
Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente Puede almacenarse a +4 oC durante ms de 6 meses Disponible como enzima libre o como conjugado Ms estable que la peroxidasa Amplia variedad de sustratos comerciales

Desventajas
Se inactiva por agentes quelante, la acidez y los fosfatos orgnicos Menor relacin de conjugacin que la peroxidasa Necesita tampones especificos Puede causar impedimento

Peroxidasa
Cromgeno (Sustrato)
2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 acido sulfonico) o-fenilamino (OPD) 3,35,5-tetrametilbencidina base o dihidrocloruro (TMB) 3,3-deaminobencidina (DAB) 3-amino-9-etilcabazole (AEC) 4-cloro-1-naftol (4C1N)

Color
Verde Naranja Azul Marrn Rojo Azul

Ventajas
Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente Puede almacenarse a +4 oC, ms de 6 meses Disponible como enzima libre o como conjugado Relacin de conjugacin 4:1 No causa impedimento estrico Amplia variedad de sustratos

Desventajas
Incompatible con bastantes estabilizantes (azida sdica, etc) La Peroxidasa endgena y algunos metales interfieren en su actividad.

-Galactosidasa
Cromgeno (Sustrato)
MUG (fluorescente) AMPGD (luminiscente)

Color
Verde

Ventajas
Incrementa su tasa de reaccin en presencia de alcoholes

Desventajasas
Sufre inhibicin inducida por anticuerpos Tetrmero de 300kDa Frecuente causa de impedimento estrico.

Componentes.

Fase slida (soporte o placa).

Nitrocelulosa, polivinilo, poliestireno, latex, nylon, sefarosa, etc. Completo, Fraccion purificada, peptido sintetico. Ac monoclonales y Ac multiclonales. Peroxidasa-Ac, Fosfatasa alcalina-Ac, etc

Antgeno.

Anticuerpo.

Conjugado: Enzima-Ac.

Sustrato cromogenico.

Tcnica de ELISA en placa.

Sensibilizar la placa, despus lavado. Bloqueo de la placa, despus lavado. Se agrega el suero y despus se incuba. Lavado. Se agrega el conjugado y despus se incuba. Lavado. Se agrega el sustrato cromogenico y se incuba. Finalizar la reaccin.

Sensibilizar la placa: Se agrega el Ag o el Ac segn sea el caso. Lavado: Se lleva acabo con Buffer fosfato 0.01M a pH 7,2. Bloqueo de placa:
Caseina 5%(p/v) leche sin grasa.
Deteriora rpidamente puede enmascar algunos Ags.

Gelatina 0,2% (2mg/ml). Tween 20 al 0,2%. Puede producir residuos.

Finalizar la reaccin. cidos o bases fuertes.

Generalmente se usa cido sulfrico 2 M.

Tipos de ELISA.

Directo. Indirecto. Sandwich. Captura. Competitivo.

Debe incluirse control positivo bajo y alto., control negativo, y un blanco.

ELISA directo con Ac.

Antgeno especifico unido a una enzima Anticuerpo

Sustrato

ELISA directo con Ag.

Antgeno

E E E
Anticuerpo especifico unido a una enzima Sustrato

ELISA indirecto.
Antgeno

E
Anticuerpo especifico

E E

Sustrato Antianticuerpo especifico unido a una enzima.

Sandwich ELISA directo.

Antgeno

E E E

Anticuerpo

Conjugado.

Sustrato

Sandwich ELISA indirecto.

E E E E E

ELISA de captura.

E E E

Lectura de ELISA.

Lector de 450-492nm

Reporte de resultados.
Cualitativo: positivo o negativo. Cuantitativo: nanogramos/ml microgramos/ml.
Con el control negativo y positivos alto y bajo, se puede construir una curva de calibracin usando espectroscpico

Unidades internacionales de ELISA.

Aplicacin en la virologa.

Posibles muestras.
Exudado faringeo.

El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapn de rosca con 1 a 2 mL de solucin salina isotnica estril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa hermticamente. El tiempo de envo debe ser menor a los tres das y en condiciones de refrigeracin, con la cantidad de 10 gramos.

Materia fecal.

Raspado de lesiones o costras.

Se lava bien el sitio de la lesin, y luego con alcohol al 70%, utilizando gasa (no debe utilizarse algodn) y se deja secar. Con bistur estril, se raspa el borde de la lesin y se recoje el material que se desprende. Si la epidermis est desprendida se toman porciones de sta. Para la bsqueda morfolgica del agente, las costras o escamas se colocan en una caja de petri estril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva para que no se abra, o bien se pueden colocar en sobres de papel que se sellan.

Envo: La muestra debe congelarse para estudios virolgicos.

Suero. El suero no debe mostrar indicios de hemlisis, ni debe estar lipmico y se debe conservar refrigerado o congelado, a menos que se d otra indicacin. Envo: El frasco con la muestra se enva de inmediato, protegindolo del calor con hielo o un refrigerante.

Suero. El suero no debe mostrar indicios de hemlisis, ni debe estar lipmico y se debe conservar refrigerado o congelado, a menos que se d otra indicacin. Envo: El frasco con la muestra se enva de inmediato, protegindolo del calor con hielo o un refrigerante.

Preparacin de Ac policlonales mono especficos para ELISA indirecto.

Se hizo cultivo de linea celular RK el cual fue infectada por el virus del herpes simplex. Despues de su respectivo tratamiento las celulas fueron lisadas por sonicacion y luego centrifugadas a 1000 rpm /10min. Los sobrenadantes a 100000 rpm/ 1h del sobrenadante se obtiene la fraccin soluble proteica por el mtodo de Lowry y dialisis.

Posteriormente se hizo un gradiente de sacarosa y se centrifugo a 40000 rpm/24h a 5C y se obtuvieron 25 fracciones. Despues por una inmunoelectroforesis se aisla el Ag, finalmente se lleva acabo una sonicacion y se mezcla con un adyuvante.

Se inocula a 2 conejos cuatro veces con intervalos de 2 semanas, finalmente los Acs fueron purificados. Se realiza un ELISA indirecto.

Identificacion de Ac IgM anti Citomegavirus por ELISA.

Indicaciones: Para diagnstico etiolgico en los casos clnicos presuntivo a CMV de infeccin congnita, infeccin perinatal, infeccin postransfusional, postransplante e infeccin de pacientes inmunodeprimidos. Muestra: Suero (procedimiento M22). La muestra se obtiene durante la fase aguda de la enfermedad. El suero puede ser conservado en refrigeracin de 2 a 7 C no ms de 7 das.

Procedimiento: Las placas de ELISA estn sensibilizadas con anticuerpos anti IgM humana. Se aaden diluciones del suero problema y se adiciona el antgeno del virus unido a anticuerpos contra el antgeno viral conjugados a peroxidasa. El resultado es positivo slo que se haya retenido anticuerpos IgM contra el citomegalovirus.

Identificacion de Ac IgM antivirus de EpsteinBarr pera ELISA indirecto.

Indicaciones

Muestra: Suero. Se obtiene durante los primeros sntomas (etapa aguda de la enfermedad). Procedimiento: Se utiliza un equipo comercial. El antgeno viral est fijado a los pozos de la placa, se coloca el suero problema diluido y absorbido con anti IgG y se incuba. Posteriormente se aade el conjugado anti IgM que se va a fijar al complejo Ag-Ac. La parte enzimtica reacciona con su substrato dando una coloracin, esta reaccin se interrumpe y se lee a 450nm

Elisa Para Diagnosticar Sarampin (Se Detectan Anticuerpos IgM).

Fosfatasa alcalina

Rotavirus bovino.

Elisa Para Diagnosticar Hepatitis C (Se detectan Anticuerpos IgG).

Elisa Para Diagnosticar Hepatitis C (Se detectan Anticuerpos IgG).

Bibliografia y referencias.
AGUILAR, T. , F. 2001. Manual del Curso Practico de Inmunologa, 1 edicin, Editorial ENCB IPN, Mxico DF, 204 pp. FUENTES ARDERIU, Bioqumica clnica y patologa molecular, Volumen 1,, Ed. Reverte, Barcelona, Espaa, 1998.pag 352-253. MARGINI, R. A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica. 5 edicin. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 976 pp. Mendoza E. Susana E., (et al) MANUAL DE DIAGNOSTICO VIROLOGICO, FESC, 2008, UNAM, pag 274-276 ROJAS ESPINOSA, O. 2001. Inmunologa (de memoria), 2 edicin, Editorial Panamericana. Mxico, DF. 374 pp. MANUAL DE INMUNOLOGA ESPECIAL, Dr. Victor Zendejas, Ladislao Palomar, Marco Antonio Vega, Salvador Fonseca. http://es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay http://www.medic.ula.ve/idic/docs/clases/clase_practica1.pdf http://www.ctv.es/USERS/fpardo/vih4.htm http://www.scielo.org.pe/pdf/amp/v24n3/v24n3a05.pdf http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf