Producción de Ácido Cítrico

CH2-COOH

CHOH-COOH

Ch2-COOH

El ácido cítrico es un constituyente natural de los frutos cítricos. Hasta 1920, la

mayor exigencia del mismo era satisfecha primeramente por la extracción a partir
de limones, y el país que tenía la mayor producción era Italia.

Luego, comenzó a investigarse su obtención a través de la fermentación de

medios azucarados por hongos, especialmente Aspergillus. En épocas más
cercanas, el desarrollo de esta fermentación oxidativa creció enormemente y hoy
satisface la producción de todo el consumo mundial de bebidas gasificadas.

Microorganismos empleados

Los organismos que se utilizan actualmente en la industria son los hongos del
género Aspergillus (A. Niger y A. Wentii). Las cepas empleadas se reproducen
sólo por vía agámica.

En la superficie de los medios de cultivo líquidos en reposo forman un micelio

espeso. En medio agitado, con aireación adecuada, crece en forma sumergida en
forma de esferitas (peletas) constituidas por hifas enrolladas sobre sí mismas.
Para una buena fermentación, la peleta no debe tener un diámetro superior a 1-
1.5mm, y su concentración, variar entre 120.000 y 240.000/litro.

Estos tipos de hongos se aíslan normalmente a partir del suelo, aunque están muy
difundidos en otros hábitats naturales.

Quimismo

El ácido cítrico es un compuesto intermediario del Ciclo de Krebs. Según este

ciclo, cada mol de ácido cítrico se forma por condensación de los ácidos acético y
oxalacético, y este último proviene de la oxidación del ácido cítrico. En otras
palabras, puede decirse que la formación de cada mol de ácido cítrico implica la
destricción de otro mol del mismo ácido.

Sin embargo, las cepas de Aspergillus utilizaas en la industria permiten acumular

ácido cítrico brindando rendimientos superiores al 80% del azúcar consumido.
Esto significa, obviamente, que en estas cepas el proceso de demolición es menos
intenso que el de formación. En efecto, se ha demostrado la existencia de poca
aconitasa, la enzima que transporma el ácido cítrico en ácido cis-aconítico y que,
por otro lado, estas cepas puede fijar CO2 al ácido pirúvico, formando ácido osal-
acético, y no depender del ácido oxal-acético proveniente de la utilización del
ácido cítrico.

De acuerdo a esto, el esquema de formación es el siguiente: un mol de hexosa es

transformado en dos moles de ácido purúvico (glicolisis), una de las cuales es
oxidada a ácido acético y CO2. Este CO2 se fija a la otra molécula de ácido
pirúvico formando ácido oxal-acético. Luego, como en el ciclo de Krebs normal,
los ácidos acético y oxalacético se condensan. En el Cuadro 1 se compara el
Ciclo de Krebs de A. Niger productor de ácido cítrico , con un ciclo normal.

Cuadro 1: Esquematización del Ciclo de Krebs normal (izquierda) y del Ciclo

de Krebs en cepas de A. Niger productoras de ácido cítrico

Normal A. Niger

glucosa
glicolisis glucosa
Ac. Pirúvico glicolisis
(2 moles)
Ac. Pirúvico (2 moles)

Ac. Acético CO2 + Ac. Acético

Ac.
Ac. Cítrico Ac.
Oxalacético Ac. Cítrico
aconitasa Oxalacético

Ac. Cis-
aconítico Ac. Cis-
aconítico
Debe evitarse en lo posible la formación de ácido oxálico, producto del quimismo
que aparece especialmente cuando el pH del medio se halla por encima de 2,
aunque no para todas las cepas. Este ácido se forma a partir de los ácidos
isocítrico y málico, ambos intermediarios del Ciclo de Krebs.

Ac. Isocítrico _____ ac. Succínico + ac. Glioxálico

Ac. Oxálico

Ac. Málico ______ ac. Acético + ac. glioxálico

Ac. Oxálico

Materias primas

Fuentes de C: muchas sustancias orgánicas pueden ser fermentadas con

producción de ácido cítrico. Sin embargo, los mayores rendimientos se obtienen
usando sacarosa y fructosa. La glucosa puede dar buenos rendimientos,
próximos a los de sacarosa, pero en condiciones de trabajo más difíciles.

Industrialmente se fermentan soluciones de sacarosa de una concentración

comprendida entre 12 y 20%, obtenidas por disolución directa o por adecuada
dilución de melazas de caña de azúcar o remolacha.

Fuente de N: en los medios sintéticos se agregan sales nitrogenadas,

generalmente NO3NH4 (0.15-0.25%). Usando melaza normalmente no es
necesario agregar sustancias nitrogenadas, aunque a veces puede ser
conveniente intefrarla con pequeñas cantidades. Es importante que la fuente de N
sea escasa respecto a la de C, para limitar el desarrollo del hongo. Si la
concentración de N es elevada se forma mucho micelio y poco ácido cítrico; en
cambio, si está en cantidad limitada, el hongo se desarrolla mientras lo dispone, y
luego, el azúcar que queda (10-15%) es solamente respirado, es decir, oxidado
hasta ácido cítrico.

Sales nutritivas: en medios sintéticos se agregan pequeñas concentraciones de

PO4H2K (0.03-0.3%) y SO4Mg (0.05-0.1%), para proporcionar al hongo
elementos indispensables para su desarrollo. Emplenado cantidades mayores
aumenta la formación de ácido oxálico y disminuye el rendimiento en ácido cítrico.

Indudablemente, la cepa del hongo utilizada tiene una gran influencia sobre las
sales requeridas, y la composición del medio de cultivo debe optimizarse en
relación a aquella.
Acondicionamiento de melazas: para preparar el mosto es necesario ante todo
diluir la melaza hasta el 10-15% de azúcar y efectuar una purificación,
especialmente con el objeto de eliminar los cationes metálicos pesados (Fe, Cu,
Zn). Esto último se logra con el agregado de ferrocianuro de K (0.2g por cada
100g de melaza original), calentando a 80°C (15min.) dejando en reposo toda una
noche y filtrando. El agregado de ferrocianuro también tiene un efecto limitante
sobre el crecimiento del hongo, evitando un excesivo desarrollo del micelio.

Condiciones ambientales de la fermentación

PH: el empleo de pH bajo favorece la producción de ácido cítrico, suprime la de

oxálico, reduce al mínimo el peligro de contaminaciones y facilita la esterilización.
El intervalo de pH más satisfactorio es de 1 a 2%.

Temperatura: la temperatura óptima para las cepas productoras de ácido cítrico

se encuentra entre 25°C y 35°C.

Aireación: la formación de ácido cítrico es un fenómeno de oxidación y por lo

tanto, el oxígeno no debe faltar nunca. Para cultivos de superficie, la circulación
de ire saturado de humedad debe ser de 200ml de aire por hora y por gramo de
micelio. Para procesos a micelio sumergido, la cuba se airea con oxígeno o aire a
presión (presión en la cuba, 2 a 3 atm), regulando la velocidad del agitador de
manera de disolver más de 100mg de O2 por litro y por minuto.

SISTEMAS DE FERMENTACIÓN

Fermentación en superficie

En este sistema se utilizan bandejas de acero inoxidable, o aluminio de alta

pureza, de 1-2m2 de superficie y 5-10cm de altura, que se cargan con el medio de
cultivo y se siembran con conidios de Aspergillus. Al cabo de 2-5 días la superficie
está cubierta con una capa de micelio. Con esto, se verifica una adecuada
velocidad de producción de ácido cítrico, y la fermentación se completa en 7 a 8
días.

En las cámaras de fermentación, las bandejas se distribuyen en estantes o se

aplican intercalando travesaños de madera (pilas de hasta 20 bandejas). Cada
cámara puede tener hasta 300 bandejas y una fábrica importante posee unas 20
cámaras de fermentación (6000 bandejas).
En las paredes de la cámara hay una serpentina por la cual circula agua, para
ajustar la temperatura al valor requerido por el proceso.

Para este tipo de fermentación se pueden utilizar medios sintéticos o melazas,

acondicionadas como ya se ha visto. El medio de cultivo se distribuye en las
bandejas y se esteriliza en conjunto con todo el ambiente de la cámara,
inyectando vapor hasta que la temperatura del medio alcance el valor de 65-70°C,
manteniéndola algunas horas (esterilización práctica).

Luego de la esterilización se siebra con conidios. A partir de un cultivo esporulado,

se hace pasar una corriente de aire estéril que arrastra una nube de esporos al
interior.

Durante la fermentación, el aire debe distribuirse efectuando un barrido a

velocidad adecuada sobre la superficie de las bandejas. Previamente se lo
esteriliza por filtración y luego se lo satura de humedad, para evitar la evaporación
del medio, lo cual provocaría un aumento de la presión osmótica, perjudicial para
el hongo. La provisión de aire se efectúa en varios puntos de la cámara, a partir
de una línea central ubicada sobre el techo de la misma.

En cuanto a la evolución de la fermentación, puede decirse que cuando se ha

transformado un 90% de la sacarosa que había en el medio, disminuye la
velocidad de incremento de la acidez total (Figura 4).

En una fermentación normal la acidez total aumenta hasta el noveno o décimo día,
habiéndose acumulado un 7-8% de ácido cítrico y menos del 1% de ácido oxálico.
Normalmenmte en este punto se detiene la fermentación, ya que luego existe la
posibilidad de que el hongo comience a utilizar el ácido cítrico como fuente de C,
ante la escasez de azúcar disponible.
2.5

2.0
pH
1.5

1.0

120

Peso del
Normalidad % 90 micelio
(gr)

60

30

0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Días
Fermentación sumergida

Algunas de las ventajas que ofrecen los sistemas de fermentación sumertida son:
• Medio agitado, respecto a los sistemas en superficie
• Menor espacio necesario
• Menor riesgo de infecciones
• Mejor control de las variables del proceso (temperatura, pH O2)
• Menor duración del proceso
• Posibilidad de utilizar las mismas cubas para otras fermentaciones
(producción de gluconato, antibióticos, etc.)

Sin embargo, este sistema de producción resulta delicado de instrumentar, ya que

es importante la influencia de un gran número de variables, que deben
optimizarse:
• la cepa de A. Niger utilizada
• la edad del cultivo
• la composición del medio de esporulación
• la temperatura de incubación (el rango de 26-30°C es el óptimo)
• la presencia de metales pesados en el medio de fermentación (según su
concentración pueden actuar como inhibidores)
• el diámetro y concentración de las peletas

Se utilizan tanques de acero inxidable, cuyo diseño responde al diseño general

para una cuba utilizada en fermentaciones aeróbicas.

La aireación debe ser muy enérgica y de tal modo de lograr en la cuba una presión
de 2-3atm para facilitar la disolución del oxígeno (como valor orientativo debe
conseguirse una velocidad de disolución de unos 100mg de O2 por litro de medio
y por minuto). La continuidad de aireación es fundamental; en efecto, si se
interrumpiera por media hora la inyección de aire, aún reanudando luego la
circulación, el hongo no produce más ácido cítrico por la profunda alteración que
sufre su sistema enzimático.

La cuba dispone además de un agitador, con velocidad variable entre 300 y

600RPM, y de cuatro rompeolas diametralmente opuestos para aumentar la
turbulencia del líquido.

La formación de espuma causada por la aireación puede controlarse con la ayuda

de antiespumantes, generalmente octodecanol al 1% o productos de base de
siliconas.

La duración de la fermentación se sitúa entre 5 y 9 días.