DEPARTAMENTO DE FP QUMICA

I.E.S. PALOMERAS-VALLECAS

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL LACC-2

DETERMINACIN DE PROTEINAS POR EL METODO KJELDAHL

OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es la determinacin de nitrgeno, y por lo tanto de su contenido en protenas, de una muestra de alimento. El mtodo consiste en una primera etapa de digestin para transformar cualquier tipo de compuesto nitrogenado en amonio. A continuacin se realiza una destilacin y finalmente una valoracin cido-base.

MATERIAL Y REACTIVOS
MATERIAL - Balanza analtica - Pesasustancias - Manta calefactora o bloque metlico de calefaccin. - Probetas de 50 mL - Matraces o tubos de Kjeldahl - Embudos de 8 cm. de dimetro - Aparato de destilacin en vidrio segn esquema adjunto o destilador automtico Kjeldahl - Matraces erlenmeyer de 250 mL - Bureta de 25 mL - Vasos de precipitados de 250 mL REACTIVOS - Sulfato de cobre, p.a. - Sulfato potsico, p.a. - cido sulfrico concentrado - Selenio en polvo o SeO2 - Disolucin de hidrxido sdico al 40% - Disolucin de cido brico al 4% - Disolucin patrn de cido clorhdrico 0,1 N, previamente valorada - Indicador de Tsiro-Taschiro: Disolver 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de metileno en 1000 mL de etanol 96% v/v.

MUESTRAS
Puede analizarse cualquier tipo de muestra de alimento, aunque son muy recomendables por razones prcticas muestras en polvos o granos como, por ejemplo, pur de patatas o cereales en copos tipo Kelloggs, que tienen adems en el envase una indicacin de su contenido proteico.

FUNDAMENTO TERICO
El nitrgeno es un elemento constituyente de muchas sustancias importantes en la actividad humana como alimentos, frmacos, fertilizantes, etc. Por ello, el anlisis de nitrgeno es muy importante en gran variedad de muestras, tanto en investigacin como en control de calidad. El mtodo de Kjeldahl es uno de los anlisis qumicos ms universalmente empleados, siendo adems el mtodo de referencia para la determinacin de protenas en cereales, carnes y otros materiales biolgicos. Como la mayora de las protenas contienen aproximadamente el mismo porcentaje de nitrgeno, el producto de este porcentaje por un factor adecuado (6.25 para carnes, 6.38 para lcteos y 5.70 para cereales; ver tabla en ANEXO-1) proporciona el porcentaje de protena en una muestra. El mtodo se basa en la oxidacin de la muestra con cido sulfrico concentrado y caliente (digestin), con lo que el nitrgeno combinado se convierte en ion amonio. A continuacin se trata la disolucin con un exceso de base fuerte, se destila y finalmente se valora el amoniaco liberado.

Anlisis Instrumental. Mtodo Kjeldahl

G.S.G.

pagina 1 de 5

DEPARTAMENTO DE FP QUMICA

I.E.S. PALOMERAS-VALLECAS

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL LACC-2

Durante la etapa de oxidacin o digestin, que es la fase crtica del mtodo, el carbono e hidrgeno de la muestra se transforman en dixido de carbono y agua, respectivamente, mientras que el comportamiento del nitrgeno depende del tipo de combinacin en que se encuentre. Si est en forma de amina o amida, como en la materia proteica, la conversin a ion amonio es casi siempre cuantitativa. Sin embargo, el nitrgeno en un estado de oxidacin superior, como en los grupos nitro, azo o azoxi, pasa al estado elemental o a la forma de xidos durante la oxidacin, y stos no son retenidos por el cido sulfrico. Con el fin de mejorar la cintica del proceso de oxidacin, que es la etapa ms lenta en el mtodo Kjeldahl, se aade una sal neutra, como el sulfato de potasio, para aumentar el punto de ebullicin del cido sulfrico y con ello la temperatura a la que se desarrolla la oxidacin. No obstante, hay que proceder con cuidado para evitar la oxidacin del ion amonio, especialmente si la concentracin de la sal es alta y se produce una excesiva evaporacin del cido sulfrico durante la digestin. Muchas sustancias como mercurio, selenio, cobre, tanto en estado libre como combinado, catalizan la etapa de oxidacin. Si se utiliza el in mercurio, debe ste precipitarse con sulfrico antes de la destilacin, a fin de evitar la formacin de complejos con amoniaco. En la figura se representa el equipo tpico de destilacin utilizado en le mtodo Kjeldahl. El matraz de cuello largo, utilizado tanto para la oxidacin como para la destilacin, se llama frasco o matraz Kjeldahl. En los aparatos automticos se trata de un tubo recto de vidrio templado.

Cuando la oxidacin se ha completado, se enfra el contenido del matraz y se diluye con agua, para darle a continuacin la fuerte alcalinidad necesaria para la liberacin del amoniaco segn:

NH4+ + OH- NH3 + H2O

El aparato mostrado en la figura consta, adems, de una trampa para niebla, que evita que las gotas de la base fuerte puedan ser arrastradas por la corriente de vapor, y de un condensador refrigerado por agua. Durante la destilacin, el final del tubo adaptado al refrigerante se sumerge en la disolucin de cido del frasco (erlenmeyer) colector.

Anlisis Instrumental. Mtodo Kjeldahl

G.S.G.

pagina 2 de 5

DEPARTAMENTO DE FP QUMICA

I.E.S. PALOMERAS-VALLECAS

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL LACC-2

Existen dos mtodos para recoger y determinar el amoniaco. En uno, el colector donde se recoge el amoniaco contiene una cantidad conocida de cido patrn. Tras la destilacin, se valora por retroceso el exceso de cido con base patrn. Se necesita un indicador con viraje en la zona cida, debido a la presencia de iones NH4+ en el punto de equivalencia. Un segundo mtodo (el que se va a realizar en esta prctica), es aquel en el que slo se necesita una disolucin patrn, y consiste en el empleo de un exceso no medido de cido brico en el frasco colector, que reacciona con el amoniaco originando amonio y boratos:

H3BO3 + NH3 NH4+ + H2BO3El ion dihidrgenoborato producido es una base relativamente fuerte que se puede valorar con una disolucin patrn de cido clorhdrico o sulfrico:

H2BO3- + H3O+ H3BO3 + H2O

En el punto de equivalencia, la disolucin contiene cido brico e iones amonio, por lo que se requiere un indicador con viraje cido. Los ms utilizados son el verde de bromocresol (pKa = 4.7), que presenta un intervalo de viraje desde pH 3.8 (amarillo) a 5.4 (azul), y el rojo de metilo (pKa=5.0) con intervalo de viraje de pH 4.2 (rojo) hasta pH 6.2 (amarillo); si se utiliza este ltimo indicador mezclado con azul de metileno, se obtienen virajes muy netos cuando se valora el borato con cido fuerte, pasando del verde inicial (originado por el amarillo ms azul) al violeta final (rojo ms azul). Este sistema indicador se conoce como indicador de Tsiro Taschiro.

PROCEDIMIENTO
Pesar con precisin de 0,1 mg 1-3 g de la muestra, segn contenido. Llevar la muestra pesada al tubo de digestin e introducir sucesivamente unos granos de controlador de la ebullicin, 15 de de sulfato potsico, 0,5 g de sulfato de cobre y una punta de esptula de selenio en polvo (puede utilizarse una pequea cantidad de oxido de selenio(IV)). Agregar 25 mL de cido sulfrico, mezclar suavemente por rotacin y colocar el tubo en el digestor. Poner en marcha el horno programando una temperatura de 420 C durante 30 minutos. Realizar el proceso de digestin en la campana extractora, colocando en el extremo de los tubos de digestin un embudo cnico para evitar que se salgan las posibles espumas que pueden formarse durante este proceso. Dejar enfriar a temperatura ambiente y aadir,lentamente, 50 ml de agua de agua, agitando con precaucin. Una vez enfriado conectar el tubo de digestin al destiladora automtico. En un erlenmeyer poner 25 mL de cido brico 4% y unas gotas de indicador. Introducir hasta el fondo del erlenmeyer la alargadera del aparato de destilacin y sujetar. Encender el destilador automtico, indicando que aada 100 ml de disolucin de NaOH 40%. Poner en marcha manteniendo la destilacin durante 5 minutos aproximadamente, tras los que se habr recogido un volumen de unos 100 ml de destilado en el matraz erlenmeyer. Una vez acabado el proceso retirar el erlenmeyer y lavar la alargadera. Cuando se enfre el tubo se retira y se lava Valorar el contenido del erlemeyer con HCl 0,1 N hasta el viraje (de verde a violeta). Realizar un blanco con agua desionizada siguiendo solo el proceso de destilacin. Precauciones: La digestin se realizar en la campana de gases con la ventana bajada. Tanto en este proceso como durante la destilacin es OBLIGATORIO el empleo de gafas de seguridad. Al retirar el erlenmeyer y el tubo del destilador habr que tener mucho cuidado ya que puede gotear NaOH o el producto de destilacin. A parte de las precauciones conocidas a tomar con los cidos y las bases fuertes que se van a utilizar, hay que manipular con cuidado el selenio debido a su toxicidad (se recomienda el uso de guantes)

Anlisis Instrumental. Mtodo Kjeldahl

G.S.G.

pagina 3 de 5

DEPARTAMENTO DE FP QUMICA

I.E.S. PALOMERAS-VALLECAS

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL LACC-2

RESULTADOS EXPERIMENTALES
La cantidad de nitrgeno total en % viene dada por:

Ntotal (%) = 1,4 x NHCl(V1-V2)/P

donde: NHCl es la normalidad del cido clorhdrico V1 es el volumen de cido clorhdrico gastado en la valoracin V2 es el volumen de cido clorhdrico gastado en el ensayo en blanco P es el peso en g de la muestra La cantidad de protena en la muestra ser.

% protena = K x Ntotal
(K es un factor de proporcionalidad para pasar e N a peso de proteina. Ver en ANEXO-1 los valores de estos factores segn la FAO)

ANEXO-1 Factores de conversin nitrgeno en protena (FAO)

Alimento
Harina, harina integral Harina, extraccin media o baja Macarrones, espagueti, pastas de trigo Salvado Arroz Centeno Cebada Avena Cacahuete Soja y derivados Almendra Coco (sin corteza) Castaa Leche, todo tipo, fresca o seca Margarina (vegetal o animal) OTROS ALIMENTOS

Factor
5.83 5.70 5.70 6.31 5.95 5.83 5.83 5.83 5.46 5.71 5.18 5.30 5.30 6.38 6.38 01/06/25

Anlisis Instrumental. Mtodo Kjeldahl

G.S.G.

pagina 4 de 5

DEPARTAMENTO DE FP QUMICA

I.E.S. PALOMERAS-VALLECAS

PRCTICAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL LACC-2 ANEXO-2

Tablas de composicin de algunos alimentos
CEREALES y DERIVADOS Arroz Cebada Centeno Copos de Maiz Harina Integral Galleta tipo Mara Harina Maz Pan Blanco Pan Integral Pan Tostado Pasta al huevo Pasta de smola Polenta (Harina de Maz Smola Tapioca Trigo duro Caloras 362 373 350 372 321 409 345 363 270 230 420 368 336 358 361 363 361 Protenas 7 10,4 9,4 7,6 11 6,8 11 9,2 8,1 9 11,3 19 13 8,7 11,5 0,6 13 Lpidos 0,6 1,4 1 1 1,9 8,1 0,7 3,8 0,5 1 6 0,2 0,3 2,7 0,5 0,2 2,9 Hidratos de Carbono 87,6 82,3 76 85,2 69,7 82,3 73,6 73 64 47,5 83 73,4 78,6 79,8 77,6 86,4 70,8

Alimentos 100 gr.

Jamn Ahumado Jamn Cocido Jamn Serrano Bacon Frito Plancha Chorizo Mortadela Bologna Salchicha Cocida Salchichn Pasta Hgado

Kcal
360 270 356 696 472 322 270 491 310

Prot. gr.
17.7 14.4 17 9.3 15.8 15.8 10.8 19.3 12.9

H.C. gr.
0.7 0 0 1 1.1 4.1 0.4 1.9 4.3

G.T gr.
31.8 23.6 35 49.24 45 19.8 27.6 45.2 26.9

G.S. gr.
12.6 9.22 11.7 17.14 20.6 6.8 10.4 20.7 10.6

GMI gr.
15.5 11.8 15.6 23.6 19.8 9.7 13.1 19 13.3

CPI gr.
3.3 2.45 4.15 5.8 5.25 2.12 1.77 5 2.58

COL mg.
60 60 62 85 100 5.9 60 79 120

FIB gr.
0 0 0 0 0 0 0 0 0

Na mg.
1.100 1.090 1.110 990 78 2.290

Ca mg.
10 14 0 7 13 90 6

1.850 860

10 26

H.C.=Hidratos de carbono / G.T.=Grasas Totales / G.S.=Grasas Saturadas / GMI=Grasas Mono Insaturadas / CPI=cidos Grasos Poli Insaturados (omega 3,6,9) / COL=Colesterol / FIB=Fibra / Na=Sodio / Ca=Calcio / Prot.=Protenas / Kcal.=Kilo Caloras por 100 gramos de alimento.

LEGUMBRES
Alubia (juda seca) Garbanzo Guisantes secos Haba seca Lenteja

Caloras
316 338 304 304 325

Protenas
23 21,8 21,7 27 25

Lpidos
1,3 4,9 2 2,4 2,5

Hidratos de Carbono
61 54,3 53,6 46,5 54

Anlisis Instrumental. Mtodo Kjeldahl

G.S.G.

pagina 5 de 5