Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Qumica Biolgica Lic.

Ciencias mencin Qumica

Laboratorio N4

Cintica enzimtica

Integrantes: lvaro Etcheverry Matas Leal. Profesora: M Cecilia Rojas Fecha del Entrega: Jueves 19 de Mayo de 2011

INTRODUCCIN

El objetivo de este laboratorio fue el de poder observar la actividad de una enzima, especficamente la peroxidasa encontrada en los extractos de rbano (Rhapanus sativus). La observacin de la actividad enzimtica se realiz cambiando el sustrato natural de esta enzima (fenoles y otros compuestos aromticos) por otros que cambian de color al oxidarse utilizando H2O2 como catalizador. Se realizaron ensayos enzimticos en presencia de enzima, en ausencia de ella, con enzima previamente desnaturalizada, a diferentes pH y en presencia de un inhibidor. MTODOS Se entrega a cada grupo un extracto de rbano preparado con anterioridad en una juguera, este extracto ser el complejo enzimtico que se estudiar. Para ello se prepara en un tubo de ensayo un medio de incubacin de 3mL, este debe contener volmenes proporcionales de citrato de sodio 50 mM a pH 5, guayacol 5 mM, H2O2 0.3% y 0.2 mL de extracto de rbano, se observa que con el paso del tiempo la solucin se torna de transparente a un tono pardo, dicho tiempo debe ser medido.
OCH3 O OCH3 OH O OCH3

H2O 2

e r o

i d

a s a

+
O OCH3

8 H2O

O OCH3

Figura 1: Reaccin de oxidacin del guayacol en presencia de peroxidasa para dar el complejo coloreado tetraguayacol. Luego se realizan controles apropiados a fin de demostrar que la reaccin observada anteriormente corresponde al efecto de la enzima, para ello se preparan 2 tubos con 3 mL de solucin pero con algunas variables respecto al tubo de incubacin, en el primero de ellos no se incluye el complejo enzimtico y en el segundo se incluye pero luego de ser calentado. Finalmente se disean protocolos para estudiar otros efectos sobre la reaccin, uno de ellos fue el uso de un inhibidor antes de agregar la enzima. Tambin se evala el efecto que tiene el pH sobre la velocidad de reaccin, se preparan 2 tubos similares al tubo del medio de incubacin con la diferencia de que uno de ellos tendr citrato de sodio 50 mM a pH 4 y el otro citrato de sodio 50 mM a pH 5. RESULTADOS Y DISCUSIN En primer lugar se prepara el medio de incubacin que debe contener cierto volumen de citrato de sodio 50mM a pH=5, guayacol 5mM y de H2O2 0.3%, adems 0.2mL de extracto de rbano y agua desionizada. Para determinar este volumen se realiza un clculo sencillo mediante la frmula de dilucin C1*V1 = C2*V2, dicho

clculo arroja que se necesitan 0,3 mL de cada uno los compuestos mencionados anteriormente, el resto de volumen se completa con agua desionizada. Adems se preparan otros 2 tubos similares pero en uno de ellos no se agrega enzima y en otro se calienta la enzima a 100C por 5 minutos y en el otro no se agrega agua oxigenada. Tabla I: Composicin de los Medios de Incubacin Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Reactivos/Tubos Con Sin Enzima Enzima Hervida enzima Citrato de Sodio 0,3mL 0,3mL 0,3mL 0.5 M; pH 5 Guayacol 0,3mL 0,3mL 0,3mL 0,05 M H2O2 3% 0,3mL 0,3mL 0,3mL Extracto rbano 0,2mL 0,2mL (Enzima) Agua desionizada 1,9mL 2,1mL 1,9mL

En el tubo del medio de incubacin, se realiza primero el ensayo de tiempo cero, es decir si, se observa si hay reaccin instantnea una vez que la enzima ha sido agregada, en este caso este ensayo es negativo, sin embargo una vez que han transcurrido alrededor de 10 segundos comienza a observarse un cambio en el color de la solucin pasando de transparente a un rojo ladrillo muy tenue que a medida que avanza el tiempo se vuelve ms intenso. Este resultado era de esperarse ya que en este tubo se encuentran todas las condiciones para que la reaccin ocurra. El tubo 2 en el cual no hay enzima, no tiene ocurre ningn cambio apreciable ni a los 10 segundos ni pasado 2 minutos ni tampoco pasados 30 minutos. Este resultado indica que la reaccin ocurre gracias al poder cataltico del complejo enzimtico. En el tubo 3, se agrega enzima pero luego de ser calentada en un bao de agua hirviendo a 100C y por 5 minutos, se aprecia que no ocurren cambios ni a los 10 segundos, ni en 2 minutos ni en 30 minutos despus de ser agregada la enzima, este fenmeno quiere decir que en el complejo enzimtico de rbano la actividad cataltica slo depende de las protenas presentes que al ser desnaturadas a altas temperaturas pierden su poder cataltico. Luego de que se han realizado los controles y se ha comprobado que la actividad cataltica depende del complejo enzimtico de rbano y ms especficamente de las protenas presentes en el complejo se realizan un par de pruebas ms. Primero en un tubo de ensayo se agregan las mismas cantidades de soluciones que en el tubo control, pero antes de agregar la enzima se agrega un inhibidor, especficamente 0,2 mL de cido ascrbico 0,05 M. A medida que transcurre el tiempo no se aprecia ningn cambio ni a los 10 segundos, ni a los 2 minutos ni pasada media hora. Esto significa que el inhibidor tiene un efecto total sobre el complejo enzimtico y no ocurre ninguna reaccin de catlisis ya que este inhibidor atrapa los radicales libres. Finalmente se realiza una prueba variando el pH de la solucin de citrato de sodio, primero se realiza a pH=4 y luego a pH=5, la composicin de dichos tubos se muestra en la siguiente tabla: Tabla II: Medios de Incubacin a distintos pH

Reactivos/Tubos Citrato de Sodio 0.5 M Guayacol 50 mM H2O2 3% Extracto rbano (Enzima) Agua destilada

Tubo 1; pH 4 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,2 mL 1,9 mL

Tubo Control; pH 5 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,2 mL 1,9 mL

Tubo 2; pH 6

0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,2 mL 1,9 mL

En el tubo a pH 4, a los 10 segundos de agregada la enzima se aprecia una coloracin anaranjada o caf claro, luego a los 20 segundos la solucin ya est de un color un poco ms intenso a diferencia del pH 5 que tardaba alrededor de 30 segundos en aparecer esta coloracin. Luego a los 2 minutos la solucin est de un color pardo muy intenso. Por su parte a pH 6, se aprecia que la coloracin aparece alrededor de los 20 segundos, luego se aprecia un aumento en la intensidad de esta alrededor de los 45 segundos, finalmente trasncurridos 2 minutos se nota el color pardo intenso tpico de esta reaccin. Viendo estos 2 ensayos, y comparndolos con el tubo control a pH 5, se puede indicar con claridad que a medida que el pH aumenta la coloracin tarda ms en aparecer y al contrario a medida que disminuye el pH la coloracin se produce en un lapso menor de tiempo. Interpretaciones: Se muestra en las tablas, la aparicin de la coloracin anaranjada en funcin del tiempo transcurrido. Se observa de la tabla, que en la medida que aumenta el pH, la aparicin del color tarda ms en aparecer. Contrariamente a menor pH, el aumento de la oxidacin (coloracin) es ms rpido en tiempo. Finalmente, al agregar el inhibidor de cido ascrbico se pudo ver que la reaccin despus de 5 minutos no mostr ningn cambio, esto se debe a que este es un inhibidor que atrapa radicales libres, es por esto que la reaccin no ocurre con facilidad. CONCLUSIONES Los controles realizados afirman la importancia de la enzima y el H 2O2, ya que si se realiza el ensayo en ausencia de cualquiera de los dos compuestos la reaccin no llega a trmino. La enzima cataliza la reaccin, y el H 2O2 es el agente transportador de electrones de la peroxidasa. Se utiliza el control sin enzima para observar que la reaccin no ocurre (ms bien ocurre a una velocidad demasiado lenta para ser apreciada), mientras que el control con enzima desnaturalizada sirve para observar que no existen otros elementos en el extracto de rbano que puedan catalizar la reaccin. Al igual que en sesiones anteriores se pudo observar la importancia del pH en las reacciones enzimticas, y que en este caso se pudo observar que el pH ptimo para la reaccin catalizada por peroxidasa es cercano a 4.

 La presencia de un inhibidor en el medio altera notoriamente el desarrollo de la reaccin, que por lo que se apreci en el laboratorio no transcurri de forma apreciable.

REFERENCIAS Gua de trabajos prcticos Bioqumica 2011. ALBERTS, B. et al; 2005; Introduccin a la Biologa Celular; 1 Edicin; Editorial Mdica Panamericana; Mxico. STRYER, L. et al; 2001; Bioqumica; 6 Edicin; Editorial Revert; Espaa.