UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGA QUMICA Profesor Patrocinante: Lilian

Elizabeth Abugoch James

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnologa Qumica, Universidad de Chile

Directores de Memoria: Lilian Elizabeth Abugoch James

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnologa Qumica, Universidad de Chile

Nalda Marcela Romero Palacios

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnologa Qumica, Universidad de Chile

OBTENCION, CARACTERIZACIN ESTRUCTURAL Y DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE UN AISLADO PROTEICO DE QUINUA ORGNICA (CHENOPODIUM QUINOA)

Memoria para optar al Ttulo Profesional de Ingeniero en Alimentos

MONICA MIREYA RIVERA FIGUEROA

Santiago, Chile 2006

Todo nuestro descontento por aquello de lo que carecemos procede de nuestra falta de gratitud por lo que tenemos. Daniel Defoe

A mi amada familia

II

La fase experimental de esta memoria fue realizada en el Laboratorio de Procesos de Alimentos del Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnologa Qumica, dependiente de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile. El financiamiento para esta investigacin fue otorgado por la Universidad de Chile, a travs del concurso interno de tesis del ao 2006.

III

AGRADECIMIENTOS

Agradezco de todo corazn a todos quienes me han apoyado durante mi carrera y a quienes han hecho posible la realizacin de esta memoria: A mi profesora patrocinante y directora de memoria, Lilian Abugoch, por su dedicacin, enseanzas, consejos y su inagotable buena disposicin. A la profesora Nalda Romero, por sus enseanzas, sus correcciones y su valioso aporte a esta tesis. A la profesora Mara Eugenia Letelier por facilitar la centrfuga sin la cual hubiese sido imposible la obtencin del aislado. Por su generosa ayuda y tiempo, gracias. Al profesor Jorge Chavez, por facilitar el secador spray, y a Alejandra Olave, por ensearme a usarlo. Al profesor Abel Guarda por facilitar el equipo DSC, para la realizacin de los anlisis. A todos los miembros de los laboratorios de: Procesos, Qumica de Alimentos y Operaciones Unitarias, por su gran disposicin y valiosa ayuda. A las profesoras miembros de la comisin evaluadora de mi tesis, Luca Collados y Paz Robert, por su aporte y sugerencias a mi trabajo. A todos los profesores sin excepcin, quienes me entregaron ms que conocimientos durante la carrera. A mis compaeros, muchas gracias por su ayuda y compaerismo. A mi muy querido amigo Jorge Silva, por su apoyo, compaa y ayuda durante el desarrollo de esta tesis, mil gracias. A mi familia, en especial a mis padres, Waldo y Mireya, por inculcarme tantos valores (en especial el del estudio), y por su constante apoyo durante toda mi existencia. A mi queridsima ta Iris, quien incluso en la lejana me dio la fuerza para seguir siempre adelante. A Sosky, Kitty y Nelson, sin cuyo apoyo hubiera sido imposible culminar esta etapa de mi vida. Siempre les estar en deuda.

IV

INDICE

RESUMEN ............................................................................................................... VII SUMMARY .............................................................................................................. VIII I. INTRODUCCIN.....................................................................................................1 1.1 1.2 Antecedentes generales ..............................................................................1 Caractersticas de la quinua ........................................................................2 Composicin de la semilla de quinua y su valor nutricional.................3 Las Saponinas .....................................................................................5

1.2.2 1.2.3 1.3 1.4 1.5

Empleos de la quinua ..................................................................................6 Mercado nacional e internacional ................................................................6 Los aislados proteicos y sus propiedades ...................................................7

II. HIPTESIS .............................................................................................................9 III. OBJETIVOS ........................................................................................................10 3.1 3.2 Objetivo general.........................................................................................10 Objetivos especficos.................................................................................10

IV. MATERIALES Y MTODOS................................................................................11 4.1 Materiales ..................................................................................................11 Materia prima .....................................................................................11 Reactivos qumicos............................................................................11 Equipos e instrumentos .....................................................................12 Insumos y utensilios...........................................................................14 Obtencin de la harina de quinua desgrasada ..................................15 Obtencin del aislado proteico de quinua..........................................16 Caracterizacin qumica ....................................................................18 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3

Mtodos .....................................................................................................15

4.2.3.1 Composicin Proximal... 18 4.2.3.2 Perfil de aminocidos 18 4.2.3.3 Determinacin de fitoestrgenos. 19

4.2.4

Caracterizacin estructural de las fracciones proteicas.....................19

4.2.4.1 Perfiles polipeptdicos... 19 4.2.4.2 Fluorescencia. 20 4.2.4.3 Espectroscopa UV 21 4.2.4.4 Calorimetra Diferencial de Barrido. 21 4.2.5 Determinacin de las propiedades funcionales .................................21 4.2.5.1 Solubilidad21 4.2.5.2 Capacidad de retencin de agua........... 22 4.2.5.3 Capacidad de absorcin de agua.22 4.2.6 Anlisis estadstico ............................................................................23

V. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................................24 5.1 Caracterizacin qumica del aislado proteico de quinua ...........................24 Composicin Proximal .......................................................................24 Perfil de aminocidos.........................................................................25 Contenido de fitoestrgenos ..............................................................27 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.2

Caracterizacin estructural de las fracciones proteicas ............................28 Perfiles Polipeptdicos del Aislado Proteico de Quinua A9................28 Fluorescencia.....................................................................................31 Espectroscopia de absorcin UV.......................................................33 Calorimetra diferencial de Barrido ....................................................35

5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3

Determinacin de las propiedades funcionales .........................................37 Solubilidad .........................................................................................37 Capacidad de retencin de agua .......................................................39 Capacidad de absorcin de agua ......................................................41

5.3.1 5.3.2 5.3.3

VI. CONCLUSIONES ...............................................................................................43 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................45 ANEXOS ...................................................................................................................53 Anexo 1. Mtodos electroforticos (PAGE)...........................................................54 Anexo 2. Mtodo de Bradford................................................................................58 Anexo 3. Preparacin de los buffers .....................................................................60 Anexo 4. Gradientes de concentracin para fase mvil de HPLC.. 61

VI

RESUMEN El presente estudio tuvo por objetivo la obtencin de un aislado proteico de quinua a partir de quinua orgnica proveniente de la VI Regin. El aislado se caracteriz desde el punto de vista qumico, estructural y funcional. Los resultados se analizaron estadsticamente mediante anlisis de varianza y test de Tukey, al 95 % de confianza. El contenido de protenas totales del aislado fue de 77,2%. El perfil de aminocidos coincidi con lo descrito en la literatura para la harina de quinua, por lo que la extraccin de las protenas a pH 9 no afect el balance de aminocidos, Entre los aminocidos esenciales, destacan el alto contenido en lisina, metionina y arginina. Los perfiles polipeptdicos en condiciones nativa y desnaturante, sin y con 2-Me, indican que las protenas del aislado estn compuestas principalmente por albminas del tipo 2S y globulinas 11S. A travs de los resultados de espectroscopia UV se verific la presencia de globulinas. En fluorescencia se observ curvas muy similares para los pHs alcalinos, lo que indicara que la estructura de la protena no sufri modificaciones en tales condiciones. Los resultados de la calorimetra diferencial de barrido, sealan un cierto grado de estructuracin de la protena, presentndose una endoterma de 13,5 mJ y una temperatura de desnaturalizacin (td) de 98,1C, para el aislado suspendido en agua. La endoterma fue mayor para la misma muestra suspendida en buffer de pH 9 (29,1 mJ y td de 100,5C), lo que seala que a pH 9 se produce una reestructuracin de las protenas. El estudio de las propiedades funcionales muestran que el aislado de quinua posee un alto nivel de solubilidad, especialmente sobre el pH 5, con una solubilidad de 76,6%, la cual aument con el pH hasta alcanzar un mximo de 94,6%, a pH 11. La capacidad de retencin de agua (WHC) fue buena, con valores entre 2,5 y 3,0 mL/g aislado proteico, no encontrndose una dependencia del pH. En absorcin de agua se obtuvo resultados relativamente elevados, con una capacidad mxima de absorcin (WIC) de 1,8 g agua/g aislado, y una velocidad inicial de 1,34 g agua/ g aislado min. Todas estas caractersticas apuntan a que el aislado es apropiado para la elaboracin de productos tales como: bebidas, sopas, embutidos, geles, productos de panificacin, alimentos deshidratados y, en general, en el desarrollo de productos funcionales altamente proteicos.

VII

SUMMARY OBTAINING, STRUCTURAL CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF THE FUNCTIONAL PROPERTIES OF A PROTEIN ISOLATE OF ORGANIC QUINUA (Chenopodium quinoa) The present study had by objective the obtention of a quinoa protein isolate of organic quinoa, originated at the VI Region. The isolate was characterized from the chemical, structural and functional point of view. The results were statistically analyzed by analysis of variance and test of Tukey, at 95 % of confidence. The total protein content of the isolate was 77.2%. The amino acids composition corresponded to that described in references for the flour of quinoa, reason why the extraction of proteins to pH 9 did not affect the balance of amino acids, between the essential amino acids, emphasize the high content of lisine, metionine and arginine. The polypeptide profiles in conditions native and denaturing, without and with 2-Me, indicate that the proteins of the isolate are compound mainly of albumins of the type 2S and globulins 11S. Through the results of spectroscopy UV the presence of globulins was verified. In fluorescence it was observed very similar curves at alkaline pHs, which would indicate that the structure of the protein did not undergo modifications in such conditions. The results of the differential scanning calorimetry, indicate a certain degree of structuring of protein, appearing one endotherm of 13.5 mJ and one temperature of denaturation (td) of 98,1C, for the isolate suspended in water. Endotherm was greater for the same sample suspended in pH 9 buffer (29.1 mJ and td of 100.5C), which indicates that at pH 9 a reconstruction of proteins takes place. The study of the functional properties indicates that the isolate one of quinoa has a high level of solubility, especially at pH 5, with a value of 76.6%, which increased with pH until reaching a maximum of 94.6%, at pH 11. The water retention capacity (WHC) was good, with values between 2.5 and 3.0 mL/g isolate protein, not being a dependency of pH. In water absorption one obtained relatively elevated results, with a maximum capacity of absorption (WIC) 1.8 g water/g of isolate, and one initial speed of 1.34 g water/g isolate min. All these characteristics aims at that the isolate is appropriate for the product elaboration such as: drinks, soups, inlays, gels, baking industry, dehydrated foods, and, in general, in the development of protein high functional products.

VIII

I. INTRODUCCIN

1.1

Antecedentes Generales Las protenas son macromolculas que contienen carbono, nitrgeno,

oxgeno y, casi todas, azufre. En algunas se ha encontrado fsforo, hierro, zinc y cobre (Robinson, 1991). Son las molculas ms abundantes en el interior de las clulas y son fundamentales en cuanto a su estructura y funcin, proporcionando los materiales que constituyen los msculos, huesos, glndulas, rganos internos, sistema nervioso, sangre y otros lquidos del cuerpo, como as tambin la piel, el cabello y las uas. Son los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la informacin gentica; adems, desempean importantes funciones como la catlisis, la regulacin metablica y los procesos contrctiles (Braverman, 1980; Pennacchiotti, 1998). Adems de su funcin nutricional para cubrir necesidades energticas y de constitucin, las protenas desempean una funcin esencial en la apetencia del alimento, es decir, en sus caractersticas organolpticas (Braverman, 1980; Pennacchiotti, 1998). A partir de esta necesidad, se desarrollaron los procesos necesarios para aislar o extraer las protenas de sus fuentes orgnicas originales. Se obtienen as los denominados aislados proteicos, que constituyen un purificado proteico a partir del alimento o fuente orgnica inicial. De esta manera, se ha llegado a obtener un macronutriente purificado con papel nutricional en la alimentacin propiamente dicha, y con un papel funcional en la elaboracin tecnolgica e industrial de alimentos (Curare, 2006). Entre los alimentos que entregan protenas de alta calidad biolgica (es decir, aportan los aminocidos esenciales) se encuentran la leche, la carne, el pescado y el huevo (3,2; 2023; 15-20 y 13,5%, respectivamente). Sin embargo, los granos de los cereales son una buena fuente de protena para la mayora de la poblacin mundial, siendo consumidos en cantidades relativamente grandes en las zonas sub-urbanas (FAO, 1970). En la bsqueda de nuevas fuentes de alimentos que pudieran servir para solucionar en parte el dficit proteico-calrico, en los aos 60 se inici el estudio de un pseudo cereal denominado quinoa, quinua o quingua. La quinua (Chenopodium

quinoa willd) es un nutritivo pseudocereal que se ha cultivado en forma tradicional en el rea andina desde la poca incsica. Fue ampliamente usado en la alimentacin de los pueblos antiguos de Sudamrica como uno de los alimentos bsicos. Sin embargo, el cultivo de la quinua en el altiplano disminuy despus de la conquista espaola, cediendo el paso a cereales introducidos como el trigo y la cebada (Wahli, 1990).

1.2

Caractersticas de la Quinua La quinua es una planta anual herbcea que alcanza alturas entre uno y dos

metros (ver Figura 1); y que presenta acumulaciones de pequeas semillas en panojas, ubicadas en los extremos superiores de las ramificaciones. Las semillas son bastante pequeas, de alrededor de 1,5 mm de dimetro, aunque es posible encontrar variedades que llegan hasta 4 mm (Junge y Cerda, 1978).

Figura 1: Planta de Quinua (Chenopodium quinoa willd) Desde tiempos ancestrales la quinua se cultiva en la regin del altiplano andino de Amrica del Sur. En la actualidad las mayores reas productivas corresponden a Per y Bolivia, aunque tambin se produce en Colombia, Argentina, Chile y Ecuador. Cabe sealar que es un cultivo que se adapta a condiciones muy variables, pudindose cultivar hasta los 3.900 metros sobre el nivel del mar (CIED, 2006). Por otra parte, y debido a que posee races pivotantes y fasciculadas, se adapta bien al clima fro y a la escasez de humedad, puesto que las races pivotantes aprovechan el agua a mayor profundidad y las races fasciculadas el agua superficial (Fontrbel, 2003).

Es interesante notar que la quinua es una planta de la que se aprovecha todo. Los tallos rojos o amarillos tienen mucha fibra y, como el grano, son buenos para los animales: ganan peso y producen ms leche. Las hojas tiernas de la planta permiten preparar sopas y ensaladas y, tras sacar el grano de las panojas, la cascarilla que envuelve a cada quinua se la quema y, con ella, se elabora la pasa o leja, utilizada en la masticacin de coca (Azcui, 2005). Por otra parte, la quinua es evolutivamente distinta a aquellos cereales que contienen gluten, fraccin txica para los celiacos. En la harina de quinua, muy bajas cantidades de protenas se encuentran como prolaminas (0,8%), mientras que albminas (31%) y globulinas (37%) son predominantes (Berti y col., 2004).

1.2.2 Composicin de la Semilla de Quinua y su Valor Nutricional Tal como se sealara, toda la planta de quinua tiene diferentes usos, sin embargo el producto primario es la semilla (ver Figura 2). Luego que se realizaran anlisis bromatolgicos de la composicin del grano y se divulgara esta informacin, la quinua ha adquirido importancia internacional por ser uno de los pocos alimentos de origen vegetal que es rico en protenas y posee todos los aminocidos esenciales para el ser humano (ver la composicin del grano en la tabla 1). Tambin contiene cidos grasos esenciales como los cidos grasos insaturados, destacando su alto contenido de cido linoleico (50,2-56,1%) y oleico (22,0-24,5%), y moderado de linolnico (5,4-7%) (Walhi, 1990; Ruales y Nair, 1992). Asimismo, la quinua posee un alto contenido de vitaminas del complejo B, C y E, adems de minerales tales como: hierro, fsforo, potasio y calcio. Este ltimo se encuentra en la misma concentracin que en la leche descremada, mientras que el fsforo es cuatro veces ms concentrado que el de sta (Albarrn, 1993).

Figura 2: Semilla de la quinua

Tabla 1: Composicin Proximal de la semilla de quinua Contenido g/100 g de semilla Caloras 331 Humedad 9,8 Protena 13,0* Lpidos 7,4 ENN 64,1** Fibra cruda 2,7 Cenizas 3,0 * N x 5,7 ** Por diferencia
Fuente: Schmidt-Hebbel y col., 1992

El alto valor nutritivo de la semilla de quinua se debe tanto a su composicin qumica, como a la cantidad y calidad de sus protenas, que flucta entre un 12 y 22%.Como se puede apreciar en la tabla 2, los aminocidos que contiene la quinua son en mayor cantidad, cido glutmico, cido asprtico, isoleucina, lisina, fenilalanina, tirosina y valina por unidad de nitrgeno con respecto a otros cereales. Tabla 2: Contenido de aminocidos en el grano de quinua, el trigo y la leche (% de aminocidos/100 g de protenas) Aminocido Quinua Trigo Leche Histidina * 4,6 1,7 1,7 Isoleucina * 7,0 3,3 4,8 Leucina * 7,3 5,8 7,3 Lisina * 8,4 2,2 5,6 Metionina * 5,5 2,1 2,1 Fenilalanina * 5,3 4,2 3,7 Treonina * 5,7 2,7 3,1 Triptofano * 1,2 1,0 1,0 Valina * 7,6 3,6 4,7 Acido Asprtico 8,6 Acido Glutmico 16,2 Cisteina 7,0 Serina 4,8 Tirosina 6,7 Argina * 7,4 3,6 2,8 Prolina 3,5 Alanina 4,7 3,7 3,3 Glicina 5,2 3,9 2,0
Fuente: IESN-Chile, 2001.

La lisina que es uno de los aminocidos ms escasos en los alimentos de origen vegetal, se muestra en la quinua en una proporcin que al menos duplica la contenida en los otros cereales. Esta ha sido la base para considerar el reemplazo de las harinas de trigo con quinua a fin de ofrecer un alimento popular con un mejor contenido de este importante aminocido (Tapia y col., 1979). La distribucin de las protenas entre los diversos tejidos que constituyen el grano no es uniforme, las concentraciones mayores se encuentran en las capas ms externas del endospermo, en la aleurona y en el germen. Tampoco se distribuyen uniformemente los diferentes tipos de protenas, las prolaminas y las glutelinas se encuentran localizadas principalmente en el endospermo; las albminas y globulinas estn en las cubiertas exteriores y en el germen (Primo, 1979). Las mltiples caractersticas de la quinua hacen de ste un alimento natural que ayuda al desarrollo y crecimiento del organismo, es fcil de digerir, no contiene colesterol y por ende no forma grasas en el organismo, forma una dieta completa y balanceada y se presume que ayuda a prevenir enfermedades como la osteoporosis, el cncer de mama, las enfermedades al corazn y otras alteraciones femeninas ocasionadas por la falta de estrgenos durante la menopausia (Zamudio, 2003).

1.2.3 Las Saponinas Las pequeas semillas de quinua estn recubiertas de una delgada membrana o pericarpio que contiene hasta un 4% de saponina, sustancia sumamente amarga y que produce abundante espuma al agitar la semilla en agua (Junge y Cerda, 1978). Las saponinas son sustancias orgnicas de origen mixto, ya que provienen tanto de glucsidos triterpenoides (de reaccin ligeramente cida), como de esteroides derivados de perhidro 1,2 ciclopentano fenantreno. En las formas silvestres y las variedades amargas de quinua, el contenido mximo (aproximado) de saponina es de un 2.8% (aunque el rango es variable de acuerdo a la especie y al ecotipo), valor extremadamente alto comparado con las exigencias actuales del mercado, que fijan como valor lmite 0,05% (Fontrbel, 2003).

Adems del fuerte sabor amargo, se ha descubierto que las saponinas son ligeramente txicas para los animales y el ser humano, y por ello deben ser eliminadas antes del consumo del grano. En el organismo, las saponinas ocasionan dolor estomacal, nauseas, ligera diarrea y problemas en la digestin, puesto que la fase jabonosa producida al mezclarse con el agua y al ser agitada por los movimientos peristlticos de las vsceras, hace que se rompan las fuerzas de tensin superficial de las fases lquidas que intervienen en el proceso de digestin (Fontrbel, 2003). La eliminacin de esta sustancia jabonosa se puede realizar en forma manual (lavando el grano con agua y frotndolo hasta que no salga espuma) o mecanizado (usando una peladora que pasa el grano por paletas friccionndolo contra una malla trenzada) (Seplveda y col., 2004).

1.3

Empleos de la Quinua La quinua se consume como el arroz, en grano; sus hojas tiernas se comen

guisadas como las acelgas y espinacas; su tallo y hojas verdes se aprovechan como ensalada o en sopas. La agroindustria de los pases con las mayores producciones de quinua (entre ellos Bolivia y Per), transforma este grano preferentemente en hojuelas y harina, debido a que la fcula es un excelente alimento panificable. Esta se usa para elaborar panecillos y galletas y para enriquecer harinas de panificacin en la elaboracin de: galletas, barritas, tartas, batidos, pasteles y espaguetis, entre otros. Por otra parte, los granos de segunda clase como los subproductos de la cosecha pueden ser empleados en la alimentacin de monogstricos, aves, cerdos y rumiantes en condiciones especiales (Ccbolgroup, 2006).

1.4

Mercado Nacional e Internacional Bolivia y Per son los mayores exportadores con cerca de un 88% de la

produccin a nivel mundial, le sigue Estados Unidos con un 6%. La produccin en Argentina es usualmente para uso domstico como semilla o harina. Sin embargo y pese a que su origen es sudamericano, la quinua posee un importante potencial

agronmico, debido a que puede adaptarse para producir altos rendimientos bajo condiciones adversas. Es as como algunos pases europeos como Espaa estn estudiando su adaptacin al clima Mediterraneo y otros como Dinamarca y Finlandia estn interesados en su cultivo (Vilches y col., 2003). El consumo en Chile es bajo, comparado con otros alimentos ricos en carbohidratos como: trigo, arroz y maz. Esto se debe a que no se conocen las ventajas nutritivas de la quinua y a que existe una oferta irregular del producto (Seplveda y col., 2004). Sin embargo, existe un mercado creciente del cereal en vas de un amplio mercado exportable. Es as como en julio del 2002, se realiz la primera exportacin de quinua a Estados Unidos. Ese mismo ao, los productores agrupados en cooperativas ofrecan sus volmenes productivos del 2003 a supermercadistas de Canad, Australia, Inglaterra, Espaa, Mxico y Japn; a la vez una cooperativa de la VI Regin suscriba acuerdos comerciales y de marketing con la Sociedad Francesa ABCD, con el objetivo de efectuar una serie de acciones y estrategias destinadas a introducir el uso de quinua chilena en el mercado del Viejo Continente (Diario Pyme, 2003).

1.5

Los Aislados Proteicos y sus Propiedades Se considera aislado proteico aquel cuyo contenido de protenas es mayor al

70%. En l las protenas constituyentes deben ser exactamente las que se encontraban en la fuente orgnica inicial, sin haber sufrido procesos de degradacin o hidrlisis no deseables (Curare, 2006). Los aislados proteicos pueden ser utilizados en la elaboracin de diferentes productos en la industria alimentaria, tales como productos horneados, en la elaboracin de bebidas para deportistas, de embutidos, para la preparacin de alimentos para bebs, por mencionar algunos. Las protenas se usan como aditivos en suplementos nutricionales para mejorar el perfil de aminocidos e incrementar el contenido de protenas, pero tambin para aportar beneficios funcionales como emulsificacin, estabilizacin e incremento de viscosidad, mejoramiento de la apariencia, del gusto, la textura y la absorcin de agua o aceite (Giese, 1994). En este sentido, el estudio de las propiedades funcionales es muy importante para determinar los usos que pueden darse a las protenas y aislados proteicos en

la industria alimentaria. Bsicamente, las propiedades funcionales son aquellas propiedades no nutricionales que son capaces de impartir una caracterstica tecnolgica especfica deseable a un producto dado (Cheftel y col., 1989). Las propiedades funcionales de las protenas, pueden clasificarse en tres grupos principales (Cheftel y col. 1989): Propiedades de hidratacin: dependientes de las interacciones protenaagua. Incluye propiedades tales como la absorcin y retencin de agua, hinchado, adhesin, dispersibilidad, solubilidad y viscosidad. Propiedades texturales: dependientes de las interacciones protena-protena, y que intervienen en fenmenos tales como la precipitacin, la gelificacin y la formacin de estructuras diferentes. Propiedades superficiales: las cuales estn relacionadas con la formacin de emulsiones y espumas. Dentro de las propiedades funcionales que se busca modificar a travs de las protenas se encuentran: solubilidad, absorcin de agua y aceite, comportamiento reolgico, capacidad emulsificante y espumante (Giese, 1994). Existen muchos estudios respecto a aislados proteicos, los que van desde el popular aislado de soja, hasta alimentos menos difundidos como la mucuma (Adebowale y Lawal, 2003). En el caso del aislado de soja, se ha estudiado muy ampliamente cmo modificar sus propiedades funcionales (An y col., 2001). Situacin muy distinta es la del aislado proteico de quinua, en cuyo caso prcticamente no se han reportado publicaciones. De hecho, el estudio de la quinua se ha limitado a la composicin y caracterizacin funcional de la semilla y su harina. En este estudio se obtendr un aislado proteico a partir de quinua orgnica y se investigar las propiedades de hidratacin de las protenas del aislado, las que dependen de las interacciones protena-agua. Especficamente se estudiar la solubilidad y la capacidad de retencin y absorcin de agua. Todo ello con el objetivo de producir conocimiento e informacin que permitan incorporar estas protenas, de alto valor nutricional, en alimentos destinados al consumo humano.

II. HIPTESIS La preparacin de aislados proteicos con caractersticas funcionales conocidas constituye un paso preliminar para la formulacin de alimentos tecnolgicamente funcionales que los incluya como ingredientes. En el caso de los aislados proteicos en general, y en especfico de la qunoa, el conocimiento de dichas caractersticas es posible a travs del discernimiento de la relacin estructura-funcionalidad de las fracciones proteicas, la que se podra determinar por medio del estudio de los cambios estructurales de la protena, frente a distintas condiciones de procesamiento fsicas y/o qumicas.

III. OBJETIVOS 3.1 Objetivo General Obtener un aislado proteico a partir de quinua orgnica y estudiar sus protenas desde el punto de vista estructural y funcional, para producir conocimiento que permita incorporar estas protenas, de alto valor nutricional, en alimentos destinados al consumo humano.

3.2

Objetivos Especficos Obtener un aislado proteico de quinua orgnica. Determinar el contenido de protenas de la harina de quinua, a partir de la cual se obtendr el aislado. Realizar un anlisis proximal y determinar el perfil de aminocidos al aislado proteico. Determinar el contenido de Fitoestrgenos en el aislado proteico, mediante el uso de cromatrografa lquida de alta resolucin (HPLC). Caracterizar los perfiles polipeptdicos de las protenas del aislado de quinua, mediante electroforesis (PAGE). Estudiar los cambios conformacionales de los aislados proteicos a distintos pHs, mediante el uso de tcnicas espectrofotomtricas (UV y fluorescencia). Determinar la estabilidad trmica de las protenas del aislado proteico, mediante la tcnica de calorimetra diferencial de barrido (DSC). Determinar las propiedades funcionales que exhiben las protenas integrantes del aislado proteico de quinua, mediante el estudio de tres propiedades de hidratacin: solubilidad, capacidad de retencin de agua y capacidad de absorcin de agua, a distintos pHs. Analizar las relaciones existentes entre las caractersticas estructurales que exhiben las protenas y sus propiedades funcionales.

10

IV. MATERIALES Y MTODOS 4.1 Materiales

4.1.1 Materia Prima: Quinua orgnica pelada en seco, proveniente de la localidad de La Plaza, comuna de Pichilemu, ubicada en la VI Regin de Chile. La semilla fue proporcionada por el agricultor Crspulo Leiva. 4.1.2 Reactivos Qumicos Acetato de sodio (CH3COONa) Panreac, Barcelona, Espaa Acetonitrilo (CH3CN) Panreac. Barcelona, Espaa cido actico glacial (CH3COOH) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania cido brico (H3BO3) Panreac, Barcelona, Espaa cido clorhdrico (HCl) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania cido orto-fosfrico (H3PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania cido perclrico (HClO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania cido sulfrico (H2SO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Acrilamida (C3H5NO) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Alcohol etlico (Etanol) (C2H60) p.a. Winkler. Mxico Alcohol etlico absoluto (Etanol) (C2H60) tcnico, Comercial Tecnolgica Ltda. Santiago, Chile Antrona (C14H10O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Azul brillante de coomasie G-250 (C47H50N3NaO7S2) Baker. USA Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) Sigma. USA Bis-acrilamida (C7H10N2O2) Sigma. USA -mercapto etanol (C2H6OS) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Cloruro de sodio (NaCl) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Coomassie blue R (C45H44N3O7S2Na) Sigma. USA Dietil etoximetilenmalonato. Fluka. Buchs, Suiza Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Estndar de aminocidos DL-2-Aminobutyric Acid for synthesis, Merck Schuchardt, Alemania

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Estndar de protenas para electroforesis Bio-Rad Precision Plus ProteinTM Catalog 161-0373 N. (con pesos moleculares de: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10). Estndar de Seroalbmina de bovino (BSA). Sigma. USA Estndar de fitoestrngenos Daizenine Genist. Sigma. USA Fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4*H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Glicerol (C3H8O3) Sigma. USA Glicina (C2H5NO2) Sigma. USA Glucosa monohidratada (C6H12O6*H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Hidrxido de sodio (NaOH) tcnico. W&Z Hidrxido de sodio (NaOH) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Indicador fenolftaleina (C20H14O4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Indicador rojo de metilo (C15H15N3O2) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Persulfato de amonio (PSA) ((NH4)2S2O8) Sigma. USA Sodio fosfato bibsico anhidro (Na2HPO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania Sulfato de potasio (K2SO4) p.a. Purom TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethiletilendiamina) Sigma. USA Tris (C4H11NO3) p.a. J.T.Baker. USA

4.1.3 Equipos e Instrumentos Agitador elctrico vortex Thermolyne, tipo 37600 Mixer, modelo N M3761026, serie N 871570819103 Agitador magntico Magnetic Stirrer HI190M Hanna Instruments N S229370 Agitador Heavy Duty KitchenAid Inc. St Joseph, model K5SS, Michigan USA Balanza analtica Precisa 125 A Swiss Quality Balanza granataria AND, modelo EK 120-A Balanza granataria Precisa 1620 D Bao de agua Haake Tipo FK N 751117, fabricado en Alemania Batera de tamices

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Calormetro diferencial de barrido (DSC) Mettler Toledo 822e Cmara de refrigeracin FroLux Campana de extraccin Centrifuga Heraeus Sepatech Suprafuge 22, fabricada en Alemania Conjunto para electroforesis Bio-Rad con kit para preparacin de geles, cuba de corrida y fuente de poder Desecador Destilador Bchi 323 tipo B-323 N1258804, fabricado en Suiza Digestor Bchi 426 tipo B-426RC N 1270878, fabricado en Suiza Espectrofotmetro de fluorescencia Perkin Elmer, modelo LS50B, serie N 32938 L225-0105 Espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11 N BC11 230V,serie NR30031 Espectrofotmetro UNICAM UV/Vis, tipo UV3-200, N UV 3022809, fabricado en Inglaterra Estufa Heraeus Instruments D-63450 Hanau, tipo UT 6200, fabricada en Alemania Estufa Heraeus, tipo KB 600 Estufa Heraeus W.C. Heraeus GMBH Hanau, tipo TU 60/60, N 2760-02, fabricada en Alemania Estufa WTB Binder Tipo 1924090000200 N 940107 73532 Tuttlingen, Alemania Freezer medical Sanyo, modelo MDF-U332, N 606033941, fabricado en Japn Mechero Microcentrifuga HermLe Z160M Hersteller Spintron, fabricada en Alemania Mini secador Spray Dryer B-191, Bchi, fabricado en Suiza Molino de impacto Retsh Muhle GmbH West-Germany, type SR-2 N73454 Mufla Wild Barfiel tipo M254 N c2441557, fabricada en Inglaterra pHmetro microprocesador pH 537 WTW, fabricado en Alemania Placa calefactora Gerhardt Bonn tipo H52 N 443792 Refrigerador Mademsa Evolution 3500 G no frost system Sistema HPLC Merck Hitachi bomba ternaria L6200 con inyector Rheodyne 7725; loop de 20 l, Detector espectrofotomtrico UV-Visible modelo 484 de

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longitud de onda variable, Integrador D-2500; Columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm, con un tamao de partcula de 4 m), acoplado a un computador con el software Clarity versin preliminar 2.4.1.43, con licencia Waters. Termmetro

4.1.4 Insumos y Utensilios Agua destilada y bidestilada Bandejas de acero galvanizado de 30 mallas de 44 cm x 24 cm Bolsas de papel Kraft Cpsula de aluminio Cpsula de porcelana Cubetas para electroforesis Cubetas de cuarzo Cubetas de plstico Esptulas y microesptulas Filtro Millipore membrana 6V (Durapore) Frascos de vidrio Fuentes plsticas Gradillas Guantes Hielo Jeringas desechables Dynatech de 5mL Material de vidrio (buretas, pipetas de aforo, pipetas gravimtricas, matraces erlenmeyer, matraces aforados, matraz kitasato, balones, vaso con doble camisa, dedales, varillas de agitacin, tubos de ensayo con tapa con tefln, varillas de reflujo, etc.) Micropipetas Mortero Nitrgeno Papel absorbente Papel Whatman N1 Parafilm Pinzas

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Plumavit Potes de plstico Rejilla de asbesto Soporte para electroforesis Trpode Tubos de digestin Tubos Ependorf Utensilios de cocina Vidrios para polimerizacin y peineta (plstico dentado)

4.2

Mtodos

4.2.1 Obtencin de la Harina de Quinua Desgrasada Se seleccionaron los granos mediante tamizado, retirndose toda materia extraa. Luego se lavaron con abundante agua corriente y mediante frotacin, con el objetivo de eliminar las saponinas. Dicho proceso se llev a cabo hasta que no se produjo ms espuma, lo cual indica que las saponinas fueron efectivamente retiradas. Posteriormente, se llev los granos a una estufa, a 50 C, hasta alcanzar la humedad de acondicionamiento del grano para la elaboracin de la harina (151%). Para comprobar que se obtuvo la humedad deseada, se extrajo una muestra de 5 g, a la que se le determin humedad por el mtodo rpido, el que consiste en someter la muestra a 156 C, durante 15 min (Pearson, 1970). Luego, se moli los granos usndose un molino de martillo-cuchillo (Retsch tipo SR-2), proporcionado por el laboratorio de Operaciones Unitarias de la facultad. Para desgrasar la harina, sta fue suspendida en hexano en una relacin 1:10. La suspensin se mantuvo durante 24 horas, a aproximadamente 4 C, bajo agitacin continua. Despus, se filtr la harina al vaco con papel Whatman N 1 y se sec a temperatura ambiente hasta la completa eliminacin del hexano. Finalmente se almacen en bolsas de papel Kraft, dentro de un desecador.

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4.2.2 Obtencin del Aislado Proteico de Quinua Se suspendi la harina desgrasada en agua al 10 % p/v. Luego, para solubilizar las protenas, se ajust el pH de la solucin a 9,0, con NaOH 2N, mantenindose a temperatura ambiente y agitacin, por 30 minutos. Posteriormente, se centrifug durante 60 min. a 3.400 rpm a 15 C (ver Figura 3).

Figura 3: Solubilizacin de las protenas a pH 9 (izquierda) y posterior centrifugacin (derecha) Para precipitar las protenas se ajust el pH del sobrenadante, llevndolo a pH 5 (cercano al punto isoelctrico), con HCl 2N. Luego se centrifug a 3.400 rpm por 60 min, a 4 C. Inmediatamente despus, se resuspendi el precipitado para neutralizarlo, usndose para ello NaOH 0,1 N (Martnez, 1997). El secado del aislado se llev a cabo mediante secado spray (mini secador Bchi, B-191), bajo las siguientes condiciones: Temperatura del aire: 120 C Concentracin de la suspensin del aislado: 20% Flujo del aire: 600 Aspiracin: 90% Alimentacin: 15%

Figura 4: Aislado proteico de quinua obtenido a pH 9

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Figura 5: Diagrama de la Obtencin del Aislado Proteico de Quinua a pH 9

Suspensin de la harina de quinua desgrasada en agua al 10 % p/v

Ajuste a pH 9 con NaOH 2N

Agitacin por 30 min a temperatura ambiente

Centrifugacin a 3.400 rpm por 1 h a 15 C

Ajuste del pH del sobrenadante a 5,0 con HCl 2N

Centrifugacin a 3.400 rpm por 1h a 4 C

Resuspensin del precipitado en agua al 20%

Neutralizacin con NaOH 0,1N

Secado spray a 120 C

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4.2.3 Caracterizacin Qumica 4.2.3.1 Composicin Qumica: Se realiz anlisis proximal, lo que comprendi la determinacin del contenido de: a. Protenas. Se determin protenas totales mediante el mtodo de Kjeldahl (Official Method AOAC 920.53, 1995). El mtodo consiste bsicamente en la digestin cida total de las protenas y conversin cuantitativa del nitrgeno a NH3, el que se valora por retrotitulacin. El factor de conversin utilizado tanto para la harina de quinua como para el aislado proteico es 5,77 (Schmidt-Hebbel, 1981). b. Carbohidratos. A travs del mtodo colorimtrico de reaccin de Antrona, el cual implica digerir 1,0 g de muestra con cido perclrico. Posteriormente se procede a una serie de diluciones, para finalmente tomar 1 mL de la solucin la que se hace reaccionar con 5 mL de Antrona. Los almidones hidrolizados, junto con los azcares solubles, se determinaron colorimtricamente mediante espectrofotmetra a una longitud de onda de 630 nm, utilizndose patrones de glucosa de 0,05 y 0,1 mg/mL (Osborne y Voogt, 1986). c. Humedad. Se emple el mtodo gravimtrico propuesto por la AOAC (Official Method 935.29, 1995), lo que implic colocar la muestra en estufa a 105 C, hasta peso constante. d. Cenizas. Se realiz de acuerdo al mtodo oficial de la AOAC (Official Method 923.03, 1995), el cual consisti en calcinar la muestra a 550 C, determinndose gravimtricamente el contenido de cenizas.

4.2.3.2 Perfil de Aminocidos: Se hidroliz las muestras (aproximadamente 2 mg) con cido clorhdrico 6N, durante 24 horas, a 110C. Posteriormente, el cido se evapor a sequedad y los aminocidos se solubilizaron con tampn de borato de sodio 1M (pH 9,0), aforando a 25 mL. Seguidamente, se derivatiz los aminocidos, para lo cual se coloc 5 mL de la solucin anterior en un tubo de ensayo con tapa de tefln ms 4 l de dietiletoximetilenmalonato. La derivatizacin se llev a cabo en un bao de agua a 50C, durante 50 min, bajo agitacin constante.

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Finalmente, 20 l de la muestra derivatizada se inyectaron en un cromatgrafo HPLC con detector UV-Visible Merck Hitachi, modelo 484, longitud de onda 280 nm, acoplado a un computador con el software Clarity versin preliminar 2.4.1.43, con licencia Waters. La resolucin de los derivados de aminocidos se logr usando una columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm, con un tamao de partcula de 4 m) y un sistema de gradiente binario a temperatura ambiente, empleando como fase mvil tampn de acetato de sodio 25mM (pH 6,0) y acetonitrilo, de acuerdo al detalle descrito en el Anexo 4 (Alaiz y col., 1992).

4.2.3.3 Determinacin de Fitoestrgenos: El mtodo utilizado consisti en hidrolizar las muestras (1 g) con 24 mL de cido clorhdrico 1N en bao de agua, a 98C, durante 2 horas. Luego se extrajo los fitoestrgenos con 100 mL de acetonitrilo. Enseguida, se diluy 1 mL del sobrenadante obtenido con 1 mL de agua destilada, dilucin que luego de agitada se filtr, utilizndose para ello una jeringa con porta filtro Millipore. La determinacin de los Fitoestrgenos se realiz mediante cromatrografa lquida de alta resolucin (HPLC Merk Hitachi), utilizando el mismo equipamiento sealado en la seccin 4.2.3.2 y un sistema de gradiente binario de metanol y agua como fase mvil, de acuerdo al detalle descrito en el Anexo 4 (Wang y col., 1990).

4.2.4 Caracterizacin Estructural de las Fracciones Proteicas 4.2.4.1 Perfiles Polipeptdicos: Mediante Electroforesis se analiz y caracteriz los polipptidos que integran el aislado proteico de quinua. Ello fue realizado de acuerdo al mtodo descrito por LaemmLi U. K. (1970), el cual detalla la tcnica PAGE, la que se realiza en funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizado). En la electroforesis nativa (PAGE-nativa), se somete a las protenas a migracin en un campo elctrico. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, su tamao y forma, mientras que en la electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS), la ms comn, las protenas son sometidas a migracin en un campo elctrico en presencia de un detergente aninico, lo que asegura la completa

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desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es proporcional al tamao molecular de la molcula, pero no a su carga. El aislado proteico de quinua fue sometido a ambos tipos de electroforesis, adems de la electroforesis desnaturante con -mercaptoetanol (2-Me). Para la realizacin de estas pruebas se elabor geles de 1 mL de espesor. En el caso de la electroforesis desnaturante, sin y con -mercapto etanol, se us gel concentrador al 5% y gel separador al 12%. Se carg 10 l de muestra y 7 l de estndar. Las masas moleculares de los polipptidos fueron calculadas usando un estndar de protenas con los siguientes pesos moleculares: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10 kDa. En el caso de la electroforesis nativa se us gel separador al 5%, y no se carga estndar (ver el detalle de estos mtodos en el anexo 1).

4.2.4.2 Fluorescencia: Se prepar dispersiones al 1% del aislado proteico en buffer a los siguientes pHs: 3, 5, 7, 9 y 11, en tubos ependorf (ver detalle de los buffer en anexo 3). Posteriormente se someti los tubos a agitacin intensa en vortex, a intervalos de 15 minutos, durante 1 hora, a temperatura ambiente. A continuacin, se centrifug los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15 C. Luego, se midi la absorbancia del sobrenadante a 260 y 280 nm, datos que se utilizaron en la siguiente frmula, para conocer los mg de protena por mL de solucin: Protena = 1,55 * A280 0,76 * A260 [mg/mL] El propsito del paso anterior fue estandarizar la concentracin de las dispersiones de los distintos pHs, diluyndolas, para que todas tuvieran una concentracin de 0,02 mg/mL. Una vez estandarizadas las muestras, se midieron en un espectrofotmetro de fluorescencia (Perkin Elmer, modelo LS50B) con una excitacin de 270-290 nm, para obtener el espectro de emisin en el rango de 300 a 500 nm, con una velocidad de barrido de 300 nm/min (Permyakov, 1993; Mathews y col., 2002; Abugoch, 2006).

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4.2.4.2 Espectroscopia UV: Se prepar diluciones del aislado al 1% en buffers de pHs: 3, 5, 7, 9 y 11 (ver detalle de los buffers en anexo 3). Posteriormente se agit las muestras vigorosamente en vortex cada 15 min, hasta completar 1 hora. Concluida la etapa anterior, se centrifug las muestras por 30min a 10.000 rpm. Para realizar la medicin se diluy 5 veces el sobrenadante obtenido de la centrifugacin (Mathews y col., 2002; Abugoch, 2006). Finalmente, se midi la absorcin de las muestras en el espectrofotmetro UNICAM UV/Vis, efectundose un barrido de longitudes de onda, que cubri desde los 250 hasta los 450 nm.

4.2.4.4 Calorimetra Diferencial de Barrido: Se efectu una caracterizacin trmica de las protenas, para lo cual se prepar dispersiones al 20% con buffer de pH 9 y agua. Se coloc entre15 y 20 mg de dicha mezcla en una cpsula, previamente pesada y tarada la cual se sell y llev al equipo de calorimetra diferencial de barrido (Mettler Toledo 822e). Se trabaj desde los 10 a los 120 C, con un rgimen de calentamiento de 10 C por min. Como referencia se utiliz aislado proteico de quinua con la protena previamente desnaturalizada.

4.2.5 Determinacin de las Propiedades Funcionales 4.2.5.1 Solubilidad: Se prepar dispersiones proteicas al 1% p/v en buffers que cubrieron desde el pH 3 al pH 11 (detalle de las frmulas de los buffers en el anexo 3). Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitacin intensa y breve en vortex a temperatura ambiente, durante 1 hora. En seguida, se centrifugaron los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15 C (Scilingo, 2000). La protena que qued en el sobrenadante se cuantific a travs del mtodo descrito por Bradford, M. M. (1976) (ver detalles de este mtodo en el anexo 2).

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4.2.5.1 Capacidad de Retencin de Agua (WHC): En tubos ependorf, previamente pesados, se elabor dispersiones proteicas al 1% p/v en agua y en buffers de pH: 3, 5, 6, 7 y 9. A continuacin, los tubos se sometieron a agitacin intensa en vortex, a intervalos de 15 minutos, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifugaron los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15C. Luego se determin la masa de precipitado obtenido, para lo cual antes se dej invertidos los tubos durante 10 min sobre papel absorbente. Paralelamente, se cuantific la cantidad de protena solubilizada en el sobrenadante despus de la centrifugacin, lo que se efectu utilizndose el mtodo de Bradford M. M. A (1976) (ver detalles de este mtodo en el anexo 2). La capacidad de retencin de agua, se obtuvo a travs de la siguiente frmula: WHC = m2 (m1 m3) [mL agua / g muestra] m1 * d Donde: m1: masa de muestra pesada en gramos m2: masa del precipitado obtenido en gramos m3: masa de la protena soluble en gramos d: densidad del agua a 25 C

4.2.5.3 Capacidad de Absorcin de Agua (WIC): La WIC es la cantidad mxima de agua que un gramo de aislado es capaz de absorber espontneamente, a una temperatura definida. Para determinarla se utiliz un equipo similar al diseado por Baumann (1967), el que consiste en un embudo buchner conectado, a travs de una manguera flexible, a una pipeta de 1 mL graduada (ver Figura 6). Una vez instalado el equipo, se llen con agua, evitando la incorporacin de burbujas. Luego se coloc el papel filtro dentro del embudo, dejndolo que embebiera agua durante aproximadamente 5 min. Posteriormente, se elimin el exceso de agua sobre el papel filtro, con el objetivo de enrasar a cero la columna de agua en la pipeta. Se verific que la nivelacin del equipo no variara durante un lapso de 10 min, tras lo cual se esparci rpidamente 60 mg del aislado sobre el papel filtro hmedo, para formar una monocapa uniforme. Al mismo tiempo, se

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dispar un cronmetro para realizar mediciones a travs del tiempo, registrndose el retroceso de la columna de agua en la pipeta, hasta que no hubo ms variacin (An y col., 2000).

Figura 6: Esquema del equipo de absorcin de agua Los datos obtenidos se graficaron colocando el tiempo en minutos en el eje de las abscisas y los mL de agua absorbidos por gramo de aislado en el eje de las ordenadas. A partir de l se obtuvo la WIC, el tiempo de equilibrio (te) y la velocidad inicial de absorcin de agua (vi) (Abugoch, 2006). 4.2.6 Anlisis Estadstico Se evalu estadsticamente los resultados obtenidos usando la media aritmtica y la desviacin estndar. Asimismo, se efectu anlisis de varianza, con un nivel de confianza del 95%, para determinar si existen diferencias significativas entre los distintos pHs estudiados. Este ltimo anlisis se llev a cabo emplendose el programa StatGraphics Plus 4.0.

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V. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1

Caracterizacin Qumica del Aislado Proteico de Quinua

5.1.1 Composicin Proximal A partir de harina de quinua desgrasada con 12,7 0,4 % de protena, se obtuvo un aislado proteico con un contenido de protena en base hmeda del 72,5 0,14 %. En la tabla 3 se observa la composicin proximal del aislado. Tabla 3: Composicin proximal del aislado proteico de quinua A9 Componente % Protenas* 77,2 0,15 Humedad 6,1 Hidratos de carbono* 18,8 0,52 Cenizas* 3,0 *En base seca El aislado fue tamizado con el objetivo de determinar el tamao de partcula, establecindose que un 2,73% del aislado se encontr entre 0,25 y 0,5 mm, un 76,6% entre 0,125 y 0,250 mm y un 20,67% present un tamao de partcula inferior a 0,125mm. La actividad de agua (aw), determinada en un equipo Novasina, fue de 0,326, medida a 25 C. El aislado de quinua fue obtenido solubilizando las protenas a pH 9, por lo que en adelante se denominar A9. De esta manera se diferenciar de otro aislado, obtenido en condiciones similares, pero a pH 11 (Silva, 2006) el que se designar como A11. El rendimiento de A9 fue similar al de A11, esto es prximo al 5 %, aunque el contenido de protenas para A11 fue mayor, siendo de un 83,5 %, en base seca. El contenido de protenas tambin fue inferior que el obtenido en aislados de amaranto (otro pseudocereal), en cuyo caso se han reportado contenidos proteicos del 90% (Martnez y An, 1996) y del 84,4%, en condiciones de extraccin muy similares a las de la quinua (Abugoch, 2006).

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5.1.2 Perfil de Aminocidos La composicin en aminocidos es de particular inters para el nutricionista, puesto que el valor nutritivo de una protena depende primariamente de su patrn o perfil de aminocidos (Braverman, 1980). La quinua es reconocida por su alto valor nutritivo, destacndose especialmente su balance aminoacdico. En efecto, la quinua contiene 16 aminocidos, 10 de los cuales son esenciales: histidina, fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptfano, valina y arginina, debiendo ser aportados por la dieta. El contenido de lisina es importante en la harina de quinua, el que duplica el de otros cereales (aminocido principal en legumbres), siendo tambin uno de los aminocidos ms escasos en los alimentos de origen vegetal. La quinua tambin es rica en metionina (aminocido principal en cereales), fuente principal de azufre y necesaria para el metabolismo de la insulina. Asimismo, es alta en arginina y cido glutmico y tiene niveles adecuados de histidina, isoleusina, valina y treonina (Chauhan, 1992; Drzewiecki y col., 2003; Valenzuela, 1997). En la tabla 4 se muestra el contenido de algunos aminocidos presentes en el aislado proteico de quinua A9. Tabla 4: Contenido de aminocidos en aislado proteico de quinua A9 Aminocido g/100 g muestra en base hmeda Acido Asprtico 6,16 0,08 Acido Glutmico 12,67 0,51 Serina 3,98 0,05 Histidina 1,98 0,03 Glicina 4,10 0,11 Treonina 3,34 0,09 Arginina 7,59 0,25 Alanina 2,91 0,07 Prolina 0,004 0,002 Tirosina 2,71 0,05 Valina 3,86 0,08 Metionina 1,68 0,02 Cistina 0,45 0,13 Isoleucina 3,30 0,07 Leucina 5,61 0,13 Fenilalanina 3,43 0,06 Lisina 4,01 0,05 Total 67,80 0,25

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Los valores de aminocidos para la harina de quinua reportados en la literatura difieren de acuerdo a la variedad de quinua estudiada y la cantidad total de protena calculada (Tapia y col., 1979). En la Figura 7 se muestra el contenido promedio de aminocidos, en g/100 g de protena, para tres ecotipos de harinas quinua de la VI Regin (Villarroel, 2005; Gajardo, 2005) y los valores para los aislados de quinua A9 y A11 (Silva, 2006).

20,00 18,00 Contenido (g/100 g proteina) 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
A9 harinas VI Regin A11

Figura 7: Contenido de aminocidos en los aislados A9 y A11 y dos harinas de quinua de la VI Regin, expresados en g/100 g de protena. Se evidencia una leve disminucin en el contenido de algunos aminocidos del aislado A9 en comparacin con los valores promedio para las harinas de quinua orgnica provenientes de la VI Regin. Esto puede atribuirse a la prdida de algunas protenas durante el proceso de elaboracin del aislado, ya sea durante la solubilizacin a pH 9, o en la precipitacin de las mismas a pH 5. No obstante lo anterior, se puede afirmar que el perfil aminoacdico del aislado A9 es muy similar al de las harinas de quinua, por lo que el aislado mantendra las propiedades nutritivas de la quinua. En la tabla 5 se presenta el contenido de los aminocidos esenciales y el patrn de referencia propuesto por la

A Ac sp . G rtic o lu t m ic o Se r H ina ist id in a G li c in tre a on in Ar a gi ni n Al a an in a Ti ro sin a Va li m et na io ni na ci st i Is ol na eu ci n Le a uc Fe in ni a la la ni na Li si na

Ac .

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FAO/OMS, los que corresponden a los requerimientos para nios preescolares entre 2 y 5 aos (FAO, 1970). Tabla 5: Contenido de aminocidos esenciales en el aislado de quinua A9 y patrn de referencia FAO (mg/g protena) Aminocidos Aislado de quinua A9 Patrn FAO/OMS Histidina 19,8 19 Isoleucina 33 28 Leucina 56,1 66 Lisina 40,1 58 Metionina + Cisteina 21,3 25 Fenilalanina + Tirosina 61,4 63 Treonina 33,4 34 Triptfano * 11 Valina 38,6 35 * No determinado Se observa en la tabla 5 que algunos valores de contenidos de aminocidos para el aislado de quinua se encuentran por debajo del patrn de referencia, especialmente la leucina y la lisina, mientras que para los otros aminocidos los valores son muy cercanos o los superan. Por lo tanto, si bien la protena no es completa para el grupo de nios de 2 y 5 aos, grupo que posee la mayor demanda de requerimientos de aminocidos, s lo sera para los adultos los cuales poseen requerimientos bastante inferiores a los de los preescolares.

5.1.3 Contenido de Fitoestrgenos La determinacin de fitoestrgenos en el aislado proteico de quinua mostr su ausencia. Sin embargo tampoco se hallaron estas sustancias en la harina a partir de la cual se elabor el aislado. Cabe sealar que en los tres ecotipos de quinua utilizados anteriormente, tambin procedentes de la VI Regin, se encontr fitoestrogenos del grupo isoflavonas, especficamente Genisteina y Daidzeina (Araneda, 2004), por lo tanto, en estudios posteriores deber determinarse si estos compuestos quedan en el aislado o se pierden en el proceso de extraccin de la protenas. Son conocidas las propiedades benficas para la salud de los fitoestrgenos, los que se han asociado principalmente a una menor incidencia de ciertas

27

patologas,

como

la

enfermedad

cardiovascular

algunos

cnceres

hormonodependientes, sin embargo tambin se ha planteado que su consumo puede producir efectos adversos como interferencia en los procesos reproductivos (Wang y col., 1990), por lo que la posibilidad de obtener aislados proteicos de quinua sin fitoestrgenos no es del todo desfavorable.

5.2

Caracterizacin Estructural de las Fracciones Proteicas

5.2.1 Perfiles Polipeptdicos del Aislado Proteico de Quinua A9 5.2.1.1 Electroforesis Nativa (PAGE-Nativa) En la electroforesis nativa las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Adems se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos (UB, 2006). En la Figura 8 se presenta el gel del aislado proteico de quinua (A9) obtenido en condiciones nativas. En l se visualizan principalmente 3 bandas, dos de ellas (a y b), con menor nivel de migracin, debieran tratarse de protenas de mayor tamao o menor carga negativa, mientras que la tercera banda (c) correspondera a molculas ms pequeas o con mayor carga negativa, lo cual les permiti mayor movilidad en el gel.

Figura 8: PAGE-Nativa de los aislados proteicos de quinua A9 y A11

28

Por otra parte, debido a que la primera banda (a) es de mayor intensidad que las restantes, se prev una mayor concentracin de este tipo de protenas. De acuerdo a lo sealado por Martnez y An (1996), para aislados de amaranto extrados en condiciones similares, dichas protenas con baja movilidad (tanto a, como b), podran corresponder al tipo albminas y globulinas, las cuales estn presentes en la quinua. En condiciones nativas las protenas de quinua estn compuestas principalmente por dos tipos de polipptidos, albminas del tipo 2S y globulinas 11S, ambas estabilizadas por puentes disulfuro, con masas moleculares de 3 - 4 kDa y 7 - 9 kDa (Brinegar y Goundan, 1993; Brinegar y col., 1996). Estos resultados son prcticamente los mismos que los obtenidos por el aislado proteico A11 (Silva, 2006), esto es: el mismo nmero de bandas, con un nivel de movilidad muy similar (ver Figura 8). Por otra parte, en pruebas de electroforesis nativa realizada a muestras de harina de quinua, tambin de la VI Regin (Gajardo, 2005), se obtuvo slo 1 banda y con un alto grado de movilidad (mayor a c, en la Figura 8). En este sentido, podra conjeturarse que en el proceso de obtencin del aislado proteico de quinua hubo agregacin proteica, dando como resultado protenas de mayor tamao y por ende con menor movilidad.

5.2.1.2 Electroforesis Desnaturante (PAGE-SDS) En la electroforesis en gel con detergente SDS, la cadena polipeptdica se despliega y se rodea de molculas de SDS, cargndose negativamente. Dicha carga es proporcional a su longitud, y por lo tanto a su peso molecular, de modo que las molculas migran con movilidades relativas de acuerdo a su peso molecular (Mathews y col., 2002). En la Figura 9, se muestra el gel realizado para el aislado proteico de quinua (A9) en condiciones desnaturantes. En el primer carril, de izquierda a derecha, se observa el estndar de peso molecular; en el siguiente (a) el perfil proteico sin la presencia de -mercaptoetanol (2-Me); mientras que en la ltima lnea (b) se visualiza el perfil polipeptdico en presencia del agente reductor de enlaces disulfuro. Este procedimiento se efecta mediante fuerzas no covalentes. para distinguir entre las subunidades que se mantienen juntas mediante puentes S-S- y las que se mantienen unidas slo

29

Figura 9: PAGE-SDS del aislado A9 (a) sin 2-Me y (b) con 2- Me En lo que respecta a los perfiles sin 2-Me, son 11 las bandas ms intensas, y por lo tanto las protenas presentes en el aislado corresponden en su mayora a dichos pesos moleculares. Las masas moleculares de dichas bandas son: 111,9; 74,9; 52,5; 32,4; 26,7; 19,8; 19,0; 14,8; 14,3; una banda con peso molecular mayor a 250 kDa y una aglomeracin entre 13,1 y 10,9 kDa. Las globulinas tipo 11S se caracterizan por tener dos grupos heterogneos de polipptidos a 30 - 40 kDa (subunidades cidas) y a 20 - 25 kDa (subunidades bsicas), las cuales son ligadas por puentes de disulfuro (Brinegar y Goundan, 1993). Por lo tanto, las bandas de A9 sin 2-Me (ver carril a en la Figura 9), con pesos moleculares de 32,4; 30,3; 22,8 y 20,7 kDa, y que en presencia de 2-Me desaparecen (ver carril b), corresponderan a dichas globulinas. En lo referente a la electroforesis con 2-Me, se aprecian menos bandas y de menores pesos moleculares que sin 2-Me. Con ello se evidencia que las bandas con masas superiores a 15 kDa estn unidas por puentes disulfuro. Los enlaces de dichas protenas (los que ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de la protena intra e intermolecular), en presencia del agente reductor se rompieron para convertirse en protenas de menor peso molecular (ver Figura 9, carril b), especficamente de: 14,8; 12,5; 11,5 y 10,2 kDa.

30

De acuerdo a un estudio de las protenas 2S en quinua (Brinegar y col., 1996), estos polipptidos tienen masas moleculares entre 8 y 9 kDa bajo condiciones reductoras. La banda con masa molecular de 10,2 kDa, en el carril b (ver Figura 9), podra corresponder a este tipo de polipptido, teniendo en realidad masas moleculares un poco inferiores a las entregada por la ecuacin del estndar de protenas.

5.2.2 Fluorescencia El comportamiento de los residuos triptofano, tirosina y fenilalanina puede dar informacin til para caracterizar y detectar modificaciones en protenas. El triptofano cuando es excitado a 295 nm genera fluorescencia que es muy sensible a los cambios en el entorno vecino a l (Royer, 1995). Sin embargo, la intensidad de dicho espectro es mayor que la de fenilalanina y tirosina, los que resultan apagados, de modo que el triptofano se constituye como el fluorfobo dominante. De hecho, la fluorescencia del triptofano persiste aunque el aminocido forme parte de la estructura proteica (Cheftel y col., 1989). En la Figura 10 se presenta el espectro de emisin del aislado proteico de quinua (A9), a distintos pH, con una misma fuerza inica, igual a 0,5. Se grafic el promedio de cada ensayo y su duplicado.

200

Intensidad de fluorescencia

160 120

pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11

80 40 0 305

330

355

380

405

430

455

480

505

Longitud de onda (nm)

Figura 10: Espectros de fluorescencia de A9 en funcin del pH, a una fuerza inica constante igual a 0,5

31

Se aprecia en la figura anterior una clara similitud entre las curvas a pH alcalinos, lo que indicara que la estructura de las protenas del aislado A9 en dichas condiciones no se vera modificada, especialmente entre los pH 7 y 11, en los cuales las curvas son casi coincidentes. Respecto a la intensidad de fluorescencia (ver Figura 11) se observa que stas son mayores a pHs alcalinos, con la excepcin del pH 11, donde la intensidad mxima es prcticamente la misma que a pH 7. Se advierte, adems, que la disminucin de la intensidad de la fluorescencia a pHs cidos (pH 3 y 5) es mayor al incremento de la misma experimentada a pHs alcalinos. Resultados similares se registraron en pruebas de fluorescencia a un aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11) (Silva, 2006) y a aislados proteicos de amaranto obtenidos a pHs 9, 11 y 9-11. Dichas variaciones se pueden atribuir a cambios en el entorno del triptofano inducidos en una misma protena por efecto del pH o a la presencia de distintas especies con diferente contenido de triptofano los que tendran entornos moleculares diferentes (Abugoch, 2006).

Intensidad de Fluorescencia

250,0 200,0

d c c

150,0 100,0 50,0 0,0 3 5 7 9 11

b a

pH

Figura 11: Intensidad de fluorescencia del aislado de quinua (A9) a distintos pHs y a una fuerza inica constante igual a 0,5 En cuanto a los valores de longitud de onda mxima (mx, ver tabla 6) no se observa una tendencia de corrimiento entre los mismos. De hecho, en lo que respecta a los pHs 5 al 11 no existen diferencias significativas entre los valores

32

obtenidos. Slo el espectro correspondiente al pH 3 se aleja de los restantes, con un valor mayor. Tabla 6: Longitud de onda mxima obtenida para el aislado A9 a distintos pHs e igual fuerza inica (0,5) pH Longitud de onda mxima (nm) 3 366,8 0,4a 5 335,5 0,7b 7 334,3 1,1b 9 335,8 1,1b 11 335,3 1,8b Letras distintas indican diferencias estadsticamente significativas, con un nivel de confianza del 95% El estudio de los espectros de fluorescencia que se obtiene de los aislados solubles a distintos pHs ser la resultante de la composicin de las protenas en cada condicin y de la influencia de cada pH sobre su conformacin (Abugoch, 2006). En este sentido, si se compara los resultados anteriores con los del aislado de quinua A11 se aprecia que para ambos la forma de los espectros es similar, lo que podra sugerir que la composicin de ambos aislados es tambin parecida. Sin embargo, las intensidades de los espectros de A9 son mayores que los de A11, lo que indicara que la composicin proteica del aislado A9 posee mayor concentracin de fluorfobos que A11.

5.2.3 Espectroscopia de Absorcin UV Los usos ms comunes en bioqumica de las tcnicas espectroscpicas son los de la espectroscopa ultravioleta. En dicha regin, las protenas absorben intensamente. Las absorciones proteicas ms fuertes se encuentran en dos mrgenes de longitud de onda dentro de las regiones ultravioleta, en la proximidad de 280 y 200 nm. En el margen de 270-290 nm, vemos la absorcin por las cadenas laterales aromticas de fenilalanina, tirosina y triptfano (Mathews y col., 2002). En este estudio se determin el espectro de absorcin entre 250 y 450 nm a los sobrenadantes obtenidos de la solubilizacin del aislado A9 a distintos pHs. En la Figura 12 se haya el promedio de las absorbancias registradas para cada ensayo y su duplicado a los distintos pHs estudiados.

33

2,0

Absorbancia

1,5

pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11

1,0

0,5

0,0 240 280 320 360 400 440 Longitud de onda (nm)

Figura 12: Espectros de absorcin del aislado proteico de quinua (A9), a distintos pHs y una misma fuerza inica (0,5) Tal como se aprecia en la figura anterior, las curvas de los distintos pHs poseen formas levemente distintas, asemejndose entre s las correspondientes a los pHs ms cidos (pHs 3 y 5) y las de los pHs alcalinos (pHs 9 y11), mientras que la del pH 7 difiere de todas ellas. En cuanto a los pHs, se puede ver en el mismo grfico que a pHs alcalinos las curvas se hayan ms elevadas que a pHs cidos, de modo que prcticamente en todo el rango de longitud de onda analizado, a mayor pH aumenta la absorbancia, con la sola excepcin del pH 7, cuyo espectro supera a los de los pHs alcalinos. Los picks encontrados podran ser de globulinas, protenas presentes en la quinua (Tapia y col., 1979), y cuya absorcin se encuentra en el rango de los 260 a 282 nm, de acuerdo a estudios realizados en guisantes (Chavan y col., 2001). En pruebas efectuadas a aislados proteicos de amaranto se visualiza el mismo tipo de curvas, pero con una absorbancia mayor (Avanza y An, 2005). El motivo de esto ltimo radica en que el amaranto posee un mayor contenido de protenas que la quinua (14-19%), y mayor an si se trata de un aislado de protenas, lo que implica que la solucin proteica va a absorber ms energa, por lo cual la absorbancia es mayor (Mathews y col., 2002).

34

5.2.4 Calorimetra Diferencial de Barrido La calorimetra diferencial de barrido (DSC) mide la capacidad calorfica relativa de un sistema determinado cuando sufre una transicin inducida por un cambio trmico, como por ejemplo la desnaturalizacion de una protena. Para ello, se someten dos celdas, una con la muestra y otra con la referencia, a un programa de calentamiento a una velocidad de flujo de calor controlado. Cuando se produce una transicin inducida por la temperatura, la muestra absorbe parte del calor que se le est suministrando a la celda. Como resultado, la clula de la muestra tendra una temperatura algo inferior a la de la celda de referencia, pero el sistema de control del equipo suministra una potencia calorfica adicional para que ambas celdas mantengan la misma temperatura. Esta potencia en exceso es proporcional a la diferencia de capacidades calorficas entre las dos celdas y sus contenidos (Beldarran, 2001). En la Figura 13 se muestra el termograma del aislado de quinua A9 obtenido por DSC.
^exo
mW

A9 en agua 1

05.10.2006 11:37:35

-8.0 A9 en agu a, 05.1 0.2006 11:08: 49 A9 en agu a, 16.4 600 mg -8.5

-9.0

-9.5 Integral -13.50 mJ Peak 98.12 C Left Limit 84.80 C Right Limit 103.44 C Heating Rate 10.00 Cmin^-1

-10.0

-10.5

-11.0

-11.5 55.0 4.5

60.0 5 .0

65.0 5.5

7 0.0 6.0

75.0 6 .5

80.0 7.0

85 .0 7.5

90.0 8.0

95.0 8 .5

100.0 9.0

105.0 9.5

110 .0 10.0

C min

Universidad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fisicas

METTLER TOLEDO STA Re System

Figura 13: Termograma (DSC) de A9 en una suspensin al 20% en agua En el termograma se aprecia una endoterma que denota un cierto grado de estructura de las protenas del aislado suspendidas al 20 % en agua y una temperatura de desnaturalizacin (Td) de la muestra de 98,1 0,1 C. En un ensayo, bajo las mismas condiciones, el aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11) tuvo una endoterma muy pequea, de 1,35 mJ (Silva, 2006), en comparacin con la

35

del aislado A9, cuya endoterma fue de 13,5 mJ, lo que evidencia el efecto de la obtencin de aislados a un pH tan alcalino sobre la estructura de las protenas, al mismo tiempo que corrobora el hecho de que las globulinas presentes en la quinua (Abugoch, 2006; Martnez y An, 1996), al ser extradas a pH 9, mantienen un mayor grado de estructura. Para el aislado de quinua suspendido al 20% en buffer de pH 9, en tanto, la transicin trmica es mayor en comparacin a la estudiada en medio acuoso, con una temperatura de desnaturalizacin (Td) igual a 100,5 5,6 C y una endoterma de mayor rea, en la zona que va desde los 87,2 a 112,9 C, y equivalente a 29,1 mJ (ver Figura 14). Se pudo observar que el aislado de quinua suspendido a pH 9 aumenta el grado de estructura de sus protenas. Situacin similar ocurre con el aislado A11, el que aunque de todos modos se presenta prcticamente desnaturalizado, suspendido en pH 9 muestra una endoterma con un rea mayor que en agua (Silva, 2006).
^exo
mW

A9 pH 9 2

05.10.2006 12:45:24

-0.6

A9 pH 9 2, 05.10 .2006 1 2:44:07 A9 pH 9 2, 17.03 00 mg

-0.8 I ntegral -2 9.11 mJ P eak 104.44 C L eft Lim it 87.16 C R ight Li mit 112.89 C H eating Rate 10.00 Cmin^-1

-1.0

-1.2

-1.4

-1.6

-1.8 65.0 5.5

70.0 6. 0

75.0 6.5

80.0 7.0

85.0 7.5

90.0 8.0

95 .0 8.5

100.0 9.0

10 5.0 9 .5

110.0 10.0

C min

Universidad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fisicas

METTLER TOLEDO STA Re System

Figura 14: Termograma (DSC) de A9 suspendido al 20% en buffer a pH 9 En el anlisis calorimtrico realizado a un aislado proteico de amaranto obtenido a pH 9, y suspendido a distintos pHs, se obtuvo resultados similares a los de A9, con condiciones de mayor termoestabilidad que para el aislado de amaranto obtenido a pH 11 (Abugoch, 2006). En dicho caso, la temperatura de desnaturalizacin de las protenas del amaranto fue un poco mayor a pH 7 que la de

36

A9, de alrededor de 103 C, mientras que a pH 9 la temperatura fue de 100 C, valor casi idntico que el del aislado de quinua A9. 5.3 Determinacin de las Propiedades Funcionales

5.3.1 Solubilidad El uso exitoso de fuentes de protenas vegetales en la formulacin de alimentos depende de las propiedades funcionales de la materia prima. En ese sentido, la baja solubilidad de un aislado proteico evidentemente limita su uso en algunos tipos de productos en la industria alimentaria, pero en otros podra favorecerlos. Sin embargo, esta propiedad puede ser modificada por la influencia de varios factores, como el pH, la concentracin de sal, la constante dielctrica del solvente y la temperatura (Bora y Riveiro, 2004). En la Figura 15 se muestra la curva de tendencia de solubilidad del aislado A9 a distintos pHs, y con una fuerza inica constante de 0,5. En l se evidencia una notoria diferencia de solubilidad entre los pHs ms cidos (pHs 3 y 4), con niveles muy bajos de solubilidad, y los restantes, con valores superiores al 75%. As, la mnima solubilidad se encuentra a pH 3, siendo de 7,6%. Le sigue muy de cerca el pH 4, con 11,3 %. El resto de los pHs, presentan solubilidades que van desde 76,6% a pH 5, llegando a un mximo de 94,6% a pH 11.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

cd b b

de

cd

bc

% Solubilidad

pH

Figura 15: Solubilidad del aislado proteico de quinua A9 a distintos pHs a una fuerza inica constante de 0,5. Letras distintas indican diferencias estadsticamente significativas, con un nivel de confianza del 95%

37

Las variaciones de la solubilidad con el pH, est relacionada con la modificacin de la carga neta de las protenas y por lo tanto con su balance electrosttico; en la zona cercana a su pI la carga neta de las protenas tiende a 0 y la variacin de la solubilidad es mnima debido al aumento de la atraccin entre las molculas. Del lado alcalino al pI las protenas tendrn una carga neta negativa y probablemente mayor que la carga neta positiva que presenta en medio cido, de este modo las fuerzas repulsivas a pHs alcalinos y cidos extremos sern ms importantes que las fuerzas de atraccin aumentando la solubilidad (Abugoch, 2006). En un estudio anterior en que se investig la solubilidad de la harina de quinua en funcin del pH, la curva obtenida describe una U con un mnimo de solubilidad, de aproximadamente el 15%, a pH 6, y un mximo cercano al 50%, a pH 10, aunque a pHs cidos tambin se obtuvo solubilidades medianamente altas, de hecho, a pH 2 la solubilidad fue cercana al 40% (Ogungbenle, 2003). Ello implica que el pI de las protenas de la harina de quinua es el pH 6, superior al pI obtenido para el aislado A9, el que se encontrara prximo al pH 3. Por lo tanto, la aplicabilidad del aislado A9 no es la misma que para las protenas de su harina, puesto que mientras estas ltimas seran apropiadas para bebidas con alta acidez, el aislado sera ms ventajoso en formulaciones de bebidas con pHs iguales o superiores a 5. Siguiendo con lo anterior, debe colocarse atencin en el hecho de que las solubilidades para el aislado A9, en la regin que va desde el pH 5 al 7 (pHs normales en alimentos) son muy superiores a las solubilidades obtenidas por las protenas de la harina de quinua, pues los resultados para el aislado prcticamente quintuplican los de la harina. Estos resultados estaran demostrando que se puede mejorar esta propiedad de la quinua, preparando un aislado proteico. Asimismo, las solubilidades obtenidas son muy superiores a las exhibidas por el aislado de quinua A11. En dicho caso la mxima solubilidad tambin se produjo en la zona alcalina, sin embargo sta fue de slo un 41,4%, a pH 11 (Silva, 2006). El motivo de dichas disconformidades podra atribuirse a diferencias estructurales entre las protenas de los aislados en cuestin. Por otra parte, los resultados son concordantes con los presentados por aislados proteicos de amaranto, en cuanto al aumento de la solubilidad a pHs

38

alcalinos, con la diferencia de que en dicho caso los aislados obtenidos a distintos pHs (9, 11 y 9-11) exhibieron solubilidades inferiores entre los pHs 5 a 8. En efecto, a pH 5 los aislados tuvieron entre un 20 y 30% de solubilidad, mientras que para los pHs 6 a 8 dicha solubilidad se encontr entre un 30 y un 60% (Abugoch, 2006). Esta diferencia con el amaranto (considerado pseudocereal, al igual que la quinua), en la zona de pHs cidos, estara sealando diferencias en los pI de sus respectivas protenas que los componen como aislados. La misma tendencia en su solubilidad la han presentado protenas de otros alimentos. Es el caso del aislado proteico del trigo sarraceno (Tomotake y col., 2002), el que aumenta su solubilidad a pHs alcalinos, alcanzando un mximo de 55%, a pH 10; del aislado proteico de mucuna (Adebowale y Lawal, 2003), con un mximo de solubilidad del 96%, a pH 12; y del aislado proteico de salvado de arroz (Wang y col., 1999), el que present una solubilidad mxima de 82%, a pH 10. Cabe sealar que estos aislados preseen un punto isoelctrico cercano al pH 4, un poco superior al del aislado A9 (prximo al pH 3).

5.3.2 Capacidad de Retencin de Agua La capacidad de retencin de agua de las protenas, WHC, es un ndice importante en la evaluacin del comportamiento de las mismas como ingredientes en productos de panadera, carnes embutidas, salchichas y geles alimentarios. Esta propiedad afecta no slo las condiciones del procesamiento, sino tambin la calidad final de los productos (Abugoch, 2006). En la Figura 16 se muestran los resultados de la capacidad de retencin de agua para el aislado A9, en agua (control) y en buffers de distintos pHs. En la grfica se aprecia que no existen diferencias estadsticamente significativas (p>0,05) entre los diversos pHs, de modo que los valores encontrados van de un mnimo de 2,5 mL/g aislado proteico, a pH 5, hasta un valor mximo de 3,0 mL agua/g aislado, a pH 3.

39

4,0

a a a a a

WHC (ml/g)

3,0 2,0

1,0 0,0 control 3 5 6 7 9

pH

Figura 16: WHC del aislado proteico de quinua A9 a distintos pHs a una fuerza inica constante de 0,5. Letras iguales indican que no existen diferencias estadsticamente significativas, a un nivel de confianza del 95% Estos resultados de WHC para A9 son inferiores a los correspondientes al aislado de quinua A11 (Silva, 2006), los que tampoco presentaron diferencias estadsticamente significativas entre los distintos pHs, con valores entre 3,1 y 4,0 mL de agua/g de aislado. En su conjunto, los datos confirmaran lo sealado por Petruccelli y An (1994), quienes encontraron una relacin inversa entre WHC y solubilidad, de modo que los aislados que presentan alta WHC poseeran mnima solubilidad. Dicha situacin tambin se dio con los aislados de amaranto obtenidos a distintos pHs. La explicacin a las diferencias de WHC entre los aislados, podra atribuirse al mayor nivel de desnaturalizacin de las protenas (Abugoch, 2006) del aislado A11, lo que fue comprobado mediante calorimetra diferencial de barrido. Adems, debe considerarse el hecho obvio de que un aislado ms soluble posee una menor fraccin insoluble capaz de retener agua. En todo caso, los resultados de A9 son superiores a los obtenidos para el aislado de amaranto obtenido a pHs 9 y 11 (de aproximadamente 1,9 mL de agua/g de aislado) y cercanos al aislado de amaranto obtenido a pH 9-11 (con un WHC de 2,9 mL de agua/g de aislado).

40

5.3.3 Capacidad de Absorcin de Agua La capacidad para absorber agua es considerada una propiedad funcional de las protenas, fundamental en alimentos viscosos tales como sopas, salsas, masas y alimentos horneados, productos donde se requiere una buena interaccin protenaagua (Granito y col., 2004). En la Figura 17 se observa la curva de absorcin de agua en funcin del tiempo para el aislado A9. A partir de dicha grfica se obtuvo la capacidad de absorcin de agua (WIC), la que no es ms que el volumen mximo de agua absorbido por gramo de aislado. La WIC para A9 fue de 1,8 0,3 g agua/g aislado. El tiempo para alcanzar la WIC o el equilibrio -esto es, donde el aislado es incapaz de seguir captando agua espontneamente- se denomina tiempo de estabilizacin (te). El te para A9 fue de 3,9 min. Un tercer parmetro cintico es la velocidad inicial (vi) con que el aislado absorbe agua. Dicho valor se obtiene calculando la pendiente del grfico, en los primeros instantes en que aumenta el volumen de agua. Para A9 la vi fue de 1,34 g agua/ g aislado min.

Figura 17: Agua absorbida por el aislado A9 en funcin del tiempo

En pruebas de WIC a aislados proteicos de amaranto los resultados mostraron que cunto ms desnaturalizadas se encontraban las protenas, mayor

41

era la capacidad de imbibicin de agua. Es as como la WIC registrada para el aislado de amaranto obtenido a pH 9 fue de 1,7 mL de agua/g aislado, valor muy cercano al del aislado de quinua A9, e inferior a los aislados de amaranto extrados a pHs 11 y 9-11, que fueron de 2,5 mL de agua/g aislado en ambos casos (Abugoch, 2006). Este efecto estara dado por el incremento de la accesibilidad a las protenas y en consecuencia a los aminocidos polares, los cuales tienen una gran afinidad por el agua, producindose un incremento en la capacidad para absorber agua (Granito y col., 2004). La WIC expuesta por el aislado de quinua A11, el que present una mayor desnaturalizacin en su estructura que el aislado A9, fue mayor a la de A9, alcanzando los 2,8 mL de agua/g aislado (Silva, 2006) lo que ratificara lo expuesto en el prrafo anterior. La velocidad de absorcin de agua para el aislado A9 fue bastante mayor que para el amaranto al mismo pH, el que alcanz slo 0,5 mL agua/g aislado min. Tambin sobrepas al aislado de amaranto a pH 9-11 (0,4 mL agua/g aislado min), acercndose al aislado de amaranto de pH 9-11, el que tuvo una vi de 1,1 mL agua/g aislado min. Fue inferior s al aislado de quinua A11, el que alcanz una vi de 3,5 mL agua/g aislado min. En lo relativo a los tiempos de estabilizacin, el tiempo determinado para A9 fue mucho mayor que para los aislados de amaranto extrados a pHs 9 y 11 (0,9 y 0,6 respectivamente), pero inferior al aislado de amaranto obtenido a pH 9-11, que fue de 5 min. El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio por A11, por su parte, fue de apenas 0,8 min.

42

VI. CONCLUSIONES

A partir del proceso de extraccin de las protenas de la harina de quinua a pH 9, se obtuvo un aislado proteico con un contenido de protenas del 77,2% y un perfil de aminocidos balanceado, muy similar al de la harina de quinua, lo cual podra motivar su empleo como ingrediente en la formulacin de alimentos destinados al consumo humano y, en especial, de alimentos funcionales altamente proteicos. Los estudios de los perfiles polipeptdicos, a travs de la tcnica PAGE, en condiciones nativas y desnaturantes, revel la presencia de protenas del tipo albminas 2S y globulinas 11S, las cuales estn presentes en la quinua. A travs de los estudios espectroscpicos de fluorescencia y UV se evidenci el efecto del pH sobre la estructura de las protenas del aislado, constatndose un efecto mayor a pHs alcalinos que los cambios sufridos a pHs cidos, con diferencias leves entre pHs correspondientes a un mismo grupo (cidos o alcalinos). El aislado present una solubilidad bastante alta, la que aument con el incremento del pH, registrndose valores bastante mayores que para la harina de quinua y semejantes o superiores a los reportados en la literatura para otros aislados proteicos. Esta mayor solubilidad del aislado respecto a su harina, estara dada por la desnaturalizacin de las protenas durante el proceso de obtencin del aislado. La alta solubilidad del aislado lo hace propicio para su utilizacin en la formulacin de sopas y bebidas, enriquecidas en protenas. No se encontr una correlacin entre la capacidad de retencin de agua (WHC) y el pH, y por tanto, con el grado de desnaturalizacin de las protenas. De todos modos, los valores obtenidos son apropiados para la elaboracin de productos de panadera, embutidos y geles alimentarios, entre otros.

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El nivel de capacidad de absorcin de agua (WIC) del aislado es apropiado para el desarrollo de productos deshidratados y alimentos viscosos en general. A partir de los resultados de solubilidad se puede presumir una alta capacidad espumante en el aislado, debido a que ambas propiedades seran directamente proporcionales. Dicha capacidad se evidenci a travs del manejo del aislado, pero deber ser evaluada en estudios posteriores. Asimismo, se vislumbra la necesidad de estudiar otras propiedades funcionales, como las propiedades texturales, y de investigaciones centradas en el aspecto tecnolgico de la obtencin de aislados proteicos de quinua a nivel industrial, que permitan la obtencin del aislado con mayores niveles de rendimiento.

44

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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ANEXOS

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ANEXO 1 Mtodos Electroforticos para la Caracterizacin de los Perfiles Polipeptdicos

Reactivos: Tampn de carga (pH 8,3): disolver 3,0 g de Tris, 14,4 g de glicina y 1,0 g de SDS en un litro de agua destilada. En la preparacin del buffer nativo no incorporado SDS. Buffer del gel de concentracin (pH 6,8): disolver 6,0 g de Tris y 0,4 g de SDS en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL. En la preparacin del buffer nativo no incorporar SDS. Buffer del gel de separacin (pH 8,8): disolver 18,2 g Tris y 0,4 g de SDS en 40 mL de agua destilada. Ajustar con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL. En la preparacin del buffer nativo no incorporar SDS. Solucin de persulfato de amonio: disolver 200 mg de persulfato de amonio en 2 mL de agua destilada, eliminar el gas de la solucin y congelar en pequeas alcuotas. Esta solucin permanece estable por aproximadamente cuatro aos. Solucin colorante: disolver 1,25 g de Coomassie Blue R en 227 mL de metanol y 46 mL de cido actico glacial. Completar con agua destilada a 500 mL. Solucin decolorante: mezclar 70 mL de cido actico glacial, 300 mL de etanol y completar el volumen a 1 litro con agua destilada. Solucin acrilamida / Bis-acrilamida: disolver 30 g de acrilamida y 0,8 g de bis-acrilamida en 100 mL de agua destilada. Almacenar en frasco oscuro a 4 C. Buffer de muestra desnaturante con -mercapto: mezclar 2,5 mL buffer de gel de concentracin (pH 6,8), 1,2 g de SDS, 4 mL de glicerol, 2 mL de mercapto y punta de esptula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL. Buffer de muestra desnaturante: mezclar 2,5 mL buffer de gel de concentracin (pH 6,8), 1 g de SDS, 0,4 g de sacarosa y punta de esptula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL.

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Buffer de muestra nativa: mezclar 4 mL buffer de gel de concentracin (pH 6,8) (nativo), 4 mL de glicerol y punta de esptula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL. TEMED Agua destilada Butanol Estndar de peso molecular Alcohol Procedimientos: Preparacin de las Muestras para Electroforesis (PAGE) Pesar 20 mg de muestra en un tubo ependorf Agregar 200 ul de solucin nativa, desnaturante o desnaturante con mercapto, segn corresponda. Agitar breve e intensamente en vortex a intervalos de 5 minutos, durante 15 minutos. Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos, a 10.000 rpm. Recolectar el sobrenadante en otro tubo ependorf. Almacenar los tubos en congelador hasta llevar a cabo la electroforesis. Cuando se desee ocupar las muestras, calentarlas durante 1 minuto en agua hirviendo (esto se hace slo con las muestra desnaturantes), insertando los tubos en plumavit para que floten. Procedimiento para Electroforesis Nativa (PAGE-nativa) Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias. Para ello, las placas deben lavarse con detergente, enjuagarse con abundante agua destilada y por ltimo ponerles alcohol y secarlos con toalla nova. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que queden derechos y fijos al soporte. Preparar gel al 5 %, mezclando: 2.653 l de agua destilada, 1.750 l de acrilamida/bisacrilamida (A/BA), 1.820 l de buffer a pH 8,8, 70 l de PSA al 10% y 7 l de TEMED, con agitacin.

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Colocar la mezcla en seguida entre los vidrios, con la ayuda de una micropipeta (hasta que rebalse). Usando guantes colocar el peine, procurando que no queden burbujas. Esperar hasta que gelifique por completo. Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del equipo Bio-Rad, con el peine hacia adentro. Retirar el peine y cargar cuidadosamente las muestras con la ayuda de una micropipeta. Llenar la cubeta con el tampn de carga (pH 8,3). Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder. Programarla a 200 voltios por aproximadamente 40 minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el borde inferior del gel. Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida. Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una esptula o con las manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que contenga solucin colorante, idealmente de un da para otro. Retirar la solucin colorante y adicionar solucin decolorante. Cambiar la solucin a medida que se va tornando azulada. Esta solucin puede ser reaprovechada adicionndole carbn activado y filtrndola. Procedimiento para Electroforesis Desnaturante (PAGE-SDS) Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que queden derechos y fijos al soporte. Preparar el gel separador al 12 %, mezclando: 1.091 l de agua destilada, 2.004 l de A/BA, 1.300 l de buffer a pH 8,8, 50 l de SDS al 10%, 50 l de PSA al 10% y 5 l de TEMED, con agitacin. Colocar en seguida 3,5 mL del gel separador entre los vidrios, con la ayuda de una micropipeta. Cubrir la superficie con agua saturada con butanol, la que debe ser adicionada lentamente. Esperar a que la solucin gelifique por completo, lo cual se evidencia por la formacin de una lnea divisoria ntida entre el gel y el agua con butanol.

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Sacar los vidrios del soporte y retirar la capa de agua saturada con butanol, lavando con abundante agua destilada. Secar entre los vidrios con papel absorbente. Preparar gel de concentracin al 5 %, mezclando: 1.050 l de agua destilada, 250 l de A/BA, 190 l de buffer a pH 6,8, 15 l de SDS al 10%, 15 l de PSA al 10% y 1,5 l de TEMED, con agitacin. Colocar en seguida 1,5 mL (o hasta que rebalse) gel concentrador entre los vidrios (sobre el gel separador), con la ayuda de una micropipeta. Usando guantes colocar el peine, procurando que no queden burbujas. Esperar a que el gel concentrador gelifique por completo. Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del equipo Bio-Rad, con el peine hacia adentro. Continuar el procedimiento de igual forma que para electroforesis nativa.

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ANEXO 2 Mtodo de Bradford Reactivos: Solucin estndar de protena (BSA): Pesar en balanza analtica 10 mg exactos de albmina de bovino, completar con 990 l de agua destilada y disolver completamente. Luego, colocar 100 l de esta solucin y colocarla en un tubo ependorf. Diluir agregando 900 l de agua destilada. Agitar en vortex, etiquetar y congelar hasta el momento de su utilizacin. Reativo de Bradford: disolver 100 mg de azul brillante de coomasie G-250 en 50 mL de etanol al 95 %. Agregar 100 mL de cido fosforico al 85% (p/v), diluir a un volumen final de 1 l. Agitar al menos 2 horas tapado y cubierto de la luz. Filtrar con papel Whatman N1, usando plegado mltiple. Almacenar en frasco mbar protegido de la luz. Agua destilada o buffer del pH que corresponda Procedimiento: Curva de Calibracin Comprobar la concentracin del estndar de protena (BSA), leyendo a 280 nm, y usando como blanco agua destilada. El valor obtenido se divide por 0,63 y este resultado da la concentracin exacta del estndar, en mg/mL. En cada tubo agregar las cantidades de estndar de albmina y agua destilada de acuerdo a la tabla que se presenta a continuacin. Dejar reposar por 5 minutos y agregar el reactivo de Bradford. Luego, agitar en vortex y esperar 10 minutos antes de leer las muestras en el espectrofotmetro. La lectura debe realizarse a 595 nm. Tubo Estdar BSA (l) Agua destilada o buffer (l) Reactivo de Bradford (l) 1 0 50 1500 2 10 40 1500 3 20 30 1500 4 30 20 1500 5 40 10 1500 6 50 0 1500

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Dibujar la curva de calibracin, con la cantidad de BSA en el eje de las abscisas y la absorbancia, en el eje de las ordenadas. Preparacin de las Muestras Estimar el porcentaje de protenas aproximado que se espera en el sobrenadante de la muestra, para caer en el rango de la curva del estndar (entre 1 y 40 l de protena). Tomar entre muestra y solvente 50 l, agregando en tubos ependorf el solvente que corresponda segn el anlisis a efectuar (agua destilada o buffer al pH que corresponda). Agitar y dejar reposar 5 min. Agregar 1.500 ul de reactivo de Bradford y dejar reposar durante 10 min. Leer las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 595 nm, usando para ello cubetas plsticas. Para conocer la cantidad de protena en la muestra interpolar en la curva de calibracin, la que debe realizarse en paralelo con la medicin de la muestra.

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ANEXO 3 Preparacin de los Buffers

Buffer pH 3,0: 4,2028 g de cido ctrico monohidratado ms 0,4 g de hidrxido de sodio y 2,34g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 4,0: 4,2028 g de cido ctrico monohidratado ms 0,92 g de hidrxido de sodio y 1,4 g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 5,0: 4,2028 g de cido ctrico monohidratado ms 1,3 g de hidrxido de sodio y 0,29 g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 6,0: 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1M ms 5,6 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 1,3 g de cloruro de sodio. Buffer pH 7,0: 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1 M ms 29,1 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 1,85 g de cloruro de sodio. Buffer pH 8,0: 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1 M ms 46,7 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 1,88 g de cloruro de sodio. Buffer pH 9,0: 50 mL de brax 0,025 M ms 4,6 mL de cido clorhdrico 0,1 M y 2,26 g de cloruro de sodio. Buffer pH 10,0: 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M ms 10,7 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 1,57 mL de cloruro de sodio. Buffer pH 11,0: 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M ms 22,7 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 1,85 g de cloruro de sodio. Se adicion cloruro de sodio a los buffer para que todos tuvieran una fuerza inica idntica, de 0,5.

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Anexo 4 Gradientes de Concentracin de Fase Mvil para HPLC

Perfil de Aminocidos: Tiempo % Acetato de Sodio % Acetonitrilo (min) (pH 6) 0,0 92 8 3,0 88 12 6,0 86 14 22 79 21 30 69 31 40 92 8 Con un flujo de 0,9 mL/min

Determinacin de Fitoestrgenos: Tiempo % Agua % Metanol (min) 0,0 60 40 20 25 75 21 60 40 35 60 40 Con un flujo de 0,7 mL/min

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