3.

Protenas

Faremos uma breve introduo sobre protenas usando os livros textos que constam nas referncias: Lehninger et al., 1993; Stryer, 1995 e Dose, 1982.

3.1 Estrutura de Protenas Em animais superiores, as protenas so os compostos orgnicos mais abundantes, representam cerca de 50 % do peso seco dos tecidos. Do ponto de vista funcional, seu papel fundamental, no existindo processo biolgico que
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no dependa da presena ou da atividade deste tipo de biomolcula. As protenas desempenham inmeras funes distintas, como por exemplo: enzimas, hormnios, protenas transportadoras, anticorpos e receptores de muitas clulas. Todas as protenas contm carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio e muitas possuem enxofre. H variaes na composio de diferentes protenas, porm a quantidade de nitrognio, representa, em mdia, 16 % da massa total da molcula. Dessa forma pode-se calcular a quantidade aproximada de protena em uma amostra medindo-se a quantidade de nitrognio da mesma. As protenas so molculas polimricas de grande tamanho, pertencendo categoria das macromolculas, constitudas por um grande nmero de unidades monomricas estruturais os aminocidos que formam grandes cadeias. Devido a esse grande tamanho, quando so dispersas em um solvente adequado, formam solues coloidais, que possuem caractersticas especiais que as distinguem das solues de molculas pequenas. Por meio da hidrlise podemos cliv-las em seqncias menores de aminocidos, pois centenas ou milhares de aminocidos podem participar na formao de uma grande molcula polimrica de uma protena. As protenas so formadas atravs de ligaes peptdicas entre os diversos tipos de aminocidos e podemos classific-las em duas grandes categorias:

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Protenas globulares: so protenas em que as cadeias de aminocidos se voltam sobre elas mesmas, formando um conjunto compacto que tem forma esferide ou elipside, em que os trs eixos da molcula tendem a ser de tamanhos similares. Em geral, so protenas de grande atividade funcional, como por exemplo, as enzimas, os anticorpos, os hormnios, a hemoglobina; so solveis em meios aquosos.

Protenas fibrosas: so protenas em que as cadeias de aminocidos se ordenam de maneira paralela, formando fibras ou lminas estendidas, nas quais o eixo longitudinal predomina sobre os transversais. Em geral, so pouco solveis em gua e participam na formao de estruturas de sustentao, como as fibras do tecido conjuntivo e outras formaes de tecidos de grande resistncia mecnica.

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A estrutura molecular das protenas muito complexa, por essa razo conveniente dividi-la em nveis distintos de organizao:

Figura 3.1

Nveis de organizao da estrutura molecular de uma protena.

Estrutura primria: refere-se ao nmero e identidade dos aminocidos que compem a molcula e ao ordenamento ou seqncia dessas unidades na cadeia polipeptdica. A unio peptdica somente permite a formao de estruturas lineares e por isso, as cadeias no apresentam ramificaes.

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Estrutura secundria: a medida que o comprimento das cadeias vai aumentando e em funo das condies fsico-qumicas do meio, se cria a estrutura secundria, que a disposio espacial regular, repetitiva, que a cadeia polipeptdica pode adotar, geralmente mantida por ligaes de hidrognio. Podemos ter:

a) Hlice-alfa: as cadeias de aminocidos tm vrios centros polares e, devido a isto, a fibra enrola-se dando lugar a uma hlice que se estabiliza formando ligaes intramoleculares com pontes de hidrognio.

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Figura 3.2

Exemplo de uma estrutura do tipo hlice-alfa.

b) Folha-beta: as cadeias de peptdeos se unem formando filas paralelas que se estabilizam de maneira intermolecular mediante pontes de hidrognio.

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Figura 3.3

Exemplo de uma estrutura do tipo folha-beta.

Estrutura terciria: a estrutura da maioria das protenas globulares, aparece a partir das hlices, que voltam a enrolar-se. uma estrutura tridimensional completa que forma-se a partir das foras de atrao ou repulso eletrosttica, das pontes de hidrognio, das foras de Van der Waals e das pontes dissulfeto existentes entre os resduos de aminocidos que formam as cadeias.

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Figura 3.4

Exemplo de estrutura terciria de uma protena.

Estrutura quaternria: so estruturas de carter oligomrico, que esto compostas por vrias molculas separadas, mas entrelaadas em estrutura terciria. Se aplica somente a protenas constitudas por duas ou mais cadeias polipeptdicas e se refere a disposio espacial dessas cadeias e as ligaes que se estabelecem entre elas pontes de hidrognio, atraes eletrostticas, interaes hidrofbicas, pontes dissulfeto entre cistenas de cadeias diferentes. Um exemplo deste tipo de estrutura a hemoglobina que composta por quatro subunidades semelhantes mioglobina.

3.2 Albumina e Insulina Albumina srica uma das protenas mais estudadas e a mais abundante no plasma com uma concentrao tpica de 5g / 100ml. Muitos pesquisadores tm estudado a estrutura e as propriedades da albumina srica e suas interaes com

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outras protenas com o intuito de compreender todas as suas funes no organismo (Friedli, 2005). A albumina srica a mais abundante protena no sistema circulatrio e contribui em 80% para a manuteno da presso osmtica do sangue. tambm um dos principais responsveis pela manuteno do pH do sangue. Nos mamferos, a albumina sintetizada inicialmente como preproalbumina pelo fgado. Aps a remoo do peptdeo sinal, tem-se a proalbumina que ser modificada pela remoo de seis resduos de propeptdeo do novo terminal N. A albumina enviada para a circulao sangnea possui uma meia-vida de 19 dias. Como a albumina sintetizada no fgado, a diminuio de sua quantidade no plasma pode ser produto de uma doena heptica, mas tambm pode ser o resultado de uma doena renal que permita que a albumina escape pela urina. Sua diminuio pode tambm estar relacionada a desnutrio ou uma dieta pobre em protenas.
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Existem resultados contraditrios e muitas discusses sobre a determinao da estrutura da albumina, porm com base em experimentos de hidrodinmica e espalhamento de raios-X, a albumina srica aproxima-se de um elipside de 140 x 40 Angstrons com trs domnios homlogos. Albuminas so caracterizadas por conterem um nmero pequeno de resduos de triptofano e metionina e um alto nmero de cistina e aminocidos carregados, cidos asprtico e glutmico, lisina e arginina. O contedo de glicina e isoleucina menor que a mdia encontrada em protenas. Tanto a albumina bovina (BSA) quanto a humana (HSA) possuem apenas um resduo de cistena livre, Cys34. Os outros formam 17 pontes dissulfeto ajudando a manter a estrutura terciria. A albumina bovina (BSA) possui 2 resduos de triptofano, Trp134 e Trp212 e a humana (HSA) apenas um, Trp214. A Fig. 3.5 abaixo mostra a estrutura de cadeias de duas molculas de HSA (PDB, 1BM0), onde os resduos Cys34 e Trp214 aparecem como esferas.

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Figura 3.5
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Estrutura quaternria da HSA com os resduos de cistena e triptofano

em destaque. (Construda a partir das coordenadas 1BM0, disponveis no PDB, Protein Data Bank)

Talvez, a mais interessante propriedade da albumina seja sua capacidade de ligar-se reversivelmente a uma grande variedade de ligantes. A albumina a principal transportadora de cidos graxos, que so insolveis no plasma sangneo. Tambm possui muitas outras funes, como seqestrar radicais livres de oxignio e inativar vrios metablitos lipoflicos txicos como a bilirrubina. A albumina tem uma grande afinidade por cidos graxos, hematina, bilirrubina e por pequenos compostos aromticos negativamente carregados. Forma ligaes covalentes com fosfato piridoxil, cistena, glutationa e vrios metais como cobre, nquel, mercrio, prata e ouro. No plasma circulante, aproximadamente 30 % dos grupos SH livres, Cys34, so oxidados por cistena e glutationa. Como a albumina uma protena transportadora multifuncional, acredita-se que ela possa ser uma transportadora ou reservatrio de xido ntrico, e possa estar relacionada com importantes processos fisiolgicos ainda no compreendidos envolvendo o NO. A insulina uma protena composta de duas cadeias polipeptdicas, chamadas de cadeia A e cadeia B. As cadeias A e B so mantidas unidas por duas pontes dissulfeto; h uma outra ponte dissulfeto no interior da cadeia A. No h

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cistena livre. Na maioria das espcies, a cadeia A consiste de 21 resduos de aminocidos e a cadeia B, de 30. Na molcula de insulina no h resduos de triptofano. A Fig. 3.6 mostra a estrutura de cadeias de duas molculas de insulina (PDB, 1GUJ), onde os resduos de cistena formam pontes dissulfeto, esto apresentados na estrutura esfera-basto.

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Figura 3.6

Duas molculas de insulina com as pontes dissulfeto em destaque.

(Construda a partir das coordenadas 1GUJ, disponveis no PDB, Protein Data Bank)

Apesar da seqncia de aminocidos da insulina variar entre espcies, certos segmentos da molcula so altamente conservados, incluindo as posies das trs pontes dissulfeto, os finais da cadeia A e os resduos C-terminal da cadeia B. Estas similaridades na seqncia de aminocidos da insulina levam a uma conformao tridimensional que muito parecida entre as espcies. Dessa forma uma molcula de insulina de um animal tem uma atividade biolgica muito semelhante quando inoculada em outro animal de espcie diferente. Por isso, a insulina do porco foi muito usada no tratamento de pacientes humanos diabticos. O nvel de glicose sangnea nos mamferos controlado principalmente por dois hormnios proticos produzidos no pncreas pelas ilhotas de Langerhans: a insulina e o glucagon. A funo da insulina estimular a entrada de glicose do sangue para o interior das clulas sempre que houver hiperglicemia, como aps as refeies. A ligao da insulina aos seus receptores na membrana da clula, desencadeia uma srie de reaes bioqumicas em cascata, fosforilaes e desfosforilaes a partir do receptor de tirosina cinase, que aumentaro o nmero

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de receptores de glicose na membrana da clula, conhecidos como receptores GLUT. J o glucagon estimula a liberao de glicose especialmente no fgado e no tecido adiposo em casos de hipoglicemia, como nos intervalos entre as refeies. Os indivduos que no produzem insulina suficiente para o controle da glicemia sangnea so portadores de diabetes do tipo 1 juvenil e dependem da administrao de insulina. Os portadores de diabetes tipo 2 em geral so adultos que produzem insulina em quantidade suficiente ou aumentada, mas suas clulas no so sensveis a ela. Atravs do trabalho de Frederick Sanger, a insulina foi o primeiro hormnio peptdico a ter sua seqncia de aminocidos conhecida (Miranda e Loffredo, 2005).

3.3 Modificao de Protenas por xidos de Nitrognio

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Em clulas, os principais alvos de espcies reativas derivadas de xido ntrico so protenas e resduos de aminocidos que contm cistena e tirosina. Stamler at al. (1992) demonstraram que protenas S-nitrosiladas so formadas sob condies fisiolgicas e possuem efeitos de vasodilatao e inibio plaquetria. Essas observaes sugeriram que grupos S-nitrosotiis pertencentes a protenas podem servir como intermedirios no metabolismo celular do NO e apresentam a possibilidade de um mecanismo celular adicional regulatrio. Usando BSA e NaNO2 em meio cido e espectroscopia de absoro, esses autores obtiveram a confirmao da formao de S-nitrosotiis em protenas. Nitrito de sdio (NaNO2) em meio cido (HCl) produz HNO2 e pequenas quantidades de N2O3 e NOCl, todos agentes de nitrosao. S-nitrosothiols podem ser facilmente sintetizados em laboratrio pela reao entre tiis e cido nitroso (formado por nitrito em HCl, por exemplo). HNO2 + RSH RSNO + H2O. Esse caminho no ocorre em pH fisiolgico e relevante em condies de acidez extrema (pH < 3). No laboratrio este mtodo adequado para tiis de pequena massa molecular, como glutationa e cistena, mas no protenas por causa da desnaturao cida e porque outros grupos funcionais, como aminas, lcoois e aromticos, so susceptveis a modificaes por nitrito acidificado (Hogg, 2002). Para sntese de S-nitrosotiis de protenas, um mtodo mais adequado envolve a

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transferncia espontnea do grupo nitroso de um S-nitrosotiol de baixa massa molecular. No entanto, essa reao reversvel, sendo a constante de equilbrio ~1. S-nitrosotiis possuem dois picos de absoro mxima, um na regio de 320-360 nm e outro muito menor em ~ 550 nm. Para S-nitroso BSA, foram obtidos picos em 335 e 545 nm com coeficientes de absoro molar de 3869 M1. cm1 e 47 M1. cm1 , respectivamente (Stamler et al., 1992). Zhang et al. (1996) estudaram a nitrosao da BSA com NaNO2 em meio cido em comparao com a nitrosao de carboximetil-BSA, em que o grupo tiol est covalentemente ligado. Obtiveram resultados que indicaram que outros grupos alm de cistena estavam reagindo com HNO2 e formavam cromforos com espectro de absoro semelhante ao de S-nitrosotiis. Atravs de medidas espectrofotomtricas de 16 modelos de dipeptdeos, que continham o resduo de glicina e mais um resduo varivel, mostraram que o dipeptdeo glicina-triptofano
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era o nico que apresentava significativa nitrosao nestas condies e que o grupo NO ligava-se ao nitrognio do anel indol do triptofano. Comparando estes resultados com os obtidos para BSA nativa e bloqueada concluram que resduos de triptofano eram nitrosados nesta protena, e no apenas resduos de cistena. Rassaf et al. (2002) mostraram a presena concomitante de protenas do tipo N-nitroso e S-nitroso no plasma humano. Usando quimioluminescncia em fase gasosa e cromatografia lquida, mediram os nveis basais no plasma de metablitos relacionados ao NO em 18 voluntrios saudveis. Eles descobriram que em adio aos produtos oxidativos do metabolismo do NO, nitrito (0,20 + 0,02 M) e nitrato (14,4 + 1,7 M), o plasma humano mdio contm aproximadamente 5 vezes mais concentraes de espcies de N-nitroso (32,3 + 5,0 nM) que S-nitrosotiis (7,2 + 1,1 nM). As quantidades de N-nitroso e Snitroso aparecem associadas com fraes de albumina, mostrando a presena de um composto formado por uma molcula de alto peso molecular do tipo N-nitroso na circulao humana, levantando a questo sobre sua origem e potencial papel fisiolgico. Harohalli et al. (2002) estudaram os padres de liberao de NO em BSA e HSA nitrosadas e os compararam a vrias formas de HSA mutantes recombinantes nitrosadas. Todas as espcies de albuminas foram nitrosadas com

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NO2 em meio cido. Eles encontraram padres de liberao de NO a partir de BSA nitrosada de acordo com artigos anteriores que indicam que Cys-34 o principal alvo de nitrosao, porm em HSA nitrosada o principal alvo de nitrosao foi um resduo de aminocido diferente de Cys-34. Utilizando as diferentes espcies recombinantes de HSA nitrosadas produzidas concluram que o Trp-214 o principal alvo de nitrosao em HSA. Mutaes em Trp-214 levaram a um aumento na nitrosao de Cys-34, indicando uma possvel competio entre estes dois resduos para reao com N2O3, a espcie reativa de nitrosao formada em solues aquosas cidas de NO2. Os valores mdios de tempo para triptofano nitrosado foram determinados a partir das medidas de NO liberado na ausncia de Hg2+. Os autores encontraram 141 + 3 min para a BSA e 127 + 3 min para HSA, ambas comerciais (Sigma). Kirsch et al. (2003) estudaram a N-nitrosao de derivados de triptofano
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com o N terminal bloqueado na presena de sistemas geradores de N2O3, como os doadores de NO na presena de oxignio em pH 7,4. Nessas condies, a Nnitrosao de N-acetil-triptofano e lisina-triptofano-lisina foi
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provada,

respectivamente, por espectroscopia UV-vis e por espectrometria

N NMR. Os

dados dos autores mostraram conclusivamente que N2O3 provoca a nitrosao da funo amina secundria (Nindol) do anel indol do triptofano N-bloqueado com alta reatividade em valores de pH fisiolgicos. Noble e Williams (2000) estudaram a formao e as reaes de protenas do tipo S-nitroso. A nitrosao da BSA por cido nitroso ocorre em dois estgios: um rpido, consistente com uma reao de S-nitrosao da unidade de cistena livre, seguido de um lento, que consistente com uma reao de N-nitrosao de um resduo de triptofano. Os autores obtiveram resultados de cintica qumica para ambos estgios que sugerem, em teoria, que protenas do tipo S-nitroso podem atuar como reservatrio de NO. Suzuki et al. (2004) realizaram experimentos sobre reaes de peroxinitrito e outras espcies reativas de nitrognio com N-acetil-L-triptofano sobre vrias condies e mostraram que resduos de triptofano podem ser nitrados, nitrosados e oxidados por espcies reativas de nitrognio, necessitando de estudos posteriores para correlacionar perda de funo de protenas e tipo de modificaes sofridas nos resduos de triptofano.

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