PESQUISA

Copigmentao de Antocianinas
aninas aciladas presentes em alguns vegetais, que mantm a colorao estvel numa faixa de pH entre 2,0 e 4,0, bem como a possibilidade de formao de complexos antocianinas-flavonides no antocinicos, trazem novas perspectivas para o uso desses corantes naturais nos alimentos processados.

Dr. Prof. Titular da Universidade Federal de Viosa stringap@mail.ufv.br

Paulo Csar Stringheta

Dr. Prof. Titular da Universidade Estadual de Campinas- Unicamp

Paulo A. Bobbio

Uso de corantes naturais em alimentos processados

s antocianinas so pigmentos naturais bastante conhecidos pois determinam a colorao caracterstica de uma grande variedade de vegetais, incluindo queles usados na alimentao humana. Estes pigmentos tm sido, portanto, consumidos pelo ticos e/ou aromticos ligados ao acar na molcula de antocianina. As antocianidinas que ocorrem com maior freqncia como agliconas nas antocianinas naturais esto relacionadas na Figura 2. As antocianinas so caracterizadas estruturalmente por possuir um esqueleto de carbono C6-C3-C6 e, em funo

Figura 1. Plantas que contm partes pigmentadas: (a) Acalypha wilkesiana; (b) Callistephus chinensis Nees; (c) Rhododendron x simsii Panch; (d) Salvia Splendens Ker-Gawl; (e) Frutas e hortalias.
homem por incontveis geraes sem causar aparentemente qualquer efeito sobre a sade. Apesar disso, seu uso como aditivo natural est ainda bastante restrito em funo de limitao, como a disponibilidade de matriaprima produtora de pigmentos na quantidade e na qualidade requerida, a dificuldade na sua purificao, o poder corante reduzido quando comparado aos produtos sintticos e, principalmente, a baixa estabilidade apresentada pelas antocianinas. O conhecimento da estrutura dos pigmentos, a influncia de fatores como o pH, a temperatura, a presena de cidos, de acares, de ons metlicos e a presena de substncias chamadas de copigmentos, assumem importncia fundamental no estudo da estabilidade das antocianinas, visando seu possvel uso em alimentos. As recentes descobertas de antoci34 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Estrutura Qumica das Antocianinas As antocianinas esto includas no grupo de pigmentos de ocorrncia natural, responsveis pela colorao azul, vermelha, violeta e prpura de muitas espcies do reino vegetal (Figura 1). As antocianinas, substncias fenlicas, so glicosdeos de antocianidinas, polihidrxi derivados de on flavilium. As antocianidinas (angliconas) so substncias polihidroxiladas aparentemente ausentes nos tecidos de plantas. As diferenas entre as vrias antocianinas esto no nmero de grupos hidroxlicos, no grau de metilao destes grupos, na natureza e no nmero de acares ligados molcula e na posio dessas ligaes, bem como na natureza e no nmero de cidos alif-

disto, podem estar associadas com compostos flavonides no antocinicos. Apesar de possuir a mesma origem biossinttica de outros flavonides naturais, as antocianinas diferem destes por absorver fortemente na regio visvel do espectro. As antocianinas podem ser glicosadas por diferentes acares nas posies 3, 5 e 7, mas sempre ocorre a glicolisao na posio C-3. Glucose, arabinose, galactose e ramnose so os acares mais comuns ligados s antocianinas. Di e trissacardeos, formados pela combinao destes quatro monossacardeos, podem tambm glicosilar algumas antocianidinas (Timberlake & Bridle, 1975). Em muitos casos, os acares so acilados pelos cidos p-cumrico, cefeico, ferlico e sinpico (Mazza & Brouillard, 1987). Os grupos metoxila e hidroxila, alm da presena do acar e do cido,

Figura 2 Estruturas de Antocianinas de Ocorrncia Natural. (Adaptado de Timberlake, 1980 e Mazza & Broiullard, 1987) Sal de Flavilium 3 Pelargonidina (Pg) OH Cianidina (Cy) OH Peonidina (Pn) OH Delfinidina (Dp) OH Petunidina (Pt) OH Malvidina (Mv) OH Substituio (R) 5 6 7 3 OH H OH H OH H OH OH OH H OH OMe OH H OH OH OH H OH OMe OH H OH OMe

5 H H H OH OH OMe

chalcona C (Figura 4). Em condies cidas, h um equilbrio entre as antocianinas na forma AH+ e B, com a existncia de uma espcie transiente, a anidrobase A, que uma estrutura obtida pela desprotonao de ction flavilium. Solues contendo pigmentos com pH acima de 7,0, gradualmente mudam a colorao de tonalidade azul para amarela, como um resultado indireto da formao de chalcona C, via fisso do anel da anidrobase A (Hrazdina, 1974). Copigmentao Se considerarmos a colorao das antocianinas apenas em funo de pH, somos levados a crer que as plantas, ou parte delas, no deveriam ser coloridas, uma vez que, na maioria dos casos, o pH natural dos vegetais se encontra na faixa ligeiramente cida para neutra. Nesta regio de pH, a maioria das antocianinas se encontra na forma no colorida. Entretanto, o que se observa que as antocianinas se encontram sempre associadas s partes coloridas das plantas, indicando que estas antocianinas devem estar estabilizadas por fatores fsico-qumicos incomuns. A presena de compostos chamados copigmentos pode ser um destes fatores. Os flavonides no antocinicos, alcalides, aminocidos e nucleosdeos, entre outros, podem atuar como copigmentos (Tabela 1) e a prpria antocianina pode agir copigmentando outra antocianina. Segundo Goto & Kondo (1991), podem existir trs mecanismos bsicos de estabilizao de antocianinas, ou seja, copigmentao intramolecular, copigmentao intermolecular e auto associao, com o envolvimento de molculas de antocianidinas, de flavonides ou cidos aromticos e de acares (Figura 5). Quando a concentrao de antocianinas relativamente alta, as antocianinas podem atuar como copigmentos de si mesmo. As solues de antocianinas muito diludas apresentam uma intensificao no aumento da colorao, quando copigmentadas com rutina, mas este aumento na absorbncia paulatinamente reduzido medida que se aumenta a concentrao da antocianina. Segundo Scheffeldt & Hrazdina (1978), esta menor disponibiliBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 35

tm um efeito importante na cor e na estabilidade das antocianinas. A mesma antocianina poder ter diferentes cores, dependendo de pH, da concentrao da soluo e da presena de copigmentos, entre outros fatores. Com o aumento do nmero de hidroxilas, a colorao das antocianinas muda de rosa para azul. A presena de grupo metoxila no lugar de hidroxila, reverte a tendncia anterior (Mazza & Brouillard, 1987). A estabilidade da estrutura, determinante na colorao das antocianinas, influenciada pela presena de grupos acila ligados na posio C-3 dos acares. Antocianinas com dois ou mais grupos acila exibem excelente estabilidade numa ampla faixa de pH. Brouillard (1982) sugeriu a possibilidade de uma interao hidrofbica entre o anel de pirilium e os radicais aromticos dos grupos acila, o que protegeria o anel do ataque nucleoflico da gua, aumentando a estabilidade destas antocianinas (Figura 3). A formao de pontes de hidrognio, a insaturao adicional na posio C-2 e C-3 da estrutura do complexo formado, a fora eletrosttica e o efeito estrico podem estar relacionados com os mecanismos de associao que induzem a uma maior estabilidade, as antocianinas aciladas (Sheffeldt & Hrazdina, 1978; Willians & Hrazdina, 1979). Solues de antocianinas apresentam uma colorao vermelha mais intensa quando em pH abaixo de 3,0. Quando o pH aumentado

para a faixa de 4,0 a 5,0, a colorao vermelha tende a desaparecer. Aumentos adicionais de pH levam as antocianinas a apresentarem uma colorao azulada e estas, aps estocagem ou aquecimento, tornam-se amareladas. Em uma soluo aquosa cida, podem existir quatro formas estruturais de antocianinas em equilbrio entre si: a base quinoidal A, o cation flavilium AH+, a pseudobase ou carbinol B e a

Figura 3. Modelo de empilhamento entre dois resduos de cido cafeico com o ncleo pirilium

Figura 4. Transformaes estruturais de antocianinas

Tabela 1: Copigmentao de cianidina 3,5 - diglicosdeo (2x10-3M) a pH 3,32 COPIGMENTO max max A/nm % de (6 x 10-3M) (nm) (nm) a max incremento de A no max Sem copigmento 508 0,500 cidos cinmicos cido cafeico 515 7 0,780 56 cido ferlico 517 9 0,800 60 cido clorognico 513 5 0,875 75 Dihidrochalcona (+) Catequina 514 6 0,890 78 Flavona Apigenina-7-glucosdeo 517 9 0,840 68 Flavononas Hesperidina 512 13 1,095 119 Naringina 518 10 0,985 97 Flavonols Kaenferol 3-glucosdeo 530 22 1,693 239 Quercitina 3-ramnosdeo (quercitrina) 527 19 1,599 217 Quercitina 3-rutinosdeo (rutina) 528 20 1,643 228
Fonte: Osawa, 1982

Figura 5. Esquema representativo de trs tipos de copigmentao

Quadro 2 Valores de k(h-1) x102 e t (h) x102 para as solues de antocianinas (ACY) e antocianinas adicionadas de cido Tnico (AT) em ph 2.0, 3.0 e 4.0, sob efeito de luz PH 2,0 3,0 4,0
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AT + ACY k t k t k t 0,0931 7,44 0,3322 2,09 0,7673 0,90

ACY 0,4945 1,40 0,6632 1,04 1,1307 0,61

mentos. Os resduos aromticos de grupos acila se alinham com o anel pirilium do ction falvilium dificultando a adio da gua em C-2 e C-4 do anel (Broillard, 1981). Com dificuldade para a hidratao da molcula e o aparente impedimento das reaes de transferncia de prtons pelo processo de empilhamento das molculas, a estabilidade dos cromforos aumenta sensivelmente. Provavelmente as foras que atuam no processo de empilhamento sejam foras hidrofbicas. A copigmentao intramolecular somente ocorre quando o pigmento e o copigmento so partes de uma nica molcula, ou seja, quando o cromforo da antocianina e um resduo de cido cinmico (copigmento) esto covalentemente ligados ao mesmo resduo de acar (Figura 4). A copigmentao intramolecular mais eficiente na estabilizao das antocianinas que a copigmentao indade de antocianina termolecular, pois, sob o ponto de vista para a copigmenta- termodinmico, o efeito intramolecular o com a rutina, tem vantagem entrpica sobre o efeito pode ser atribuda intermolecular, uma vez que no neestabilizao do cti- cessrio as molculas, separadas inicialon flavilium por meio mente em soluo, se unirem (Brouida auto-associao llard, 1983). das antocianinas A estabilidade da cor de molculas quando presentes em aciladas causada por um fenmeno de concentraes mais copigmentao intramolecular, no qual elevadas. os resduos aromticos dobram-se e A copigmenta- interagem com o sistema do ncleo o intramolecular pirilium, protegendo as formas colori possivelmente res- das contra o ataque nucleoflico da gua ponsvel pela extraordinria estabili- (Figueiredo et al., 1995). dade dos cromforos de antocianinas A copigmentao intermolecular poliaciladas (Brouillard, 1981), como (Figura 7), alm do aumento da absorocorre com a zebrina (Figura 6), extra- o na regio do visvel, tambm pode da da Zebrina pendula (Goto & Kon- causar um deslocamento batocrmico do, 1991), cuja colorao exclusiva- no comprimento de onda de mxima mente produzida pelo pigmento em si, absoro (Timberlake, 1980). sem nenhuma interferncia de outros A complexao provavelmente doagentes como ons metlicos e copig- minada por foras de Van der Waals e efeitos hidrofbicos em meio aquoso, resultados do empilhamento - Quadro 3 Valores de k(h-1) +10-2 e entre a molcula de antot + 102(h) para as fraes purificadas de cianina e copigmento antocianinas em pH 2,0; 3,0 e 4,0 (Liao et al., 1992). A reao de copigmenPH Frao F1 Frao F2 Frao F3 tao provavelmente o principal mecanismo de 1,6202 2,0 k 0,0969 0,5040 interao molecular en0,43 t 7,15 1,37 volvido em variaes da 3,0737 3,0 k 0,4777 1,2085 cor e da adstringncia du0,23 t 1,45 0,57 rante a produo e enve2,7886 4,0 k 0,7727 1,805 lhecimento dos vinhos 0,25 t 0,90 0,38 (Mazza, 1995).

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A formao do complexo dependente da concentrao do copigmento e da concentrao da antocianina e, segundo Asen et al. (1972), medida que se aumenta a relao copigmento/ antocianina, aumenta a absorbncia da amostra e aumenta o deslocamento batocrmico no mx. Alm do deslocamento batocromico, a copigmentao resulta em um sensvel aumento na estabilidade das antocianinas. A Figura 8 mostra o esquema de uma copigmentao de flavocomelina e malvina a pH 6,0. O Quadro 2 mostra o efeito do cido tnico, copigmentando as antocianinas em diferentes pHs. Observa-se valores de t , em torno de 5 vezes maior para as antocianinas copigmentadas a pH 2.0 e que esta relao decresce medida que se eleva o pH de 2.0 para 4.0. Este fato comprova a importncia do pH na formao e na estabilidade do complexo antocinico-copigmento. Pelo Quadro 3 observa-se o comportamento de diferentes fraes de antocianinas extradas de inflorescncia de capim gordura (Mellinis minutiflora) em funo da presena de copigmentos naturais (flavonides). medida que se purificam as fraes de antocianinas, se reduz a presena de flavonides naturais do extrato e, consequentemente, se eleva a suscetibilidade das antocianinas aos efeitos de luz, indicando que a decomposio maior quanto maior o grau de purificao dos pigmentos, o que pode ser observado pelo valor de t a pH 2.0 de 7,15, 1,37 e 0,43, para as fraes F1, F2 e F3, respectivamente. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ASEN, S., STEWART, R.N., NORRIS, K.H. Co-pigmentation of anthocyanins in plant tissues and its effect on color. Phytochem., v.11, n.3, p.1139-44. BROUILLARD, R. Origin of the exceptional color stability of the zebrina anthocyanin. Phytochem., v.20, n.6, p.1453-6, 1981. BROUILLARD, R. Chemical struture of anthocyanins. In: MARKAKIS, P. (Ed.).

Figura 6 - Estrutura qumica de antocianina extrada de Zebrina pendula

Figura 7 Representao do complexo molecular entre a apigenidina e o cido 5sulfnico quercitina (Iacobucci & Sweeny, 1983)

Figura 8 - Esquema da copigmentao entre flavocomelina(flavona) e Malvina(antocianina). (Goto & Kondo, 1991)

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