Quim. Nova, Vol. 33, No.

7, 1585-1589, 2010

Lvia Botacini Favoretto, Juliana Maria Oliveira Souza, Rudy Bonfilio*, Roberta de Cssia Pimentel Azevedo e Magali Benjamim de Arajo Departamento de Farmcia, Universidade Federal de Alfenas, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700, 37130-000 Alfenas - MG, Brasil Recebido em 21/10/09; aceito em 22/3/10; publicado na web em 18/6/10

VALIDATION OF AN UV SPECTROPHOTOMETRIC METHOD FOR QUANTIFICATION OF FAMOTIDINE IN CAPSULES. This work describes the validation of a method for quantification of famotidine in capsules by UV spectrophotometry using as solvents buffer solution at pH 2.5 and buffer solution at pH 4.5. The results show that the method is practical, selective, accurate, precise and linear from 10.0 to 25.0 mg/mL of famotidine in both solvents. However, a variance analysis showed a lower mean percentage of famotidine when buffer at pH 2.5 is used. This effect was attributed to the instability of famotidine in acidic media. Therefore, the use of pH 4.5 buffer was considered suitable for analysis of famotidine in capsules. Keywords: famotidine; validation; UV spectrophotometry.

INTRODUO A famotidina (Figura 1) um antagonista competitivo do receptor H2 da histamina. Seu mecanismo de ao consiste na inibio da secreo cida gstrica, evitando que o seu excesso possa causar dor e mal estar. Este frmaco utilizado no tratamento de lceras ppticas e da hiperacidez gstrica.1-3 Os bloqueadores dos receptores H2, como a famotidina, reduzem eficazmente a secreo cida gstrica estimulada por alimentos, pentagastrina, insulina, cafena ou histamina. Esta diminuio est relacionada com a reduo tanto do contedo gstrico, quanto do volume do suco gstrico, e ocorre em indivduos sadios e com lceras ppticas. A famotidina bem absorvida por via oral e atinge nveis teraputicos em cerca de 1 h. eliminada principalmente por via renal, sendo tambm excretada no leite materno.1,4 So raros os efeitos indesejados e, em geral, so revertidos com a interrupo do tratamento.2 Pode ter sua ao diminuda por anticidos e sucralfato, porm pode diminuir a ao do cetoconazol e itraconazol. Tambm pode sofrer ou provocar aumento das reaes adversas com depressores da medula ssea.5

dade de frmaco liberado da forma farmacutica quantificada por espectrofotometria utilizando-se soluo de tampo fosfato pH 4,5.36 A forma farmacutica cpsulas contendo famotidina no se encontra inscrita, at o presente momento, em compndios oficiais e, dentre os medicamentos manipulados em farmcias, este frmaco tem se destacado para o atendimento de pacientes com transtornos gstricos. Tendo em vista o grande nmero de mtodos espectrofotomtricos utilizados na rotina de laboratrios de controle de qualidade devido facilidade, economia e rapidez dessa tcnica, o presente trabalho teve por objetivo validar um mtodo analtico por espectrofotometria no UV para quantificao de cpsulas de famotidina 40 mg, visando a aplicao em laboratrios de controle de qualidade de medicamentos. PARTE EXPERIMENTAL Materiais Produtos farmacuticos, padro de referncia e reagentes Cpsulas de famotidina 40 mg foram adquiridas de trs farmcias de manipulao e codificadas como amostras A, B e C, respectivamente. A amostra A contm como excipientes amido 99% e aerosil 1%. A amostra B contm os excipientes hidroxipropilmetilcelulose PA 10%, aerosil 1%, celulose microcristalina 20%, estearato de magnsio 1% e amido (quantidade suficiente para uma cpsula). A amostra C contm os excipientes celulose microcristalina 30%, aerosil 1% e amido (quantidade suficiente para uma cpsula). A famotidina Galena (Brasil), lote FTE0280404, validade em 03/09, foi utilizada como padro de referncia, apresentando teor declarado de 99,8%. Os reagentes empregados foram grau analtico (P.A.) e adquiridos da Vetec, (Brasil): acetato de sdio tri-hidratado; cido actico glacial; cido clordrico; cido fosfrico; fosfato de potssio monobsico; hidrxido de sdio e trietilamina. Os solventes metanol e acetonitrila foram grau UV/HPLC (Vetec, Brasil). Equipamentos Para execuo dos ensaios foram utilizados os seguintes equipamentos: espectrofotmetro UV/Vis Shimadzu (Japo), modelo UV1601 PC; balana analtica modelo 410 (Kern, Alemanha); medidor de pH modelo PA 200 (Marconi, Brasil); banho ultrassnico modelo

Figura 1. Estrutura qumica da famotidina

Na literatura encontram-se inmeros trabalhos referentes determinao de famotidina em formulaes farmacuticas. Dentre os mtodos descritos esto a eletroforese capilar com deteco no UV,6-9 potenciometria,10 voltametria,11 espectrofotometria,12-17 cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)18-31 e anlise por injeo em fluxo.32-34 As Farmacopeias Brasileira e Americana registram a monografia para famotidina na forma farmacutica comprimido com quantificao por CLAE.35,36 No entanto, para identificao do frmaco utilizada a varredura espectral com soluo de tampo fosfato pH 2,5,35 e, ainda, no ensaio de dissoluo para comprimidos a quanti*e-mail: rudybonfilio@yahoo.com.br

Nota Tcnica

VALIDAO DE MTODO ESPECTROFOTOMTRICO NA REGIO DO UV PARA QUANTIFICAO DE FAMOTIDINA EM CPSULAS

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USC 2800A (Unique, Brasil); sistema de purificao de gua TKA modelo LAB-UPW (Carl Zeiss Jena, Alemanha); sistema de filtrao a vcuo (Millipore, Brasil) e membrana PTFE de 0,45 mm e 13 mm de dimetro (Millipore, Brasil). Mtodo Espectro de absoro Varreduras espectrais, nas faixas de absoro entre 400 e 200 nm, foram realizadas para identificao do pico de mxima absoro da famotidina, a partir de solues estoque de famotidina padro, utilizando-se como solventes solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente, nas concentraes finais de 25 mg/mL. Validao do mtodo analtico A validao do mtodo analtico foi realizada de acordo com especificaes da literatura,37 da RE n 899 de 29/5/200338 e do ICH.39 Linearidade Para construo da curva analtica, preparou-se soluo do padro, na concentrao de 250 mg/mL, dissolvendo-se a famotidina em solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente. Alquotas de 1,0; 1,3; 1,8; 2,2 e 2,5 mL foram transferidas para bales volumtricos de 25 mL, obtendo-se solues com concentraes de 10,0; 13,0; 18,0; 22,0 e 25,0 mg/mL. Foram preparadas 5 rplicas de cada concentrao, para cada condio de pH, procedendo-se s leituras das solues em espectrofotmetro a 265 nm. A curva analtica foi construda correlacionando-se os valores mdios das absorvncias em funo da concentrao. Seletividade Foram preparadas solues do padro, da forma farmacutica cpsulas (amostras A, B e C) e dos excipientes (amostras A, B e C) nas concentraes finais de 18,0 mg/mL de famotidina, utilizandose solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente, como solventes. Foram realizadas varreduras espectrais (400-200 nm) do padro, das amostras e dos excipientes. Preciso A preciso do mtodo foi avaliada aos nveis de repetibilidade e de preciso intermediria. Na repetibilidade prepararam-se 12 rplicas das solues de famotidina padro para cada pH das solues de tampo fosfato (2,5 e 4,5) nas concentraes finais de 18,0 mg/ mL. Procederam-se s leituras das solues em espectrofotmetro a 265 nm, registrando-se os valores das absorvncias e efetuando-se o clculo da estimativa do desvio padro relativo entre as determinaes. A preciso intermediria foi avaliada atravs da comparao entre as leituras de uma mesma concentrao realizadas por analistas diferentes em dias diferentes. Foram preparadas 6 rplicas de solues de famotidina padro, em cada dia, utilizando-se solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente, nas concentraes finais de 18 mg/mL. Procederam-se s leituras das solues em espectrofotmetro a 265 nm, registrando-se os valores das absorvncias e efetuando-se o clculo da estimativa do desvio padro relativo das determinaes. Exatido A exatido do mtodo de anlise foi determinada pelo teste de adio e recuperao, onde solues da famotidina padro e da forma farmacutica cpsulas (amostras A, B e C) com concentraes finais de 250 mg/mL foram preparadas, utilizando-se solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente. Alquotas de 1,0 mL das solues das amostras a 250 mg/mL foram transferidas para 9 bales volumtricos de 25,0 mL. Posteriormente, foram adicionados em

triplicata 0,3; 0,8 e 1,2 mL da soluo contendo o padro a 250 mg/ mL. Dessa forma, foram obtidos adicionados contendo amostras na concentrao final de 10 mg/mL e padres nas concentraes de 3,0 (23,1% de padro); 8,0 (44,4% de padro) e 12,0 mg/mL (54,5% de padro). Portanto, a exatido foi verificada contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, trs concentraes: baixa, mdia e alta, com trs rplicas cada. Os valores de recuperao, expressos em porcentagem, foram determinados a partir das respostas analticas obtidas com os adicionados em funo da quantidade terica de padro adicionado. Limite de deteco (LD) O limite de deteco das amostras (A, B e C), sob as condies experimentais estabelecidas, foi determinado efetuando-se 20 leituras correspondentes ao branco (solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5). A estimativa do limite de deteco foi determinada atravs da seguinte equao: LD = (DP x 3)/IC em que DP o desvio padro relativo entre as leituras do branco e IC a inclinao da curva analtica. Limite de quantificao (LQ) O limite de quantificao das amostras (A, B e C) foi estabelecido a partir de 20 leituras do branco (solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5). A estimativa do limite de quantificao foi determinada atravs da seguinte equao: LQ = (DP x 10)/IC em que DP o desvio padro relativo entre as leituras do branco e IC a inclinao da curva analtica. Aplicao do mtodo s amostras de cpsulas Determinao de peso mdio Para determinao do peso mdio das cpsulas das amostras das farmcias A, B e C, respectivamente, seguiu-se o mtodo descrito na Farmacopeia Brasileira,35 pesando-se individualmente 20 cpsulas, removendo-se o contedo de cada uma e pesando-as novamente. O peso mdio foi calculado pela diferena dos valores individuais obtidos entre a cpsula cheia e a vazia. Doseamento das amostras A partir do peso mdio das amostras A, B e C, respectivamente, foram preparadas solues previamente filtradas, em quintuplicata de cada amostra e do padro, em triplicata, em solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente, nas concentraes finais de 18 mg/mL. As solues foram analisadas por espectrofotometria. Os valores de famotidina em cada amostra foram expressos em porcentagem da quantidade declarada e foram obtidos atravs da diviso da mdia das respostas das amostras (n=5) pela mdia das respostas do padro (n=3), multiplicado pelo valor declarado do padro (99,8%). Uniformidade de contedo das amostras O contedo de 10 cpsulas de cada amostra (A, B e C) foi transferido individualmente para bales volumtricos de 100 mL, utilizando-se solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente. Alquotas de 2,25 mL das amostras, previamente filtradas, foram transferidas para bales volumtricos de 50 mL, obtendo-se solues com concentraes finais de 18 mg/mL. Foram preparadas solues padro em triplicata, na concentrao final de 18 mg/mL.

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Validao de mtodo espectrofotomtrico na regio do UV

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As solues foram analisadas por espectrofotometria. Os valores de famotidina em cada cpsula foram expressos em porcentagem da quantidade declarada e foram obtidos atravs da diviso da resposta de cada cpsula pela mdia das respostas do padro (n=3), multiplicado pelo valor declarado do padro (99,8%). RESULTADOS E DISCUSSO Na monografia da 4 ed. da Farmacopeia Brasileira, para a forma farmacutica comprimido,35 descrito um ensaio para identificao de famotidina por espectrofotometria no UV, utilizando-se soluo de tampo fosfato pH 2,5 como solvente. Na monografia da 30 ed. da Farmacopeia Americana, o ensaio de dissoluo com quantificao por espectrofotometria descrito utilizando-se como solvente uma soluo de tampo fosfato pH 4,5.36 Varreduras espectrais entre 400 e 200 nm foram realizadas para identificao do pico de mxima absorbncia da famotidina, a partir de solues padro, utilizando-se como solventes solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente, nas concentraes finais de 25 mg/mL, comprovando um mximo de absoro do frmaco no comprimento de onda relatado (l = 265 nm). Foram construdas curvas analticas para famotidina, utilizando-se como solventes solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, respectivamente. Os resultados foram avaliados por meio da regresso linear, pelo mtodo dos mnimos quadrados, em que a equao obtida, quando da utilizao de soluo de tampo fosfato pH 2,5, foi y = 0,0307x + 0,0164 e o coeficiente de correlao linear, r, igual a 0,9998. Quando da utilizao de soluo de tampo fosfato pH 4,5 a equao obtida foi y = 0,0308x + 0,0109 e seu coeficiente de correlao linear, r, igual a 0,9999, com estimativa de desvio padro relativo entre as determinaes inferior a 2%, em ambos os valores de pH, demonstrando haver correlao linear entre as concentraes de famotidina e as absorbncias lidas.38,39 Os excipientes presentes nas formulaes das amostras A, B e C, respectivamente, no apresentaram interferncia na quantificao da famotidina, visto que no absorveram significativamente na regio espectral prxima a 265 nm, com os solventes utilizados, mostrando a seletividade do mtodo (Figuras 2 a 7).

Figura 3. Varredura espectral da amostra B, excipiente B e padro, em soluo tampo fosfato pH 2,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL

Figura 4. Varredura espectral da amostra C, excipiente C e padro, em soluo tampo fosfato pH 2,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL

Figura 5. Varredura espectral da amostra A, excipiente A e padro, em soluo tampo fosfato pH 4,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL

Figura 2. Varredura espectral da amostra A, excipiente A e padro, em soluo tampo fosfato pH 2,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL

A preciso do mtodo, sob as condies previamente fixadas (Tabelas 1 e 2), foi determinada pela estimativa do desvio padro relativo. Os valores mdios das estimativas de desvio padro relativo foram de 0,74% (repetibilidade) e 0,80% (intermediria) quando da utilizao de soluo tampo pH 2,5 como solvente e de 0,35% (repetibilidade) e 0,43% (intermediria) quando utilizada soluo tampo pH 4,5 como solvente. So aceitveis valores de desvio padro relativo igual ou abaixo de 5%. 37 Alm disso, a preciso pde ser confirmada nos ensaios de exatido demonstrados nas Tabelas 1 e 2 e no ensaio de

Figura 6. Varredura espectral da amostra B, excipiente B e padro, em soluo tampo fosfato pH 4,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL

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Tabela 2. Resultados obtidos na determinao dos parmetros de validao do mtodo para famotidina, utilizando-se como solvente soluo de tampo fosfato pH 4,5 a 265 nm Parmetros Condies Nveis de concentrao (mg/mL) Repetibilidade 1 Srie 18 2 Srie 18 Preciso intermediria Figura 7. Varredura espectral da amostra C, excipiente C e padro, em soluo tampo fosfato pH 4,5 nas concentraes finais de 18 mg/mL Exatido 1 dia 2 dia Amostra A 18 18 13,0 18,0 22,0 13,0 18,0 22,0 13,0 18,0 22,0 Mdias das absorbncias 0,568 0,570 0,569 0,575 0,426 0,591 0,737 0,384 0,532 0,685 0,391 0,550 0,706 DPR (%) Percentual mdio de recuperao (%)

0,18 (n=6) 0,49 (n=6) 0,29 (n=6) 0,57 (n=6) 1,21 (n=3) 0,10 (n=3) 0,41 (n=3) 0,15 (n=3) 0,38 (n=3) 0,08 (n=3) 0,00 (n=3) 0,28 (n=3) 0,08 (n=3)

100,09

doseamento demonstrado na Tabela 3, onde as estimativas de desvio padro relativo entre as leituras dos adicionados e das amostras foram inferiores a 5% em todos os casos. O mtodo espectrofotomtrico desenvolvido demonstrou boa exatido, que foi constatada pelo teste de recuperao. Valores mdios entre 98,0 e 102,0% para as amostras A, B e C, respectivamente, para solues de tampo pH 2,5 e 4,5 indicaram exatido adequada (Tabelas 1 e 2).37 O mtodo demonstrou sensibilidade para os dois solventes utilizados. Os limites de deteco e de quantificao foram, respectivamente, de 0,094 e 0,314 mg/mL quando da utilizao de soluo de tampo fosfato pH 2,5 como solvente e 0,043 e 0,145 mg/mL quando utilizada soluo de tampo fosfato pH 4,5. A diferena nos valores de LD e LQ para os diferentes valores de pH pode ser justificada por oscilaes do equipamento, j que a sensibilidade praticamente a mesma para ambos. Os valores de teor apresentados no ensaio de doseamento das amostras A, B e C, respectivamente, atenderam aos requisitos da legislao,38,39 que estabelece limites entre 90,0 e 110, 0% da quantidade declarada para o produto acabado (Tabela 3). Foi realizado o teste de uniformidade de contedo das cpsulas de cada amostra (Tabela 4) e verificou-se que as amostras dos produtos A, B e C apresentaram valores aceitveis, utilizando-se como solventes
Tabela 1. Resultados obtidos na determinao dos parmetros de validao do mtodo para famotidina, utilizando como solvente soluo de tampo fosfato pH 2,5 a 265 nm Parmetros Condies Nveis de concentrao (mg/mL) Repetitividade 1 Srie 18 2 Srie 18 Preciso intermediria Exatido 1 dia 2 dia Amostra A 18 18 13,0 18,0 22,0 13,0 18,0 22,0 13,0 18,0 22,0 Mdias das absorbncias 0,540 0,541 0,568 0,550 0,407 0,569 0,731 0,402 0,547 0,697 0,385 0,512 0,655 DPR (%) Percentual mdio de recuperao (%)

Amostra B

101,84

Amostra C

98,46

Tabela 3. Valores obtidos no doseamento de famotidina das amostras A, B e C, respectivamente, por espectrofotometria no UV, utilizando-se como solventes solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5 a 265 nm Padro pH do solvente 2,5 4,5 Mdias das absorbncias 0,505 0,540 Teor(%) DPR (%) Amostra A 2,5 4,5 Amostra B 2,5 4,5 Amostra C 2,5 4,5

0,491 0,545 0,480 0,537 0,482 0,544 96,99 100,67 94,82 99,08 95,26 100,44 1,24 1,63 1,85 3,22 3,20 4,37

Tabela 4. Valores obtidos no teste de uniformidade de contedo das cpsulas (amostras A, B e C), utilizando-se como solventes solues de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5 Cpsulas Teor amostra A (%) Teor Amostra B (%) pH 2,5 pH 4,5 pH 2,5 pH 4,5 1 95,10 99,01 94,75 92,50 2 100,84 97,75 96,23 90,20 3 101,40 99,38 90,70 90,73 4 103,99 94,67 92,91 91,08 5 103,80 99,01 92,54 90,55 6 101,21 102,81 96,41 92,32 7 93,81 97,38 94,20 90,02 8 99,54 101,37 90,88 90,20 9 95,84 97,75 92,17 93,91 10 103,80 101,00 95,49 90,90 DPR (%) 3,78 2,35 2,24 1,39 Teor amostra C (%) pH 2,5 pH 4,5 98,99 91,73 86,04 87,63 91,96 88,52 86,78 89,24 88,81 86,56 87,33 87,10 86,78 89,24 98,99 83,89 93,07 88,70 86,78 87,81 5,55 2,32

1,04 (n=6) 0,43 (n=6) 0,81 (n=6) 0,80 (n=6) 0,57 (n=3) 0,00 (n=3) 0,16 (n=3) 0,29 (n=3) 0,28 (n=3) 0,25 (n=3) 1,29 (n=3) 0,41 (n=3) 0,55 (n=3)

98,79

Amostra B

101,61

Amostra C

101,88

tampo fosfato pH 2,5 e 4,5. A uniformidade de contedo do produto acabado deve estar entre 85,0 e 115,0% e a estimativa de desvio padro relativo entre as determinaes deve ser inferior a 6,0%.35 O mtodo espectrofotomtrico utilizando como solventes tampo fosfato pH 2,5 e 4,5 foi aplicado forma farmacutica cpsula das amostras A, B e C, respectivamente. Os resultados de teor de cada amostra, expressos utilizando cada soluo tampo, foram comparados estatisticamente. Para anlise estatstica dos dados, utilizou-se esquema fatorial 3 x 2 x 5 (3 farmcias, 2 solventes e 5 repeties). A comparao foi realizada atravs do teste de Tukey ao nvel de

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Validao de mtodo espectrofotomtrico na regio do UV

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significncia de 5%. Comparando-se as amostras de famotidina das farmcias avaliadas verificou-se que no houve diferena estatisticamente significativa (p>0,05) entre elas. Comparando-se o uso dos solventes, verificou-se que houve diferena estatisticamente significativa entre as mdias percentuais de teor de famotidina, sendo que o mtodo espectrofotomtrico que utiliza tampo fosfato a pH 2,5 apresentou mdias de teores de famotidina estatisticamente inferiores aos valores resultantes da aplicao do mtodo espectrofotomtrico utilizando tampo fosfato pH 4,5 como solvente, segundo o teste de Tukey (p<0,05). Esse resultado foi atribudo instabilidade do frmaco em condies de pH cido. Relatos da literatura mostram que a estabilidade da famotidina fortemente dependente da temperatura e do pH em soluo aquosa e independente da exposio luz, sendo que sua estabilidade mxima verificada em pHs prximos a 4,0 (comparado ao pH prximo a 2,0).40 CONCLUSO Nas condies descritas, o mtodo espectrofotomtrico para determinao quantitativa de famotidina, utilizando como solvente soluo de tampo fosfato pH 2,5 e 4,5, mostrou estar de acordo com os parmetros de validao exigidos pela legislao vigente. Apresentou resultados satisfatrios de linearidade nas faixas de 10,0 a 25,0 mg/mL, preciso, exatido e seletividade. Porm, a anlise estatstica revelou uma menor mdia percentual de famotidina expressa quando o mtodo empregado utilizando-se o tampo pH 2,5, em relao ao uso do tampo pH 4,5 como solvente. Esse resultado foi atribudo forte instabilidade da famotidina em pH cido. O mtodo espectrofotomtrico utilizando tampo pH 4,5 como solvente considerado, portanto, adequado para anlises de rotina do setor de controle de qualidade, visto ser de baixo custo, rpido, fcil de executar. AGRADECIMENTOS Ao Centro de Equivalncia Farmacutica do Ncleo Controle de Qualidade (CEFAR-NCQ/UNIFAL-MG) pelo suporte financeiro. REFERNCIAS
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