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Histrico da PCR
Kornberg (1960) Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento desta enzima possibilitou o desenvolvimento da sntese in vitro de cadeias de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a sntese de oligonucleotdeos tornaram-se rotina nos laboratrios de pesquisa; Karl Mullis (1983) Tcnica de PCR polymerase chain reaction possibilita a amplificao in vitro de cidos nuclicos. O advento da PCR acelerou os estudos de genomas de vrios organismos, pois possibilitou a clonagem e o sequenciamento de DNA. Karl Mullis (1987) Patenteou a tcnica e vendeu para a empresa Hoffmann-La Roche em 1991.
Sntese enzimtica in vitro de cpias de DNA a partir da seqncia alvo; A especificidade dada pelo uso de primers (iniciadores) especficos para o gene ou regio do DNA de interesse; A utilizao de dois primers delimitam o alvo e a repetio dos ciclos da PCR d origem a bilhes de cpias do alvo.
Thermus
Etapas da PCR
1) Desnaturao abertura da dupla fita do DNA (94 C/100 C) 2) Anelamento (hibridizao) dos primers em T C mais baixa 3) Reao de polimerizao (sntese) da fita complementar pela Taq DNA polimerase Repetio por 30 a 40 ciclos animao
Variaes da PCR
RT-PCR Nested-PCR PCR Multiplex RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Real time PCR ( PCR em tempo real)
RT PCR
RT PCR
Taq-Man
Marcadores moleculares
Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um segmento especfico de DNA (expresso ou no).
Quando o comportamento do marcador segue as leis de herana de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma populao segregante), ele pode adicionalmente ser definido como um marcador gentico.
A molcula de DNA sofre alteraes (mutaes). As mutaes so mais toleradas quando acontecem em regies nocodificantes, e as mutaes tornam-se estveis, sendo transmitidas aos seus descentes. Como muito grande a variao no nmero e no tipo de mutaes estveis do DNA fenmeno conhecido como polimorfismo gentico possvel identificar uma pessoa com base no seu padro de polimorfismo. Para reconhecer os locos (stios) onde ocorrem essas mutaes, h diferentes tcnicas.
marcadores cromossoma
Vantagens: - No objeto de influncias ambientais; - Potencialmente ilimitado em nmero; Desvantagem: Maior desvantagem a necessidade de tcnicas e equipamentos mais complexos.
Marcadores moleculares
Hibridao RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Minissatlites VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Amplificao de DNA (Tcnica de PCR) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) Microssatlites SSR (Simple Sequence Repeats) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
RFLP examina diferena em tamanho de fragmentos de restrio de DNA especficos Polimorfismo deriva de mutao pontual, insero, deleo Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular
Polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA com enzimas de restrio e observado pela hibridizao de sondas marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao luminescncia.
Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio que as seqncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas.
Metodologia de RFLP
1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separao dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferncia de fragmentos de DNA para filtro
Metodologia de RFLP
4. Visualizao dos fragmentos de DNA
bandas analisadas para alelos e/ou presena/ausncia diferenas em padro de bandas reflete diferenas genticas
DNA
Separao em gel
Eletroforese
Interpretao de resultados
1 1 2 3 4 2 3 4 5 6
Utiliza um nico primer ao invs de um par de primers. O primer nico tem seqncia arbitrria, e portanto sua seqncia alvo desconhecida. Uma caracterstica fundamental dos marcadores RAPD o fato deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominncia do ponto de vista da interpretao relativa entre gentipo e fentipo de um indivduo.
Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam comportamento "dominante", existe a possibilidade de se amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos os alelos de um loco.
Caractersticas do RAPD:
Obteno
de
"fingerprinters'
(impresses
digitais)
Anlise estrutural e diversidade gentica em populaes de melhoramento e bancos de germoplasma. Estabelecimento de relacionamentos filogenticos entre diferentes espcies. Construo de mapas genticos de alta cobertura genmica econmico. e a localizao de genes de interesse
600 pb -
J-20
- escada 100 pb - E. acervulina - E. tenella - E. maxima - E. praecox - E. mitis - E. brunetti - E. necatrix - Conrrole
Caractersticas do VNTR:
Seqncias repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do genoma. So constitudas por blocos cujo nmero de repetitivas varivel, gerando polimorfismos. Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locus hipervarivel so conhecidas como microssatlites. Unidades de 5 a cerca de 100 pb so denominadas minissatlites. unidades
Caractersticas do VNTR:
So observados atravs de digestes do DNA genmico seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homlogas s regies do minissatlite. Obtm-se um padro de mltiplas bandas devido ao carter multilocus. Os padres de mltiplas bandas constituem os chamados DNA fingerprints e permitem discriminar indivduos e estabelecer graus de parentesco e consanginidade.
Caractersticas do VNTR:
So obtidos atravs de PCR de loci especficos. Cada "ilha" microssatlite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG etc.) constitui um loco gentico altamente varivel, multiallico, de grande contedo informativo. A anlise de vrios loci permite estabelecer relaes de paternidade e identificao personalizada, atravs dos alelos encontrados nos indivduos. No requerem Southern blots. A anlise consiste no PCR de vrios loci, eletroforese em gel e interpretao.
Modelos
Eletroforese em gel Anlise de casos moleculares Seminrios