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用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片%
洪 龙! 廖 玮# 魏 芳# 赵新生 # 朱圣庚 !
5 ! 北京大学生命科学学院E #
分子动态与稳态结构国家重点实验室%
北京大学化学与分子工程学院化学生物学系 % 北京 !&&"2! I
#&&01&21&2 收到初稿% #&&01&213& 收到修改稿 $ 联系人4 赵新生 5 61789:4 ;<8,=>?@AB$ .CB$ *DE F.:4 &!&1G#2(!2#2E H8=4 &!&1G#2(!2&" I E
朱圣庚 5 61789:4 ;<B>J? @AB$ .CB$ *DE F.:4 &!&1G#2((0(3E H8=4 &!&1G#2(!(#G I $ %
国家自然科学基金 5 #KK23&&3% #&333&!& I 和国家重点基础
研究发展规划 5 L!KKK&2(3&( I资助项目
2+% !’ 赵新生等:用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片 !!"#
位 $ % 偶联前& 向各噬菌体抗体溶液中加入 !’( )体 噬菌体覆盖的硅片& 用 ?Y< 对其表面形貌进行
积浓度 $ 活化试剂 ) !’’ **+,・- /01 )碳二亚胺 $
.!
了纳米尺度的表征 % 扫描采用单晶硅针尖& @FLL;GR
和 !’ **+,・- . ! 234 ) !5 乙酰琥珀碱 $ $ % 模式& 以减少由于针尖与表面接触而导致的形貌的
) 6 $ 噬菌体抗体芯片的制备7 噬菌体抗体芯片 破坏 % 整个图像的尺寸为 6!*% 图 ! 显示表面固定
所用硅基底均按已发表方法处理 % 将表面覆盖有
89 :
噬菌体的形貌 & 我们发现共价连接的噬菌体能保持
自然氧化硅的硅片先腐蚀成 4; . 3 表面& 然后与 其正常生理条件下的细丝状形态& 噬菌体呈致密排
!’5 十一碳烯酸甲酯在紫外光引发下反应& 使硅片 布& 并具有基本相同的取向& 这样的固定有利于保
表面形成酯基终止的致密有机膜 % 最后通过酸化& 持噬菌体的生物活性 %
形成羧基终止的有机覆盖膜 % !" ! 激光共聚焦扫描系统检测芯片与不同细胞
将处理好的硅片置于手动点样仪)<;=>+1?4@A>& 全蛋白结合的荧光信号
4B4 =+% ,CD& EA>*FGH $ 上& 通过接触式点样& 蘸取已 芯片表面荧光成像的工作由灵敏度最高的激
活化的重组噬菌体抗体溶液到羧基终止的芯片表 光 共 聚 焦 扫 描 仪 完 成 & 扫 描 的 空 间 分 辨 率 为 !’
面& I J 偶联过夜 % 用原子力显微镜 2FG+ KKKF ) 0K !*& 扫描的结果由扫描软件自动合成出图 6 所示
=+*LFGH& M4? $ 观察噬菌体固定在芯片上的表面 的荧光点阵图像& 斑点的亮度与该点实际的荧光强
形貌 % 检测前使用 ’% !( NO4@ )含 ’% !( 体积吐温 度成正比& 所以该图像可以给出非常直观的点阵图
6’ 的 NO4 $清洗硅片 % 像的对比 %
) # $ 细胞蛋白质的提取及标记7 用密度梯度离 !" ; 检测分析芯片与不同细胞全蛋白结合的荧
心法分离健康人体外周血中的淋巴细胞& 用尖嘴滴 光信号
管吸出位于界面的淋巴细胞 % 3A-F 细胞按常规方 为进行精确的数据比较& 我们分别对图 6 中代
法在 P</< Q !’( )体积浓度 $ 胎牛血清的培养基 表不同噬菌体结合蛋白强度的荧光圆点用芯片统
中 培 养 与 传 代 % 胰蛋白酶消化后& #’’ R 离心 !’ 计软件 EAGAN;V N>+ S% ’ 进行了统计& 统计所得平均
*;G 收集细胞% 值以及标准偏差绘成图 #%
使用 !( )体积浓度 $ @>;C+G5!’’ 悬浮细胞& 经
9’’ R 离心 !’ *;G& 收集上清液 % 将上清液转移到 ; 讨 论
新的离心管& S’’’ R 离心 !’ *;G% 同样将上清液转 与传统的研究方法相比& 蛋白质芯片具有较
移到新的离心管& "’’’ R 离心 !’ *;G% 再将上清液 多优点 7 它可以对细胞蛋白质样品实现高通量分
!’’’’ R 离心 9’ *;G& 获得的上清液即为细胞的全 析Z 可以检测出样品中微量蛋白质的存在& 检测水
蛋白溶液 % 平可达纳克级Z 操作简单& 易分析& 可以立即获得结
按照试剂盒的说明对全蛋白进行荧光标记& 并
与游离的荧光染料分离 %
) I $ 分析芯片对不同细胞全蛋白的检测7 用 6(
NO4< )含 6( 体积脱脂奶粉的 NO4 $ 将偶联有噬菌
体抗体的蛋白质芯片在 #T J 封闭 ! U% 同时用等体
积 的 I( NO4< 封 闭 1H# 标 记 的 全 蛋 白 & 后 用
’% !( NO4@ 洗涤芯片三次 % 将芯片置于细胞培养
板中& 用 1H# 标记的全蛋白没过芯片& #T J 反应 6
U% 用 ’% !( NO4@ 洗涤芯片三次 %
通过激光共聚焦扫描系统 ) 4=FG?>>FH /VL>AWW&
NA>X;G5A,*A> KG=%& M4? $检测荧光信号 %
图# 噬菌体抗体偶联在硅片表面的原子力
! 结 果 显微镜照片
!" # 利用原子力显微镜 $%&’ (观察噬菌体与硅 &)*" # %&’ )+,*- ./ 01,*- )++.2)3)4-5
片的偶联 6)3)7.8 69:/,7-
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图8 细胞全蛋白与分析芯片的反应图谱
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图! 噬菌体抗体芯片与不同细胞全蛋白反应的结果
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T97 !2 赵新生等:用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片 !!"#
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